本文报道了在人类细胞中检测内源性和外源性着丝粒-动粒蛋白的实验方案，并通过间接免疫荧光染色方法（采用固定剂如多聚甲醛、丙酮或甲醇进行固定）对这些蛋白在着丝粒-动粒上的水平进行定量分析。
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本文内容
摘要
摘要
“着丝粒”和“动粒”是指染色体在细胞分裂过程中与纺锤体结合的位点。在整个细胞周期中对着丝粒-动粒蛋白进行直接可视化观察，仍是研究这些蛋白作用机制的基本工具。荧光显微镜的先进成像方法可实现对着丝粒-动粒组分的高分辨率成像，从而能够直接观察着丝粒和动粒的特定分子组分。此外，利用特异性抗体进行间接免疫荧光（IIF）染色的方法对这些观察至关重要。然而，尽管已有大量关于IIF实验方案的报道，但极少有文献详细讨论特定着丝粒-动粒蛋白的相关问题1-4。本文报道了利用多聚甲醛固定结合间接免疫荧光染色法标记人细胞内源性着丝粒-动粒蛋白的优化实验方案。同时，本文还报道了对经丙酮或甲醇固定的细胞中Flag标签外源性CENP-A蛋白进行检测的实验方案。这些方法可用于检测和定量人细胞中的内源性着丝粒-动粒蛋白以及Flag标签的CENP-A蛋白。
引言
"着丝粒"在遗传学中传统上被定义为减数分裂重组受抑制的区域，随后被确认为有丝分裂染色体上的初级缢缩部位，在有丝分裂过程中染色体的准确分离中发挥关键作用。"动粒"最初通过电子显微镜观察被描述为在着丝粒表面结合微管的多层结构；"动粒"随后被定义为定位于有丝分裂染色体着丝粒区域的大型蛋白复合物。尽管脊椎动物的着丝粒DNA序列存在显著差异，动粒的结构和组成却高度保守。纺锤体微管与动粒之间的动态相互作用对于有丝分裂过程中染色体的忠实分离至关重要，着丝粒-动粒功能缺陷会导致非整倍性，从而引发癌症。
大多数真核生物的着丝粒没有明确的DNA序列，而是由重复的α卫星DNA（171 bp）组成的大片段阵列（0.3–5 Mb）构成。除芽殖酵母外，着丝粒的特性并非由DNA序列决定，而是取决于一种含有组蛋白H3变体CenH3（在人类中称为着丝粒蛋白A [CENP-A]）的特殊核小体的存在。5 CENP-A核小体定位于哺乳动物动粒的内板7，并结合171 bp的α卫星DNA。有活性的着丝粒需要含有CENP-A的核小体来介导组成型着丝粒相关网络（CCAN）和动粒蛋白的招募，这些蛋白共同调控染色体与有丝分裂纺锤体的连接以及通过纺锤体检查点的后续细胞周期进程。
根据上述证据，CENP-A 被认为是着丝粒的表观遗传标记8；然而，CENP-A 如何....
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方案
1. 细胞培养与转染
- 将一块盖玻片（22 mm × 22 mm）放入6孔聚苯乙烯板中。可选步骤：用0.1%（w/v）水溶液的多聚-L-赖氨酸（见材料与设备列表）包被盖玻片，以确保有丝分裂细胞在后续步骤中牢固附着于盖玻片上。
注：每种细胞系和应用都必须确定最佳条件。- 无菌条件下，用0.1% (w/v) 聚-L-赖氨酸水溶液对培养表面进行包被（每孔0.4 ml，适用于6孔聚苯乙烯培养板）。轻柔摇动以确保培养表面均匀覆盖。
- 5分钟后，吸除溶液，并用无菌组织培养级水彻底冲洗表面。
- 在接种细胞和培养基前，至少干燥 2 小时。
- 接种HeLa细胞17 或 HeLa Tet-Off 细胞17,22 在6孔聚苯乙烯板中的盖玻片（22 mm × 22 mm）上接种细胞。检查细胞密度是否为5.4 × 105 每孔。使用含10% FBS和1%青霉素-链霉素的高糖DMEM培养细胞。
注意：为获得最佳结果，需通过实验确定接种时所用的细胞密度。 - 将细胞置于培养箱中孵育 37 °C 在5% CO的环境中2 18 小时。
注意：对于 HeLa Tet-Off 细胞，外源基因的转录在无诱导剂存在时处于活跃状态即，四环素/多西环素），因此在无四环素/多西环素的培养基中培养细胞，....
