研究小鼠GPCR异聚的行为功能嵌合构造的HSV介导的转基因表达

Summary

本文介绍如何注入病毒载体插入鼠标额叶皮质测试需要GPCR异形成行为检测。

Abstract

5-HT_2A 和 mGlu2 之间的异聚受体复合物与精神病小鼠模型中的一些行为表型有关^1,2。 因此，研究 5-HT_2A 和 mGlu2 之间相互作用影响精神分裂症相关行为的结构细节是一种强大的转化工具。如前所述，小鼠的头部抽搐反应 （HTR） 是由致幻药物引起的，而这种行为反应在 5-HT_2A 敲除 （KO） 小鼠中不存在^3,4。 此外，通过仅在皮层中有条件地表达 5-HT_2A 受体，证明皮层锥体神经元上的 5-HT_2A 受体依赖性信号通路足以在致幻药物下引发头部抽搐行为³。 最后，已经表明，由 mGlu2-KO 小鼠致幻剂 DOI 和麦角酸二乙胺 （LSD） 诱导的头部抽搐行为反应显着降低⁵。 这些发现表明，mGlu2 至少部分是 LSD 样药物诱导的 5-HT_2A 受体依赖性精神病样行为效应所必需的。然而，这并不能证明 5-HT 2A-mGlu2 受体复合物是否是这种行为表型所必需的。为了解决这个问题，使用单纯疱疹病毒 （HSV） 构建体在 mGlu2-KO 小鼠的额叶皮层中表达 mGlu2 或 mGlu2ΔTM4N（mGlu2/mGlu3 嵌合构建体，不形成 5-HT_2A-mGlu2 受体复合物）来检查这种 GPCR 异聚复合物是否需要 LSD 样药物诱导的行为效应⁶。

Introduction

致幻剂，如LSD，裸盖菇碱和麦司卡林引起人的意识，认知和情感^7-9显著的变化。无论是由遗传或药物的方法羟色胺5-HT _2A受体信号的失活会导致明显减弱，以致幻剂的行为反应在两种啮齿类动物模型^3,10和人类^11。虽然致幻剂结合其他受体亚型^8，对5-HT _2A受体被认为是必要的这些化学物质的独特的行为活动。

II组代谢型谷氨酸受体（ 即 ，mGlu2和mGlu3）一直是相当大的注意关于致幻剂的分子机制和其底层的精神病¹²整体作用的目标。以前，已经显示，与mGlu2蛋白（mGlu2-KO小鼠）中不表达小鼠是不敏感的HAL的细胞和行为效应lucinogens ^5。还已经提出，对5-HT _2A和mGlu2受体形成一个特定的异聚复合物，通过该血清素和谷氨酸的配体调节在活细胞中^的1,2- G蛋白偶联的图案。

在结构上，跨膜结构域4和mGlu2的5异的形成中发挥基础性作用与5-HT _2A受体^5。此外，进一步的研究表明，三个残基位于mGlu2的TM4的细胞内端是必要的，以形成在活细胞⁶对5-HT _2A -mGlu2受....

Protocol

注:动物养殖和关心所有程序均按照西奈山伊坎医学院的机构动物护理和使用委员会（IACUC）的规定进行。一定要在整个过程中使用无菌手套。

1.药物和病毒制剂

1. 药物研制
   1. 通过溶解1.35毫升100mg / ml的氯胺酮和0.75毫升20毫克/毫升甲苯噻嗪12.9毫升0.9％盐水溶液制备15.0毫升氯胺酮/赛拉嗪麻醉剂。彻底混合的解决方案。
2. 病毒制剂
   1. 克隆mGlu2和mGlu2ΔTM4N构造成双顺反子单纯疱疹病毒（HSV）载体以下先前描述⁶标准协议。如前所述^6,13,14包装病毒颗粒。残留的替代丙氨酸- 677 ^4.40，丙氨酸- 681 ^4.44和^4.48 Ala685在mGlu2为Ser686 ^4.40，pH值E690 ^4.44和甘氨酸-694在^4.48 mGlu3（HA-mGlu2ΔTM4N）先前已经^6中所述。
      注意:这是以前表明，嵌合构建的HA-mGlu2ΔTM4N在含有完整G蛋白依赖的信号⁶质膜表达。
   2. 在不使用时在商店病毒载体-80℃。在冰上解冻病毒载体，然后分装到10微升等分试样。对于手术过程中，保持在冰上。....

