方法文章

内源性的免疫荧光分析及外源着丝粒着丝粒蛋白

DOI：

10.3791/53732

⸱

2016年3月3日

 , 
1Center for Childhood Cancer and Blood Diseases, Nationwide Children's Hospital

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在这里，我们报告了检测人类细胞中内源性和外源性着丝粒-着丝粒蛋白的方案，并通过使用固定（多聚甲醛、丙酮或甲醇固定）的间接免疫荧光染色来定量着丝粒-着丝粒的这些蛋白质水平。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

"着丝粒"和"着丝粒"是指在细胞分裂过程中染色体与纺锤体结合的部位。在细胞周期中直接观察着丝粒-着丝粒蛋白仍然是研究这些蛋白质机制的基本工具。荧光显微镜中的先进成像方法提供了着丝粒-着丝粒成分的卓越分辨率，并允许直接观察着丝粒和着丝粒的特定分子成分。此外，使用特异性抗体的间接免疫荧光 （IIF） 染色方法对于这些观察至关重要。然而，尽管有许多关于 IIF 方案的报道，但很少有人详细讨论特定着丝粒-着丝粒蛋白的问题。1-4 在这里，我们报告了通过使用多聚甲醛固定和 IIF 染色对人细胞中内源性着丝粒-着丝粒蛋白进行染色的优化方案。此外，我们报道了检测经丙酮或甲醇固定的人细胞中 Flag 标记的外源性 CENP-A 蛋白的方案。这些方法可用于检测和定量内源性着丝粒-着丝粒蛋白和 Flag 标记的 CENP-A 蛋白，包括人类细胞中的蛋白。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

"着丝粒"被经典定义为遗传学抑制减数分裂重组的区域和以后确认为有丝分裂染色体的主收缩，其中有丝分裂期间起着准确的染色体分离中起重要作用。 "着丝粒"被描述为结合到微管在着丝粒的表面上，所揭示的电子显微镜的多层结构; "着丝粒"后来被定义为在本地化有丝分裂的着丝粒的大分子复合物。尽管脊椎动物中的着丝粒DNA序列的戏剧性发散，动粒的结构和组成是高度保守的。需要有丝分裂过程中染色体分离友们纺锤体微管和动粒之间的动态互动，在着丝粒动粒功能导致非整倍体，从而癌症的缺陷。

在大多数真核生物着丝粒没有定义的DNA序列，而是由包括171 bp的α卫星DNA分子的重复DNA白斑样的大阵列（0.3-5兆）的。除了 ​​在芽殖酵母，着丝粒的身份不是由DNA序列，但由包含组蛋白H3变体CENH3特殊核小体存在下实现（着丝粒蛋白A [CENP-A〕在人类中）。5 CENP-A的核小体定位于哺乳动物着丝粒7并绑定到171 bp的α卫星DNA分子的内板。主动要求着丝粒CENP-含A-核直接组成着丝粒​​相关网络（CCAN）和动粒蛋白的募集，它们共同规范染色体通过纺锤体检查点的有丝分裂纺锤体和随后的周期进程的附件。

另外，在上述证据的光，CENP-A已被提出是着丝粒8的后生标记;然而，这个过程由CENP-A结合我n要着丝粒DNA并负责此掺入的因素尚未充分表征。短丝粒靶向域（CATD）驻留在组蛋白折叠CENP-A的区域和替换H3与CATD相应区域的是足以直接H3到着丝粒。9几项研究建议的翻译后的功能角色修改CENP-A 12-16（PTM）;然而，CENP-A的招募这些翻译后修饰的至着丝粒的分子机制尚未阐明。我们以前报道，CUL4A-RBX1-COPS8 E3连接酶的活性需要CENP-A到着丝粒CENP-A K124泛素化和本地化。17

着丝粒蛋白的发现和鉴定，导致对染色体分离的新见解。18 100多名动粒的成分已通过各种途径在脊椎动物细胞中鉴定。19,20的下在荧光显微镜的着丝点是如何组装和功能也来自各着丝粒动粒蛋白和蛋白质网络的细胞功能的细胞内的表征地位。19直接可视化和先进的成像方法提供着丝粒着丝粒组件非凡分辨率及允许直接观察着丝粒和着丝粒的特定的分子组件。此外，使用特异性抗体间接免疫荧光的方法（IIF）染色对这些观察结果是至关重要的。然而，尽管关于IIF协议，很少在着丝粒特异性着丝粒蛋白质的细节问题的讨论的许多报告。1-4。因此，显影和报告IIF染色和定量IIF测定方法具体分析每个着丝粒动粒蛋白是极其重要的。在IIF染色，应该与染色方案进行，以避免所感兴趣的蛋白的损失或单元的其余部分。然而，定影破坏抗原位点偶尔，以及不同的抗体-抗原组合与一种固定剂不佳工作，但很好地与另一种，21和固定剂的选择在很大程度上取决于所感兴趣的蛋白（多个）。因此，不同的固定剂的方法是在着丝粒动粒蛋白IIF染色至关重要。

间接免疫荧光（IIF）染色和测定以解​​决内源性着丝粒动粒蛋白质，包括CENP-A和Flag标记的外源性​​CENP-A蛋白，以及在人类细胞中这些蛋白质的定量本地化这里优化方法已被开发出来。这些方法可以应用到在其它物种的着丝粒，动粒蛋白质的分析。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