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结果
内源性 CENP-A 的免疫荧光分析支持 CUL4A-E3 连接酶对 CENP-A 定位于着丝粒所必需的假说
我们近期的研究表明，CUL4A-RBX1-COPS8 E3 连接酶活性对于 CENP-A 赖氨酸 124（K124）的泛素化以及 CENP-A 在着丝粒上的定位是必需的17。最初，通过抗 CENP-A 的天然染色质免疫沉淀法分离得到了间期着丝粒复合物（ICEN）32-34，并推测部分 ICEN 蛋白可能在介导 CENP-A 定位于着丝粒的过程中发挥作用。因此，我们进行了 siRNA 沉默实验，以筛选那些表达缺失会导致 CENP-A 在着丝粒上失定位的蛋白17（数据未显示）：将不同步生长的 HeLa 细胞分别转染 Cullin 4A（CUL4A）siRNA 或 RBX1 siRNA，并在达到最佳蛋白耗竭所需的时间（CUL4A 为 48 小时，RBX1 为 72 小时）后进行分析。转染 CUL4A siRNA 的细胞显示出 CENP-A 在着丝粒上显著的失定位现.......
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讨论
近年来，许多研究开发了针对固定细胞的不同定量显微检测方法。42 着丝粒-动粒生物学的进步通常需要理解特定蛋白质在亚细胞水平上的时空调控，这种调控反映了这些蛋白质在细胞周期中功能的动态变化。因此，本文建立了免疫荧光染色（IIF）方法以及一种定量IIF检测方法，用于特异性分析内源性和外源性CENP-A蛋白的相对水平，该方法可适用于不同处理的样本。目前，我们已成功使用本研究中的方案2对内源性CENP-I、CENP-H、KNL1、Hec1和Ska1进行了IIF染色（参见Niikura 等.24 及未发表数据；有关抗体信息见材料与设备列表）。未来，研究人员可采用相同方法，通过选择特异性抗体来定量不同着丝粒-动粒蛋白（包括内源性蛋白和Flag标签的外源性蛋白）的水平。然而，我们的IIF方法不适用于活细胞或在整个细胞周期中对单个特定细胞进行检测。由于这些实验步骤需要将细胞固定并分别处理在不同的盖玻片上，我们引入了参考信号（例如，ACA或CENP-B），以实现不同样本间信号的公平比较，并提高检测的准确性。由于ACA可能包含内源性和/或外源性CENP-A信号，因此在定量分析C.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目 GM68418 支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| Lipofectamin 2000 | Life Technologies/Invitrogen | 11668 | 转染试剂 I |
| Lipofectamin RNAiMAX | Life Technologies/Invitrogen | 13778 | 转染试剂 II |
| Opti-MEM I | Life Technologies/Invitrogen | 31985 | 低血清培养基，使用前于 37 °C 水浴中预热 |
| 高葡萄糖 DMEM（Dulbecco’s 改良 Eagle’s 培养基） | Life Technologies/BioWhittaker | 12-604 | 高葡萄糖 DMEM，使用前于 37 °C 水浴中预热 |
| 胎牛血清，经认证、热灭活、源自美国 | Life Technologies/Gibco | 10082 | FBS（胎牛血清） |
| Poly-L-Lysine 溶液 | SIGMA-SLDRICH | P 8920 | Poly-L-Lysine，0.1% w/v，溶于水 |
| UltraPure 去离子水 | Life Technologies/Invitrogen/Gibco | 10977 | 无菌组织培养级水 |
| 显微盖玻片（22 mm × 22 mm） | Surgipath | 105 | 盖玻片（22 mm × 22 mm） |
| 6 孔细胞培养板 | Fisher/Corning Incorporated | 07-200-83 | 6 孔聚苯乙烯培养板 |
| 青霉素-链霉素，液体 | Fisher/Gibco | 15-140 | 青霉素-链霉素 |