Results

以前的研究结果表明，该头部抽搐鼠行为反应被可靠和鲁棒由致幻剂引起，并且它在5-HT _2A -KO小鼠³是不存在。此外，已经表明由致幻5-HT _2A激动剂DOI和LSD引起头部抽搐反应在mGlu2-KO小鼠⁵被显著降低。然而，虽然以前的研究结果令人信服地证明，5-HT _2A和mGlu2被组装成在转染细胞^1,2,15 体外异聚复合物，此结构布置是否表现为这样在活小鼠中仍未解决。要充分认识在mGlu2-KO小鼠额叶皮质致幻5-HT _2A受体激动剂，无论是mGlu2或mGlu2ΔTM4N表达引起的精神样作用的5-HT _2A受体-mGlu2的heterocomplex的作用，研究这是否MANIPulation调节行为。

小鼠接受双顺反子的HSV帧内额叶皮质注射表达单独绿色.......

Discussion

连同mGlu2-KO小鼠⁵以前的研究结果，与mGlu2和mGlu2 / mGlu3嵌合构建的结果不形成在培养的细胞对5-HT _2A -mGlu2受体复合表明对5-HT _2A -mGlu2在异聚受体复合需要鼠标额叶皮层由LSD样致幻5-HT _2A受体激动剂诱导头部抽动行为。这种方法的一个限制是，它不会在天然组织亚细胞水平测量接近分子的接近。此外，也有应注意各种临界点。因为将小鼠用HSV病毒载体注射，即要执行的实验的时间范围是2 - 注射后4天。病毒载体的位置和表达应与初次注射后不超过4天切片脑的免疫荧光染色进行验证。小鼠中的坐标不匹配或不表达病毒载体应该可以从实验数据中排除，因为它们不表达mGlu2或mGlu2ΔTM4N。关心立体定向手术后也至关重要，因为磁头伤口不当闭合可导致感染可引起在体内实验和免疫荧光染色这两个问题。注射病毒颗粒后4 -最后，立体定向注射任何行为范式（开放场交替t检验， 等 ）后，可以，只要它是2内使用。此外，协调和表达应该通过免疫荧光确认。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
mGlu2 双电子单纯疱疹病毒 （HSV） 载体	将 MIT Core		mGlu2 和 mGlu2DTM4N 亚克隆到表达 GFP 的双顺反子 HSV-GFP 病毒载体 p1005+ HSV 中。病毒颗粒由麦戈文研究所 （MIT） 的病毒核心设施生产。欲了解更多信息，请联系主任 Rachael Neve 博士 （rneve@mit.edu）
mGlu2ΔTM4N 双电子单纯疱疹病毒 （HSV） 载体	将 MIT Core		mGlu2 和 mGlu2DTM4N 亚克隆到表达 GFP 的双顺反子 HSV-GFP 病毒载体 p1005+ HSV 中。病毒颗粒由麦戈文研究所 （MIT） 的病毒核心设施生产。欲了解更多信息，请联系主任 Rachael Neve 博士 （rneve@mit.edu GFP
双电子单纯疱疹病毒 （HSV） 载体	将 MIT Core		mGlu2 和 mGlu2DTM4N 亚克隆到表达 GFP 的双顺反子 HSV-GFP 病毒载体 p1005+ HSV 中。病毒颗粒由麦戈文研究所 （MIT） 的病毒核心设施生产。欲了解更多信息，请联系主任 Rachael Neve 博士 （rneve@mit.edu）
Xylazine	劳埃德	清单编号 4811-20ml，NADA #139-236，NDC 代码：61311-481-10	1.35 ml 氯胺酮 （100 mg/ml） + 0.75 ml 甲苯噻嗪 （20 mg/ml） 稀释在 12.0 ml 0.9% 盐水溶液
氯胺酮中	Vedco	KetaVed-10ml，NADA #200-029，NDC 代码：50989-161-06	将 1.35 ml 氯胺酮 （100 mg/ml） + 0.75 ml 甲苯噻嗪 （20 mg/ml） 稀释在 12.0 ml 0.9% 盐水溶液
眼凝胶	Fisher Scientific	NC0550805
Burret 夹	Fisher Scientific	NC9268369
Feather 手术刀片	Fisher Scientific	NC9032736
氢过氧化物	费舍尔科学	19-898-919
Hamilton 注射器	Fisher Scientific	14815203
Hamilton™小针座可拆卸针头 （33 Ga）	Fisher Scientific	14816206
无线微钻	Fisher Scientific	NC9089241
Dermabond 皮肤粘合剂	Fisher Scientific	NC0690470
（±）-1-（2,5-二甲氧基-4-碘苯基）-2-氨基丙烷盐酸盐（DOI）	Sigma-Aldrich	42203-78-1	于0.9%盐水溶液中，浓度为2.0 mg/kg