1.细胞培养和转染

  1. 放的盖玻璃（22毫米×22毫米）在6孔聚苯乙烯板。可选的外套盖玻璃，聚L-赖氨酸，0.1％w / v的，水（见材料/设备清单），以保证有丝分裂细胞上按照以下步骤玻璃盖:
    注意:最佳条件，必须对每个细胞系和应用来确定。
    1. 用聚-L-赖氨酸，0.1％重量/体积，在无菌条件下涂层培养表面在水（0.4mL毫升/孔的6孔聚苯乙烯板）。轻轻摇动，以确保即使在培养表面涂层。
    2. 5分钟后，吸删除解决方案，并彻底冲洗用无菌组织培养级别的水面。
    3. 引入细胞和中干前至少2小时。
  2. 种子HeLa细胞17或HeLa细胞的Tet-Off细胞上放置在6孔聚苯乙烯板的盖玻璃（22毫米×22毫米）17,22。检查细胞密度为5.4×10 5每孔。培养细胞在具有10％FBS和1％青霉素 - 链霉素的高葡萄糖DMEM中。
    注意:为了达到最佳效果，凭经验确定播种用的细胞密度。
  3. 孵育在37℃下将细胞在5％的CO 2的气氛中18小时。
    注意:在HeLa细胞的Tet-Off细胞的情况下，外源基因的转录是在不存在诱导剂（ 即 ，四环素/多西环素），因此培养细胞无四环素/多西环素的活性，并与pTRM4表达载体（ 表2瞬时转），其转录由TRE启动子调控（见下文）。
  4. 播种，转染细胞18小时后，如下所示:
    1. 通过混合1.5微升的siRNA寡使溶液A（20μM的退火的库存; 表1）和/或2.0微克质粒（ 表2）在50微升减少血清的培养基（参见材料/设备的列表），并在室温孵育5分钟。
      注意:在此分析中，CA-UTR的siRNA（5'3和'非编码区的siRNA的混合物; 表1）共转染在协议3和4（见讨论）一起使用。
    2. 通过混合0.75微升转染试剂I（参见材料/设备的列表）在50μl降低血清培养基，并在室温孵育5分钟使B液。
      注:可选的步骤是增加了1.0微升转染试剂II（见材料/设备的列表）。
    3. 混合溶液A和B一起，并在室温孵育15分钟。
    4. 用PBS洗涤培养细胞一次，然后加入500μl血清培养基减少到6孔聚苯乙烯板的各孔中。添加溶液A和B（ 即 ，RNA和/或DNA -脂质复合物）的混合物中直接向每个单独的井的。
      注意:终浓度为3.3微克/毫升（质粒）; 50纳米（siRNA）的。
    5. 孵育在37℃下将细胞在5％的CO 2的气氛中4.5小时。介质更改为高糖DMEM机智H 10％FBS和1％青霉素 - 链霉素。
    6. 孵育在37℃下将细胞在5％的CO 2的气氛中对转染后48-72小时。
      注意:对于最佳的结果，固定之前的潜伏期为细胞生长，必须根据经验来确定，和蛋白质消耗和/或表达，必须通过Western印迹分析来确认（参见协议6）。
    7. 如果有丝分裂细胞分析很感兴趣，固定前添加紫杉醇（10纳米），以培养细胞24小时，或固定前添加TN16（0.5μM）到培养细胞2.5小时。

2.细胞固定和免疫荧光染色检测内源性着丝粒着丝粒蛋白（多聚甲醛固定）

  1. 固定剂，缓冲液和试剂的制备。
    1. 新鲜制备50毫升的在PBS，pH 7.4的4％低聚甲醛溶液中。
      1. 加40毫升1-×PBS中至玻璃烧杯中在搅拌板在通风橱。热而stirring至约60℃。 2克低聚甲醛粉末添加到加热的PBS中。
      2. 通过在总加入1ml的1N NaOH提高缓慢的pH值，因为粉末不会立即溶解。
        注:加入NaOH后的溶液清除。
      3. 一旦多聚甲醛溶解，冷却，滤出液。
      4. 调节pH值用1N HCl至pH 7.4，并将该溶液用1×PBS的体积至50ml。
        注意:溶液的等分试样可以冷冻或贮存在2-8℃下，只要1周。溶液应冰冷或储存在4℃下直到它被使用。
    2. 制备50ml的缓冲液KB1，它由10毫摩尔Tris盐酸，pH为7.5的; 150毫摩尔NaCl; 0.5％BSA;和0.5％的Triton X-100。
      注:BSA应新鲜添加。
      注:该缓冲区KB系列是基于以前的报告中描述的缓冲KB 1,2,4。
    3. 制备50ml的缓冲液KB2，它由10毫摩尔Tris-HCl中的，pH为7.5; 150毫摩尔NaCl;和0.5％的BSA。
      注:BSA应新鲜添加。
    4. 制备1ml含有DAPI（50毫微克/毫升）缓冲KB3的。
    5. 制备100毫升的安装平台，它由1毫克/毫升对苯二胺的; 10％的PBS，90％甘油。
      1. 调整为1×PBS中，以9.8的pH值用1N NaOH，在溶液中溶解对苯二胺，然后添加甘油。
      2. 商店在-80℃1ml等份。避光。
  2. 在48-72小时后转染（见方案1），进行细胞固定除去通过抽吸培养基中。冲洗细胞一次，用PBS。应用PBS到培养孔的侧面，以避免干扰所述细胞的表面上。
    注:细胞固定的最佳时间点，必须根据经验来确定。
  3. 固定在PBS中的4％多聚甲醛将细胞在4℃下30分钟。冲洗细胞两次用缓冲液KB2充分地除去残留的4％多聚甲醛。
  4. Permeabi丽泽在缓冲器KB1样品在室温30分钟。用缓冲液KB2冲洗细胞一次，并在室温添加缓冲KB2 5分钟以非特异性结合的附加块的站点。
    注:缓冲KB1也显著有助于阻止。
  5. 从使用镊子6孔聚苯乙烯板卸下的盖玻璃（22毫米×22毫米）。使用疏水屏障笔（见材料/设备清单），画一个浅绿色的方形或圆形周围形成每个盖玻璃样品疏水性障碍。请勿触摸或太靠近细胞与疏水屏障笔。安装了新的6孔聚苯乙烯板玻璃盖。
  6. 稀释的初级抗体对丝粒或动粒蛋白（第1稀释比:100到1:200;也参见材料/设备的列表）和任一抗CENP-B抗体（第1稀释比:400）或抗着丝点抗体（ACA）（1稀释比例:2,000）作为缓冲KB2着丝粒的位置标记。
    注意:为了获得最佳效果，最终concentra在该溶液中的一级抗体的灰必须凭经验确定。
  7. 应用稀释的初级抗体的足够的体积（ 约 30微升）沉浸细胞样品。在37℃下孵育细胞样品1小时。冲洗细胞用缓冲KB2 3次。
  8. 用缓冲KB2，稀荧光团缀合的第二抗体（第1稀释比:200:100:1）针对每个第一抗体。
    注意:为了获得最佳效果，二次抗体在此溶液中的最终浓度必须根据经验来确定。
  9. 施加足够的体积将稀释的次级抗体（ 约 30微升在盖玻璃的下降）到浸入细胞样品。在37℃下孵育细胞样品1小时。冲洗细胞5次缓冲KB2期间的30分钟（次6分钟洗涤）。
    注意:为了达到最佳效果（ 即对细胞的损失最小），最佳的洗涤条件必须确定empiricaLLY。
  10. 应用含有DAPI（50毫微克/毫升），以浸没细胞样品缓冲KB3的足够体积。在室温下孵育5分钟的细胞样本。冲洗细胞用缓冲KB2 1-2次。
  11. 装入包含细胞样品到微滑动玻璃盖。
    1. 放置在微滑动的中心安装介质的压降。
    2. 从细胞样品中移除液体，并使用手或镊子，在微滑动的中心样本位置。避免气泡产生。
    3. 用纸巾去除多余的封固剂。

