通过HSV介导的嵌合构建体转基因表达研究小鼠GPCR异源寡聚体的行为功能

摘要

本文介绍了如何将病毒载体注射到小鼠前额叶皮层，以检测需要G蛋白偶联受体异源多聚体形成的动物行为学实验。

摘要

5-HT_2A 与 mGlu2 之间的异源受体复合物已被证实参与了精神分裂症小鼠模型中某些行为表型的调控^1,2。因此，研究影响精神分裂症相关行为的 5-HT_2A 与 mGlu2 之间相互作用的结构细节，是一种强有力的转化研究工具。如先前研究所示，小鼠的头部抽动反应（HTR）可由致幻药物诱导，而在 5-HT_2A 基因敲除（KO）小鼠中，这种行为反应则完全消失^3,4。此外，通过仅在皮层中条件性表达 5-HT_2A 受体的研究发现，皮层锥体神经元上依赖于 5-HT_2A 受体的信号通路足以介导致幻药物引发的头部抽动行为³。最后，研究还表明，在 mGlu2-KO 小鼠中，由致幻剂 DOI 和麦角酸二乙胺（LSD）诱导的头部抽动行为反应显著减弱⁵。这些发现提示，mGlu2 至少部分地对于 LSD 类药物诱导的依赖于 5-HT_2A 受体的精神病样行为效应是必需的。然而，这并未提供证据表明 5-HT_2A-mGlu2 受体复合物本身是否为该行为表型所必需。为回答这一问题，研究人员使用单纯疱疹病毒（HSV）载体，在 mGlu2-KO 小鼠的前额叶皮层中分别表达 mGlu2 或 mGlu2ΔTM4N（一种不能与 5-HT_2A 形成受体复合物的 mGlu2/mGlu3 嵌合体），以检验这种 G 蛋白偶联受体异源复合物是否为 LSD 类药物诱导的行为效应所必需⁶。

引言

LSD、裸盖菇素和麦司卡林等致幻剂会引起人类意识、认知和情绪的显著改变^7-9。通过基因或药理学手段抑制5-羟色胺5-HT_2A受体信号传导，可显著减弱啮齿类动物模型^3,10和人类¹¹对致幻剂的行为反应。尽管致幻剂也可结合其他受体亚型⁸，但5-HT_2A受体被认为是这些化学物质产生独特行为活性所必需的。

II型代谢型谷氨酸受体（即，mGlu2 和 mGlu3）在致幻剂的分子作用机制及其在精神病发生中的核心作用方面已受到广泛关注¹²此前已证明，不表达mGlu2蛋白的小鼠（mGlu2-KO小鼠）对致幻剂的细胞和行为效应不敏感。⁵。也有研究提出，5-HT_2A 并且mGlu2受体在活细胞中形成一种特异性的异源复合物，通过该复合物，5-羟色胺和谷氨酸配体可调节G蛋白偶联的模式 ^1,2.

从结构上看，mGlu2的跨膜区（TM）4和5在与5-HT_2A受体形成异源复合物的过程中起着关键作用⁵。此外，进一步研究表明，位于mGlu2跨膜区4胞内末端的三个氨基酸残基对于在活细胞中形成5-HT_2A-mGlu2受体异源复合物是必需的⁶

方案

注意：所有动物繁育和护理操作均按照西奈山伊坎医学院机构动物护理和使用委员会 (IACUC) 的规定进行。操作过程中务必使用无菌手套。 

1. 药物与病毒的制备

1. 药物配制
   1. 配制15.0 ml的氯胺酮/赛拉嗪麻醉剂：将1.35 ml浓度为100 mg/ml的氯胺酮和0.75 ml浓度为20 mg/ml的赛拉嗪溶解于12.9 ml的0.9%生理盐水中，充分混匀溶液。
2. 病毒制备
   1. 按照先前描述的标准方案⁶，将mGlu2和mGlu2ΔTM4N构建体克隆至双顺反子单纯疱疹病毒（HSV）载体中。按先前所述方法^6,13,14包装病毒颗粒。在mGlu2中将残基Ala-677^4.40、Ala-681^4.44和Ala685^4.48替换为mGlu3中的Ser686^4.40、Phe690^4.44和Gly-694^4.48（HA-mGlu2ΔTM4N）的方法此前已有描述⁶。
      注：先前已证明，嵌合构建体HA-mGlu2ΔTM4N可在质膜上表达，并保留G蛋白依赖性信号传导功能⁶。
   2. 不使用时将病毒....