3.细胞C端的固定和免疫荧光染色标志标记CENP-A蛋白（丙酮固定）

  1. 制备
    1. 准备冰冷的75％丙酮。
    2. 新鲜制备50ml含0.5％脱脂乳和0.5％BSA的PBS（pH 7.4）中的。
    3. 新鲜制备50ml含0.1％脱脂乳和0.1％BSA的PBS（pH 7.4）中的。
    4. 制备1ml的PBS（pH 7.4）中含有DAPI（50-100纳克/毫升）。
    5. 在2.1.5中描述制备100ml的安装介质。
  2. 在48-72小时后转染（见方案1），进行细胞固定除去通过抽吸培养基中。冲洗细胞一次，用PBS。应用PBS到培养井的侧面，以避免干扰所述细胞的表面上。
    注:细胞固定的最佳时间点，必须根据经验来确定。
  3. 固定在冰冷的75％丙酮的细胞，并孵育细胞在-20℃下10分钟。干细胞在通风橱中在室温下30-60分钟的护罩玻璃。
    注意:为了达到最佳效果，需要为固定和细胞干燥的时间长度，必须根据经验来确定。
  4. 使用疏水屏障笔（见材料/设备清单），画一个浅绿色的方形或圆形周围形成每个盖玻璃样品疏水性障碍。请勿触摸或太靠近细胞与疏水屏障笔。
  5. 块nonspecIFIC加入含有的PBS 0.5％脱脂乳和0.5％的BSA在室温下5分钟的结合在细胞上的网站。
  6. 使用含有0.1％脱脂乳和0.1％BSA的PBS稀释的抗Flag抗体（1:1000稀释比），或者抗CENP-B抗体（第1稀释比:200）或ACA（1:2,000稀释比），为着丝粒的位置标记。
    注意:为了获得最佳效果，第一抗体在此溶液中的最终浓度必须根据经验来确定。
  7. 应用稀释的初级抗体的足够的体积（ 约 30微升）沉浸细胞样品。在37℃下孵育细胞样品1小时。冲洗细胞5次用封闭缓冲期间的30分钟。
    注:细胞可以用PBS漂洗。对于最佳结果（ 即 ，为了避免细胞的损失），最佳的洗涤条件，必须根据经验来确定。
  8. 稀释荧光团缀合的第二抗体（第1稀释比:200:100:1）针对在含有0.1％脱脂乳和0.1％BSA的PBS中的每个主抗体。
    注意:为了获得最佳效果，二次抗体在此溶液中的最终浓度必须根据经验来确定。
  9. 应用稀释的二级抗体的足量（ 约 30微升）沉浸细胞样品。在37℃下孵育细胞样品1小时。冲洗细胞2次，用含有0.1％脱脂乳和0.1％BSA的PBS。
    注意:单独的PBS也可用于洗涤细胞。
  10. 适用的PBS足够体积含有DAPI（50-100纳克/毫升），以浸没细胞样本。在室温下孵育5分钟的细胞样本。冲洗细胞1-2次，用PBS。
  11. 安装在2.11中所述含细胞样品到微滑动玻璃盖。

4.细胞N端的固定和免疫荧光染色标志标记CENP-A蛋白（甲醇固定）

  1. 制备
    1. 准备冰冷的甲醇。
    2. 制备的TBS含有4％山羊血清（pH 7.4）中。
    3. 制备1毫升含TBS DAPI（50-100毫微克/毫升）（pH值7.4）。
    4. 在2.1.5中描述制备100ml的安装介质。
  2. 在48-72小时后转染（见方案1），进行细胞固定除去通过抽吸培养基中。冲洗细胞一次用TBS。适用的TBS到培养孔的一侧，以避免扰乱细胞的表面上。
    注:细胞固定的最佳时间点，必须根据经验来确定。
  3. 固定在冰冷的甲醇中的细胞，并孵育细胞在-20℃下6分钟。冲洗细胞两次，用TBS充分除去残留的甲醇。
  4. 使用疏水屏障笔（见材料/设备清单），画一个浅绿色的方形或圆形创建一个围绕每个玻璃罩样品疏水性障碍。请勿触摸或太靠近细胞与疏水屏障笔。
  5. 块上的CEL非特异性结合位点用含4％山羊血清加入TBS LS。在室温下孵育10分钟。
  6. 稀释的抗Flag抗体（1:1000稀释）和任一抗CENP-B抗体（第1稀释比:200）:在含有4％山羊血清的TBS（2,000稀释比1）作为着丝粒的位置标记或ACA 。
    注意:为了获得最佳效果，第一抗体在此溶液中的最终浓度必须根据经验来确定。
  7. 应用稀释的初级抗体的足够的体积（ 约 30微升）沉浸细胞样品。在37℃下孵育细胞样品1小时。冲洗细胞5次用封闭缓冲期间的30分钟。对于最佳结果（ 即 ，细胞的损失最小），最佳的洗涤条件，必须根据经验来确定。
  8. 稀释荧光团缀合的第二抗体（第1稀释比:200:100:1）在含有4％山羊血清的TBS针对每个初级抗体。
    注意:为了达到最佳效果，国际泳联在该溶液中的二级抗体l的浓度必须根据经验来确定。
  9. 应用稀释的二级抗体的足量（ 约 30微升）沉浸细胞样品。在37℃下孵育细胞样品1小时。冲洗细胞3次，用封闭缓冲液。
  10. 应用含有DAPI（50-100纳克/毫升）浸入细胞样品的TBS的足够体积。在室温下孵育5分钟的细胞样本。冲洗细胞1-2次用TBS。
  11. 装入包含在2.11中所述的细胞样品到所述微滑动玻璃盖。

5.免疫荧光图像观察，采集，定量和分析

  1. 通过配有一个63X和100X油浸镜头，外部紧凑的光源，和一个数字CCD照相机的机动荧光显微镜观察细胞的样品。
  2. 进行图像采集和处理，包括反褶积，使用软件A，或软件B1和B2（见材料/设备的列表）。请参阅补充编码文件（5.2.1）中的软件A.对于软件B1和B2使用的所有命令使用的所有命令，请参阅（5.2.2）的补充代码文件。
  3. 用前述方法23-25 ​​量化着丝粒动粒蛋白的信号（ 例如 ，基本维持在着丝粒CENP-A的信号）具有以下稍作修改:
    1. 在着丝粒动粒蛋白的选择区域内，以及背景如下:
      1. 有丝分裂细胞:（着丝粒着丝粒区）选择区域与用DAPI染色体重叠;染色体外，但在相同的单细胞内（ 即细胞质区）（背景区域）和面积。
      2. 相间细胞:（着丝粒着丝粒区）选择区域与染色用DAPI重叠; （背景区）和区外的染色质，但相同的单细胞内（即细胞内区域）。
        注:另见补充编码文件（5.2.1.4.3）或（5.2.2.6.4）的区域选择与软件A或软件B2分别。
    2. 使用软件A或B.对于此任务，使用下面的公式量化的着丝粒剩余信号的百分比:
      在着丝粒动粒剩余着丝粒动粒蛋白的信号
      figure-protocol-1
      其中s是所选择的区域，这是由ACA或CENP-B染色证实的信号亮度; b是背景信号的亮度; R 样品是用于siRNA（S）处理的细胞的参照ACA或CENP-B信号;和右 Ctrl是参考ACA或CENP-B信号为吕克的siRNA转染的细胞。
      注意:在此分析，以前的报告中描述CENP-B信号被用作参考CUL4A信号和RBX1。
    3. 使用这种计算Excel文件复制后从上述信号定量软件粘贴的原始数据。另见补充编码文件:（5.2.1.4）和（5.2.2.6）了解详细信息。计算的一个例子示于表3中 。
  4. 分析至少20个细胞，以消除在染色和图像采集每个测量电平变化。可以选择使用剩余的着丝粒着丝粒信号的"平均值"为每一个分析单元，以这些价值观不同的着丝粒着丝粒蛋白中进行比较。

总蛋白的6印迹分析

  1. 悬浮细胞在变性缓冲液A（20mM的Tris-盐酸，pH为7.4; 50毫摩尔NaCl; 0.5％的Nonidet P-40的0.5％脱氧胆酸盐; 0.5％SDS; 1mM EDTA中;以及完整无EDTA蛋白酶抑制剂混合物）， 26受该悬浮液以声波处理和冻融过程，并测量蛋白质浓度如下:
    1. 对于超声处理过程中，加50微升缓冲液A从在48-72小时后转染6孔聚苯乙烯板的两井采集的细胞（参见方案1）。操作装有干扰物喇叭和微尖端超声波仪（参见材料/设备的列表），每一个样品合计15秒的间歇脉冲持续时间（占空比50％）。
    2. 对于冻融过程中，冷冻用液氮细胞，并在室温解冻细胞。
    3. 使用商业蛋白质检测试剂I或II测量蛋白浓度（见材料/设备的列表）。
      注意:裂解物在与任一试剂I或II的蛋白质浓度的测定1:10的比例稀释。在该稀释中，存在于缓冲液A中的SDS示出了在该测定很少或没有干扰。
  2. 混合含有20-30微克总蛋白的裂解物与2×或4×SDS-PAGE上样缓冲液。27煮沸的样品5分钟，然后加载它们在12.0％-15.0％变性电泳SDS-聚丙烯酰胺凝胶。
  3. 通过使用先前描述的Western印迹方法转移通过SDS-PAGE分离到PVDF膜上的蛋白质。17,24,27-31
    1. 方框用5％无脂奶在膜上的非特异性结合位点在1×PBS中，然后孵育稀释的初级抗体的溶液的膜在RT 1小时。请参阅各主要抗体的详细信息（ 例如，稀释比例）材料/设备清单。
    2. 用PBS-T缓冲液洗涤该膜3-4次（每3到5分钟孵育振荡）后（1×PBS和0.1％吐温-20），孵育在近红外（IR）的混合物，该膜荧光染料缀合的二级抗体（第1稀释比:20,000），DyLight缀合的第二抗体（1稀释比:20,000），和/或辣根过氧化物酶（HRP）缀合的二级抗体（在PBS-T稀释; diluti上的比例为1:在RT 1小时10,000）。请参阅各二级抗体的详细信息（ 例如，稀释比例）材料/设备清单。
  4. 洗膜3次，然后扫描该膜，以分析与红外成像系统和/或用于免疫印迹检测的化学发光成像的蛋白质（参见材料/设备的列表）。
    1. 对于使用红外成像系统，请参阅（6.4.1）的补充代码文件。
    2. 对于使用化学发光成像仪，见（6.4.2）的补充代码文件。使用超灵敏化学发光增强（ECL）底物（见材料/设备清单）这个系统。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