结果

先前的研究结果表明，致幻剂能可靠且显著地诱发小鼠头部抽动行为反应，而在5-HT_2A-基因敲除小鼠³此外，已有研究表明，致幻性5-HT激动剂引发的头部抽动反应_2A mGlu2基因敲除小鼠中，激动剂DOI和LSD的作用显著降低⁵然而，尽管先前的研究结果令人信服地表明5-HT_2A mGlu2 以异源复合物形式组装 体外 在转染细胞中^1,2,15，这种结构排列在活体小鼠中是否具有相应功能仍尚未明确。要充分理解5-HT_2A-mGlu2受体异源复合物在致幻性5-HT诱导的精神活性样效应中的作用_2A 受体激动剂，于mGlu2基因敲除小鼠的额叶皮层表达mGlu2或mGlu2ΔTM4N，以检测该操作是否调控行为。

小鼠接受了表达绿色荧光蛋白（GFP）和mGlu2或mGlu2ΔTM.......

讨论

结合此前在mGlu2基因敲除小鼠中的研究结果⁵，使用不形成5-HT的mGlu2及mGlu2/mGlu3嵌合体构建体所得结果_2A-mGlu2受体复合物在培养细胞中的研究表明，5-HT_2A 小鼠前额叶皮层中-mGlu2异源受体复合物是LSD样致幻性5-HT诱导头部抽动行为所必需的_2A 受体激动剂。该方法的一个局限性在于，其无法在天然组织的亚细胞水平上测量分子间的近距离相互作用。此外，还需注意多个关键环节。由于小鼠被注射了HSV病毒载体，实验操作的时间窗口为注射后2至4天。应在首次注射后不超过4天内，通过脑组织切片的免疫荧光染色验证病毒载体的定位与表达情况。对于注射位点不准确或未表达病毒载体的小鼠，应从实验数据中剔除，因其不表达mGlu2或mGlu2ΔTM4N。立体定位手术后的护理也至关重要，若头部伤口封闭不当，可能导致感染，进而对实验结果造成干扰 体内 实验和免疫荧光染色。最后，在立体定位注射后进行任何行为学实验范式（敞箱实验、交替t检验， 等等）只要在注射病毒颗粒后2-4周内使用即可。同样，坐标位置和表达情况应通过免.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
mGlu2 双顺反子单纯疱疹病毒（HSV）载体	MIT Core		将 mGlu2 和 mGlu2ΔTM4N 亚克隆至双顺反子 HSV-GFP 病毒载体 p1005+ HSV 中，该载体在 CMV 启动子控制下表达 GFP。病毒颗粒由麻省理工学院麦戈文研究所病毒核心设施（MIT）制备。欲了解更多信息，请联系负责人 Rachael Neve 博士（rneve@mit.edu）
mGlu2ΔTM4N 双顺反子单纯疱疹病毒（HSV）载体	MIT Core		将 mGlu2 和 mGlu2ΔTM4N 亚克隆至双顺反子 HSV-GFP 病毒载体 p1005+ HSV 中，该载体在 CMV 启动子控制下表达 GFP。病毒颗粒由麻省理工学院麦戈文研究所病毒核心设施（MIT）制备。欲了解更多信息，请联系负责人 Rachael Neve 博士（rneve@mit.edu）
GFP 双顺反子单纯疱疹病毒（HSV）载体	MIT Core		将 mGlu2 和 mGlu2ΔTM4N 亚克隆至双顺反子 HSV-GFP 病毒载体 p1005+ HSV 中，该载体在 CMV 启动子控制下表达 GFP。病毒颗粒由麻省理工学院麦戈文研究所病毒核心设施（MIT）制备。欲了解更多信息，请联系负责人 Rachael Neve 博士（rneve@mit.edu）
赛拉嗪	Lloyd	目录号 4811-20ml，NADA 编号 #139-236，NDC 编码：61311-481-10	1.35 ml 的氯胺酮（100 mg/ml）与 0.75 ml 的赛拉嗪（20 mg/ml）溶于 12.0 ml 的 0.9% 生理盐水中
氯胺酮	Vedco	KetaVed-10ml，NADA 编号 #200-029，NDC 编码：50989-161-06	1.35 ml 的氯胺酮（100 mg/ml）与 0.75 ml 的赛拉嗪（20 mg/ml）溶于 12.0 ml 的 0.9% 生理盐水中
眼用凝胶	Fisher Scientific	NC0550805
颅骨夹	Fisher Scientific	NC9268369
Feather 外科手术刀片	Fisher Scientific	NC9032736
过氧化氢	Fisher Scientific	19-898-919
哈密尔顿注射器	Fisher Scientific	14815203
Hamilton™ 小接头可拆卸针头（33 Ga）	Fisher Scientific	14816206
无线微型钻机	Fisher Scientific	NC9089241
Dermabond 皮肤粘合剂	Fisher Scientific	NC0690470
(±)-1-(2,5-二甲氧基-4-碘苯基)-2-氨基丙烷盐酸盐（DOI）	Sigma-Aldrich	42203-78-1	溶于 0.9% 生理盐水中，配制成 2.0 mg/kg 的浓度