内源性CENP-A的免疫荧光分析支持CUL4A-E3连接酶需要CENP-A的本地化着丝粒的假说
我们最近的研究表明，CUL4A-RBX1-COPS8 E3连接酶的活性需要在CENP-A和CENP-A至着丝粒的本地化赖氨酸124（K124）的泛素化17最初，相间着丝复合体（ICEN）被隔离抗CENP-A:原生染色质免疫沉淀，32-34，它一直推测，一些ICEN蛋白质可能在定位CENP-A至着丝粒的作用。因此，进行siRNA敲除实验以筛选诱导CENP-A的离域在着丝粒17，其不存在表达的蛋白质（数据未显示）:异步生长HeLa细胞与滞蛋白4A（CUL4A）siRNA或RBX1的siRNA转染的倍所需的最佳蛋白质消耗（48小时r代表CUL4A和72小时的RBX1）。与CUL4A的siRNA转染的细胞显示CENP-A的在着丝粒一个显著离域（ 图1A-C）。如在图2G所示，在CUL4A的siRNA转染细胞的总...

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

近年来，许多研究已经在着丝粒动粒生物学为固定细胞开发了不同的定量显微镜测定。42进展通常需要的蛋白质的着丝粒特异性或特异性着丝点功能的理解，其中亚细胞时空调控反映不断变化的功能在细胞周期的这些蛋白质。因此，这里我们开发IIF染色和定量的IIF分析特异性分析内源性和外源性CENP-A蛋白的相对水平，这可以适用不同处理的样品中的方法。目前，我们实现了内源性CENP-I，CENP-H，KNL1，Hec1和Ska1在这项研究中采用方案2的成功IIF染色（见Niikura 等人 24和 ​​数据未显示;材料/设备清单抗体的信息） 。在将来，可以应用同样的方法来量化不同着丝粒动粒蛋白的水平（均endog源性和Flag标记的外源蛋白）选择特异性抗体，但是，我们的IIF方法不包括在活细胞中或在期间整个细胞周期的特定单电池这些蛋白质的检测。因为这些过程需要细胞被固定并在单独的盖玻片处理，我们引入以相当比较不同样品之间的信号和提高了测定的准确度为正常化的目的的参考信号（ 例如 ，ACA或CENP-B）。因为ACA涉及内源性和/或外源CENP-A的信号，CENP-B作为用于标准化...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者宣称，他们没有竞争的经济利益。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这项工作是由美国国立卫生研究院资助GM68418的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Lipofectamin 2000Life Technologies/Invitrogen11668转染试剂 I
Lipofectamin RNAiMAXLife Technologies/Invitrogen13778转染试剂
II Opti-MEM ILife Technologies/Invitrogen31985减血清培养基，在 37 &°C 中温热;C 水浴 使用前
高葡萄糖 DMEM （Dulbecco's 修改后的鹰's 培养基）Life Technologies/BioWhittaker12-604高葡萄糖 DMEM，在 37 &°C 中加热;使用前 C 水浴
胎牛血清，认证，热灭活，美国来源Life Technologies/Gibco10082FBS（胎牛血清）
聚-L-赖氨酸溶液SIGMA-SLDRICHP 8920聚-L-赖氨酸，0.1% w/v，水溶液
超纯蒸馏水Life Technologies/Invitrogen/Gibco10977无菌组织培养级水 
微型盖板玻璃 （22 mm x 22 mm） Surgipath105盖玻片 （22 mm x 22 mm） 
6 孔细胞培养集群Fisher/Corning Incorporated07-200-836 孔聚苯乙烯板 
青霉素、链霉素;LiquidFisher/Gibco15-140青霉素-链霉素
PAP 笔 结合位点AD100.1疏水屏障笔（用于免疫荧光染色中的防水屏障）
紫杉醇（紫杉醇）SIGMA-SLDRICHT7402紫杉醇，用于有丝分裂细胞分析
TN-16，微管抑制剂 （TN16）Enzo Life SciencesBML-T120TN16，用于有丝分裂细胞分析
BSA（牛血清白蛋白）SIGMA-SLDRICHA7906封闭试剂
Triton X-100SIGMA-SLDRICHT8787去污剂
多聚甲醛SIGMA-SLDRICHP6148固定反应剂
DAPISIGMA-SLDRICHD9542用于核染色
对苯二胺SIGMA-SLDRICHP6001用于封固介质
VWR 微载玻片，磨砂VWR International48312-013微型滑轨 
抗 CENP-A 抗体Stressgen/Enzo Life SciencesKAM-CC006小鼠单克隆抗体;稀释比例为 1：100 （IIF）、1：5000 （WB）
CENP-B 抗体Novus BiologicalsH00001059-B01P小鼠单克隆抗体;稀释比为 1：200 （IIF，甲醇/丙酮固定）-1：400 （IIF，多聚甲醛固定）
抗 CENP-B 抗体 abcamab25734兔多克隆抗体;稀释比例为 1：200（IIF，甲醇/丙酮固定）-1：400（IIF，多聚甲醛固定）
抗着丝粒抗体 （ACA）Fitzgerald Industries International， Inc.90C-CS1058人着丝粒抗血清;稀释比为 1：2000 （IIF）
抗 CENP-H 抗体Bethyl LaboratoriesBL1112 （A400-007A）兔多克隆抗体;稀释比为 1：200 （IIF）
抗 CENP-H 抗体BD612142小鼠单克隆抗体;稀释比为 1：200 （IIF）
抗 CENP-I 抗体N/A，Katusmi Kitagawa 博士 N/A，KatusmiKitagawa博士兔多克隆抗体;稀释比为 1：1000 （IIF）;Niikura et al.， Oncogene， 4133-4146 （2006）
抗 KNL1 抗体Novus BiologicalsNBP1-89223兔多克隆抗体;稀释比例为 1：100 （IIF）
抗 Hec1 抗体Novus Biologicals / GeneTexNB 100-338 / GTX70268小鼠单克隆抗体;稀释比例为 1：100 （IIF）
抗 Hec1 抗体GeneTexGTX110735兔多克隆抗体;稀释比例1：100 （IIF）
抗 Ska1 抗体abcamab46826兔多克隆抗体;稀释比例为 1：100 （IIF）
抗 Flag 抗体SIGMA-ALDRICHF3165小鼠单克隆抗体;稀释比例为 1：1000 （IIF）、1：5000 （WB）
抗 Flag 抗体SIGMA-ALDRICHF7425兔多克隆抗体;稀释比例为 1：1000 （IIF）、1：5000 （WB）
抗 CUL4A抗体N/A，Pradip Raychaudhuri 博士N/A，Pradip Raychaudhuri 博士兔多克隆抗体;稀释比为 1：3000 （WB）;Shiyanov et al.， The Journal of biological chemistry， 35309-35312 （1999）
抗RBX1抗体Cell Signaling4397兔多克隆抗体;稀释比为1：2000 （WB）
抗GAPDH抗体ChemiconMAB374小鼠单克隆抗体;稀释比为1：5000 （WB）
Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠IgGLife Technologies/InvitrogenA11001荧光基团偶联的二抗（亲和纯化的二抗）
Alexa Fluor 594 山羊抗小鼠 IgGLife Technologies/InvitrogenA11005荧光基团偶联的二抗（亲和纯化的二抗）
Alexa Fluor 488 山羊抗兔 IgGLife Technologies/InvitrogenA11008荧光基团偶联的二抗（亲和纯化的二抗）
Alexa Fluor 594 山羊抗兔 IgGLife Technologies/InvitrogenA11012荧光团偶联二抗（亲和纯化二抗）
脱脂奶粉（批准替代康乃馨奶粉）Fisher ScientificNC9255871（重新订购编号 190915;Lot# 90629）脱脂牛奶
Leica DM IRE2 电动荧光显微镜 徕卡电动荧光显微镜 
HCX PL APO 63x 油浸镜头徕卡LEICA HCX PL APO NA 1.40 油 PH 3 CS63X 油浸镜头
HCX PL APO 100x 油浸镜头徕卡LEICA HCX PL APO NA 1.40 油浸 PHE100X 油浸镜头
徕卡 EL6000 紧凑型光源徕卡用于荧光激发的外部紧凑型光源
ORCA-R2 数字 CCD 相机 滨松C10600-10B数码 CCD 相机 
Openlab 5.5.2 版科学成像软件 Perkin Elmer/Improvision用于图像观察、采集、量化和分析
Velocity 版本 6.1.1 3D 图像分析软件 Perkin Elmer/Improvision用于图像观察、采集、定量和分析
不含 EDTA 的完整蛋白酶抑制剂混合物Roche11873580001/11836170001蛋白酶抑制剂混合物片
PlusOne 2-D 定量试剂盒Amersham Biosciences80-6483-56用于测量蛋白质浓度的商业蛋白质检测试剂 I（与 2% SDS 兼容）
Bio-Rad 蛋白检测Bio-Rad500-0006用于测量蛋白浓度的市售蛋白检测试剂 II（与 0.1% SDS 兼容）
Immobilon-FLEMD MilliporeIPFL00010PVDF 膜，用于转移
IRDye 800CW 山羊抗小鼠 IgGGLI-COR Biosciences926-32210IR 荧光染料偶联的二抗（亲和纯化的二抗）;稀释比例1：20000 （IIF）
IRDye 680 山羊抗兔 IgGLI-COR Biosciences926-32221IR 荧光染料偶联二抗（亲和纯化二抗）;稀释比 1：20000 （IIF）
山羊抗小鼠 IgG DyLight 549Fisher ScientificPI35507DyLight 偶联二抗IR 荧光染料偶联二抗（亲和纯化二抗）;稀释比为 1：20000（IIF）
山羊抗兔 DyLight 649Fisher ScientificPI35565DyLight 偶联二抗IR 荧光染料偶联二抗（亲和纯化二抗）;稀释比为 1：20000 （IIF）
山羊抗小鼠 IgG-HRPSanta CruzSC-2005HRP 偶联二抗DyLight 偶联二抗IR 荧光染料偶联二抗（亲和纯化的二抗抗体）;稀释比为 1：10000 （IIF）
山羊抗兔 IgG-HRPSanta CruzSC-2004HRP 偶联二抗DyLight 偶联二抗IR 荧光染料偶联二抗（亲和纯化二抗）;稀释比为 1：10000 （IIF）
Openlab 5.5.2 版。科学成像软件 Improvision/PerkinElmer软件 A
Volocity 版本 6.3 3D 图像分析软件（Volocity Acquisition）PerkinElmerSoftware B1
Volocity 版本 6.3 3D 图像分析软件（Volocity Quantification）PerkinElmer软件 B2
Branson SONIFIER 450超声波仪
Branson 超声波超声波仪 Microtip Step， Solid，螺纹 9.5 mmVWR Scientific Products Inc. 33995-325用于超声处理的干扰器喇叭
Branson Ultrasonics 超声仪 Microtip 锥形 6.5 mmVWR Scientific Products Inc. 33996-185超声处理微尖
Odyssey CLx 红外成像系统 LI-COR Biosciences用于免疫印迹检测的红外成像系统
Image Studio 分析软件版本 4.0 LI-COR Biosciences软件 C
分子成像仪 Versadoc MP4000 系统 用于免疫印迹检测的Bio-Rad
Quantity One 1-D 分析软件 Bio-Rad软件 D
SuperSignal West Femto 最高灵敏度底Thermo34095超灵敏增强型化学发光 （ECL） 底物
透化抗 剂 化学发光成像仪物

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. DeLuca, J. G., et al. Hec1 and nuf2 are core components of the kinetochore outer plate essential for organizing microtubule attachment sites. Molecular biology of the cell. 16, 519-531 (2005).
  2. Earnshaw, W. C., Halligan, N., Cooke, C., Rothfield, N. The kinetochore is part of the metaphase chromosome scaffold. J Cell Biol. 98, 352-357 (1984).
  3. Hoffman, D. B., Pearson, C. G., Yen, T. J., Howell, B. J., Salmon, E. D. Microtubule-dependent changes in assembly of microtubule motor proteins and mitotic spindle checkpoint proteins at PtK1 kinetochores. Molecular biology of the cell. 12, 1995-2009 (2001).
  4. Regnier, V., et al. CENP-A is required for accurate chromosome segregation and sustained kinetochore association of BubR1. Mol Cell Biol. 25, 3967-3981 (2005).
  5. Bernad, R., Sanchez, P., Losada, A. Epigenetic specification of centromeres by CENP-A. Exp Cell Res. 315, 3233-3241 (2009).
  6. Black, B. E., Cleveland, D. W. Epigenetic centromere propagation and the nature of CENP-a nucleosomes. Cell. 144, 471-479 (2011).
  7. Warburton, P. E., et al. Immunolocalization of CENP-A suggests a distinct nucleosome structure at the inner kinetochore plate of active centromeres. Curr Biol. 7, 901-904 (1997).
  8. Karpen, G. H., Allshire, R. C. The case for epigenetic effects on centromere identity and function. Trends Genet. 13, 489-496 (1997).
  9. Black, B. E., et al. Structural determinants for generating centromeric chromatin. Nature. 430, 578-582 (2004).
  10. Black, B. E., et al. Centromere identity maintained by nucleosomes assembled with histone H3 containing the CENP-A targeting domain. Mol Cell. 25, 309-322 (2007).
  11. Fachinetti, D., et al. A two-step mechanism for epigenetic specification of centromere identity and function. Nat Cell Biol. 15, 1056-1066 (2013).
  12. Zeitlin, S. G., Shelby, R. D., Sullivan, K. F. CENP-A is phosphorylated by Aurora B kinase and plays an unexpected role in completion of cytokinesis. The Journal of cell biology. 155, 1147-1157 (2001).
  13. Zhang, X., Li, X., Marshall, J. B., Zhong, C. X., Dawe, R. K. Phosphoserines on maize CENTROMERIC HISTONE H3 and histone H3 demarcate the centromere and pericentromere during chromosome segregation. The Plant cell. 17, 572-583 (2005).
  14. Goutte-Gattat, D., et al. Phosphorylation of the CENP-A amino-terminus in mitotic centromeric chromatin is required for kinetochore function. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 8579-8584 (2013).
  15. Bailey, A. O., et al. Posttranslational modification of CENP-A influences the conformation of centromeric chromatin. Proc Natl Acad Sci U S A. 110, 11827-11832 (2013).
  16. Samel, A., Cuomo, A., Bonaldi, T., Ehrenhofer-Murray, A. E. Methylation of CenH3 arginine 37 regulates kinetochore integrity and chromosome segregation. Proc Natl Acad Sci U S A. 109, 9029-9034 (2012).
  17. Niikura, Y., et al. CENP-A K124 Ubiquitylation Is Required for CENP-A Deposition at the Centromere. Dev Cell. , (2015).
  18. Chan, G. K., Liu, S. T., Yen, T. J. Kinetochore structure and function. Trends in cell biology. 15, 589-598 (2005).
  19. Hori, T., Okada, M., Maenaka, K., Fukagawa, T. CENP-O class proteins form a stable complex and are required for proper kinetochore function. Molecular biology of the cell. 19, 843-854 (2008).
  20. Fukagawa, T., Earnshaw, W. C. The centromere: chromatin foundation for the kinetochore machinery. Developmental cell. 30, 496-508 (2014).
  21. Kedersha, N. The Proteintech Blog.Proteintech. Grainger, D. , Proteintech Group. (2012).
  22. Clontech Laboratories, Inc. HeLa Tet-Off Advanced Cell Line. , Available from: http://www.clontech.com/CR/Products/Inducible_Systems/Tetracycline-Inducible_Expression/ibcGetAttachment.jsp?cItemId=26908&fileId=6712191&sitex=10020:22372:US (2012).
  23. Meraldi, P., Sorger, P. K. A dual role for Bub1 in the spindle checkpoint and chromosome congression. EMBO J. 24, 1621-1633 (2005).
  24. Niikura, Y., et al. 17-AAG, an Hsp90 inhibitor, causes kinetochore defects: a novel mechanism by which 17-AAG inhibits cell proliferation. Oncogene. 25, 4133-4146 (2006).
  25. Yang, Z., et al. Silencing mitosin induces misaligned chromosomes, premature chromosome decondensation before anaphase onset, and mitotic cell death. Mol Cell Biol. 25, 4062-4074 (2005).
  26. Wang, H., et al. Histone H3 and H4 ubiquitylation by the CUL4-DDB-ROC1 ubiquitin ligase facilitates cellular response to DNA damage. Mol Cell. 22, 383-394 (2006).
  27. Lamb, J. R., Tugendreich, S., Hieter, P. Tetratrico peptide repeat interactions: to TPR or not to TPR? Trends Biochem Sci. 20, 257-259 (1995).
  28. Kitagawa, K., Skowyra, D., Elledge, S. J., Harper, J. W., Hieter, P. SGT1 encodes an essential component of the yeast kinetochore assembly pathway and a novel subunit of the SCF ubiquitin ligase complex. Mol Cell. 4, 21-33 (1999).
  29. Niikura, Y., Dixit, A., Scott, R., Perkins, G., Kitagawa, K. BUB1 mediation of caspase-independent mitotic death determines cell fate. J Cell Biol. 178, 283-296 (2007).
  30. Niikura, Y., Kitagawa, K. Identification of a novel splice variant: human SGT1B (SUGT1B). DNA Seq. 14, 436-441 (2003).
  31. Niikura, Y., Ogi, H., Kikuchi, K., Kitagawa, K. BUB3 that dissociates from BUB1 activates caspase-independent mitotic death (CIMD). Cell Death Differ. 17, 1011-1024 (2010).
  32. Ando, S., Yang, H., Nozaki, N., Okazaki, T., Yoda, K. CENP-A, -B, and -C chromatin complex that contains the I-type alpha-satellite array constitutes the prekinetochore in HeLa cells. Mol Cell Biol. 22, 2229-2241 (2002).
  33. Izuta, H., et al. Comprehensive analysis of the ICEN (Interphase Centromere Complex) components enriched in the CENP-A chromatin of human cells. Genes to cells : devoted to molecular & cellular mechanisms. 11, 673-684 (2006).
  34. Obuse, C., et al. Proteomics analysis of the centromere complex from HeLa interphase cells: UV-damaged DNA binding protein 1 (DDB-1) is a component of the CEN-complex, while BMI-1 is transiently co-localized with the centromeric region in interphase. Genes Cells. 9, 105-120 (2004).
  35. Merlet, J., Burger, J., Gomes, J. E., Pintard, L. Regulation of cullin-RING E3 ubiquitin-ligases by neddylation and dimerization. Cell Mol Life Sci. 66, 1924-1938 (2009).
  36. Bennett, E. J., Rush, J., Gygi, S. P., Harper, J. W. Dynamics of cullin-RING ubiquitin ligase network revealed by systematic quantitative proteomics. Cell. 143, 951-965 (2010).
  37. Antonelli, A., et al. Efficient inhibition of macrophage TNF-alpha production upon targeted delivery of K48R ubiquitin. Br J Haematol. 104, 475-481 (1999).
  38. Codomo, C. A., Furuyama, T., Henikoff, S. CENP-A octamers do not confer a reduction in nucleosome height by AFM. Nat Struct Mol Biol. 21, 4-5 (2014).
  39. Thrower, J. S., Hoffman, L., Rechsteiner, M., Pickart, C. M. Recognition of the polyubiquitin proteolytic signal. The EMBO journal. 19, 94-102 (2000).
  40. Yoda, K., et al. Human centromere protein A (CENP-A) can replace histone H3 in nucleosome reconstitution in vitro. Proc Natl Acad Sci U S A. 97, 7266-7271 (2000).
  41. Shelby, R. D., Vafa, O., Sullivan, K. F. Assembly of CENP-A into centromeric chromatin requires a cooperative array of nucleosomal DNA contact sites. J Cell Biol. 136, 501-513 (1997).
  42. Majumder, S., Fisk, H. A. Quantitative immunofluorescence assay to measure the variation in protein levels at centrosomes. J Vis Exp. , (2014).
  43. Masumoto, H., Masukata, H., Muro, Y., Nozaki, N., Okazaki, T. A human centromere antigen (CENP-B) interacts with a short specific sequence in alphoid DNA, a human centromeric satellite. J Cell Biol. 109, 1963-1973 (1989).
  44. Yoda, K., Kitagawa, K., Masumoto, H., Muro, Y., Okazaki, T. A human centromere protein, CENP-B, has a DNA binding domain containing four potential alpha helices at the NH2 terminus, which is separable from dimerizing activity. J Cell Biol. 119, 1413-1427 (1992).
  45. Sugata, N., et al. Human CENP-H multimers colocalize with CENP-A and CENP-C at active centromere--kinetochore complexes. Hum Mol Genet. 9, 2919-2926 (2000).
  46. Earnshaw, W. C., Ratrie, H. 3rd, Stetten, G. Visualization of centromere proteins CENP-B and CENP-C on a stable dicentric chromosome in cytological spreads. Chromosoma. 98, 1-12 (1989).
  47. Goshima, G., Kiyomitsu, T., Yoda, K., Yanagida, M. Human centromere chromatin protein hMis12, essential for equal segregation, is independent of CENP-A loading pathway. J Cell Biol. 160, 25-39 (2003).
  48. Liu, S. T., Rattner, J. B., Jablonski, S. A., Yen, T. J. Mapping the assembly pathways that specify formation of the trilaminar kinetochore plates in human cells. J Cell Biol. 175, 41-53 (2006).
  49. Gascoigne, K. E., Cheeseman, I. M. T time for point centromeres. Nat Cell Biol. 14, 559-561 (2012).
  50. Gascoigne, K. E., et al. Induced ectopic kinetochore assembly bypasses the requirement for CENP-A nucleosomes. Cell. 145, 410-422 (2011).
  51. Nishino, T., et al. CENP-T provides a structural platform for outer kinetochore assembly. EMBO J. 32, 424-436 (2013).
  52. Malvezzi, F., et al. A structural basis for kinetochore recruitment of the Ndc80 complex via two distinct centromere receptors. EMBO J. 32, 409-423 (2013).
  53. Schleiffer, A., et al. CENP-T proteins are conserved centromere receptors of the Ndc80 complex. Nat Cell Biol. 14, 604-613 (2012).
  54. Rago, F., Gascoigne, K. E., Cheeseman, I. M. Distinct organization and regulation of the outer kinetochore KMN network downstream of CENP-C and CENP-T. Curr Biol. 25, 671-677 (2015).
  55. Nishino, T., et al. CENP-T-W-S-X forms a unique centromeric chromatin structure with a histone-like fold. Cell. 148, 487-501 (2012).
  56. Bodor, D. L., et al. The quantitative architecture of centromeric chromatin. Elife. 3, e02137(2014).
  57. Oliver, C. Ch 58. Molecular Biomethods Handbook. Rapely, R., Walker, J. M. , Humana Press. 1063-1079 (2008).
  58. Terasima, T., Tolmach, L. J. Changes in x-ray sensitivity of HeLa cells during the division cycle. Nature. 190, 1210-1211 (1961).
  59. Levenson, G. B. R. Ch 8. Biomedical Photonics Handbook. Vo-Dinh, T. uan , CRC Press LLC. 8-19 (2003).
  60. Sanderson, J. Fluorescence bleed-though. , Available from: http://www.gum2012.fionastoreydesign.co.uk/Downloads/Bleed through text.pdf (2011).

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