| PAP 笔 | Binding Site | AD100.1 | 疏水屏障笔（用于免疫荧光染色中形成拒水屏障） |
| 紫杉醇（Taxol） | SIGMA-SLDRICH | T7402 | 用于有丝分裂细胞分析的 Taxol |
| TN-16，微管抑制剂（TN16） | Enzo Life Sciences | BML-T120 | 用于有丝分裂细胞分析的 TN16 |
| BSA（牛血清白蛋白） | SIGMA-SLDRICH | A7906 | 封闭试剂 |
| Triton X-100 | SIGMA-SLDRICH | T8787 | 用于透化的去垢剂 |
| 多聚甲醛 | SIGMA-SLDRICH | P6148 | 固定剂 |
| DAPI | SIGMA-SLDRICH | D9542 | 用于细胞核染色 |
| 对苯二胺 | SIGMA-SLDRICH | P6001 | 用于封片剂 |
| VWR 显微载玻片，磨砂 | VWR International | 48312-013 | 显微载玻片 |
| 抗 CENP-A 抗体 | Stressgen/Enzo Life Sciences | KAM-CC006 | 小鼠单克隆抗体；稀释比例为 1:100（IIF），1:5000（WB） |
| 抗 CENP-B 抗体 | Novus Biologicals | H00001059-B01P | 小鼠单克隆抗体；稀释比例为 1:200（IIF，甲醇/丙酮固定）至 1:400（IIF，多聚甲醛固定） |
| 抗 CENP-B 抗体 | abcam | ab25734 | 兔多克隆抗体；稀释比例为 1:200（IIF，甲醇/丙酮固定）至 1:400（IIF，多聚甲醛固定） |
| 抗着丝粒抗体（ACA） | Fitzgerald Industries International, Inc. | 90C-CS1058 | 人着丝粒抗血清；稀释比例为 1:2000（IIF） |
| 抗 CENP-H 抗体 | Bethyl Laboratories | BL1112 (A400-007A) | 兔多克隆抗体；稀释比例为 1:200（IIF） |
| 抗 CENP-H 抗体 | BD | 612142 | 小鼠单克隆抗体；稀释比例为 1:200（IIF） |
| 抗 CENP-I 抗体 | N/A，Katusmi Kitagawa 博士 | N/A，Katusmi Kitagawa 博士 | 兔多克隆抗体；稀释比例为 1:1000（IIF）；Niikura 等，Oncogene，4133-4146（2006） |
| 抗 KNL1 抗体 | Novus Biologicals | NBP1-89223 | 兔多克隆抗体；稀释比例为 1:100（IIF） |
| 抗 Hec1 抗体 | Novus Biologicals / GeneTex | NB 100-338 / GTX70268 | 小鼠单克隆抗体；稀释比例为 1:100（IIF） |
| 抗 Hec1 抗体 | GeneTex | GTX110735 | 兔多克隆抗体；稀释比例为 1:100（IIF） |
| 抗 Ska1 抗体 | abcam | ab46826 | 兔多克隆抗体；稀释比例为 1:100（IIF） |
| 抗 Flag 抗体 | SIGMA-ALDRICH | F3165 | 小鼠单克隆抗体；稀释比例为 1:1000（IIF），1:5000（WB） |
| 抗 Flag 抗体 | SIGMA-ALDRICH | F7425 | 兔多克隆抗体；稀释比例为 1:1000（IIF），1:5000（WB） |
| 抗 CUL4A 抗体 | N/A，Pradip Raychaudhuri 博士 | N/A，Pradip Raychaudhuri 博士 | 兔多克隆抗体；稀释比例为 1:3000（WB）；Shiyanov 等，《生物化学杂志》，35309-35312（1999） |
| 抗 RBX1 抗体 | Cell Signaling | 4397 | 兔多克隆抗体；稀释比例为 1:2000（WB） |
| 抗 GAPDH 抗体 | Chemicon | MAB374 | 小鼠单克隆抗体；稀释比例为 1:5000（WB） |
| Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠 IgG | Life Technologies/Invitrogen | A11001 | 荧光染料偶联的二抗（亲和纯化的二抗） |
| Alexa Fluor 594 山羊抗小鼠 IgG | Life Technologies/Invitrogen | A11005 | 荧光染料偶联的二抗（亲和纯化的二抗） |
| Alexa Fluor 488 山羊抗兔 IgG | Life Technologies/Invitrogen | A11008 | 荧光染料偶联的二抗（亲和纯化的二抗） |
| Alexa Fluor 594 山羊抗兔 IgG | Life Technologies/Invitrogen | A11012 | 荧光染料偶联的二抗（亲和纯化的二抗） |
| 脱脂奶粉（可替代 Carnation 奶粉） | Fisher Scientific | NC9255871（再订购号 190915；批号 90629） | 脱脂奶粉 |
| Leica DM IRE2 电动荧光显微镜 | Leica | 电动荧光显微镜 | |
| HCX PL APO 63x 油镜 | Leica | LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PH 3 CS | 63X 油浸物镜 |
| HCX PL APO 100x 油镜 | Leica | LEICA HCX PL APO NA 1.40 OIL PHE | 100X 油浸物镜 |
| Leica EL6000 紧凑型光源 | Leica | 用于荧光激发的外部紧凑型光源 | |
| ORCA-R2 数字 CCD 相机 | Hamamatsu | C10600-10B | 数字 CCD 相机 |
| Openlab 版本 5.5.2 科学成像软件 | Perkin Elmer/Improvision | 用于图像观察、采集、定量和分析 | |
| Velocity 版本 6.1.1 3D 图像分析软件 | Perkin Elmer/Improvision | 用于图像观察、采集、定量和分析 | |
| 完全不含 EDTA 的蛋白酶抑制剂混合物 | Roche | 11873580001/11836170001 | 蛋白酶抑制剂混合物片剂 |
| PlusOne 2-D 定量试剂盒 | Amersham Biosciences | 80-6483-56 | 用于蛋白质浓度测定的商用蛋白检测试剂 I（兼容 2% SDS） |
| Bio-Rad 蛋白检测试剂 | Bio-Rad | 500-0006 | 用于蛋白质浓度测定的商用蛋白检测试剂 II（兼容 0.1% SDS） |
| Immobilon-FL | EMD Millipore | IPFL00010 | 用于转膜的 PVDF 膜 |
| IRDye 800CW 山羊抗小鼠 IgG | LI-COR Biosciences | 926-32210 | 红外荧光染料偶联的二抗（亲和纯化的二抗）；稀释比例为 1:20000（IIF） |
| IRDye 680 山羊抗兔 IgG | LI-COR Biosciences | 926-32221 | 红外荧光染料偶联的二抗（亲和纯化的二抗）；稀释比例为 1:20000（IIF） |
| 山羊抗小鼠 IgG DyLight 549 | Fisher Scientific | PI35507 | DyLight 偶联的二抗，红外荧光染料偶联的二抗（亲和纯化的二抗）；稀释比例为 1:20000（IIF） |
| 山羊抗兔 DyLight 649 | Fisher Scientific | PI35565 | DyLight 偶联的二抗，红外荧光染料偶联的二抗（亲和纯化的二抗）；稀释比例为 1:20000（IIF） |
| 山羊抗小鼠 IgG-HRP | Santa Cruz | SC-2005 | HRP 偶联的二抗，DyLight 偶联的二抗，红外荧光染料偶联的二抗（亲和纯化的二抗）；稀释比例为 1:10000（IIF） |
| 山羊抗兔 IgG-HRP | Santa Cruz | SC-2004 | HRP 偶联的二抗，DyLight 偶联的二抗，红外荧光染料偶联的二抗（亲和纯化的二抗）；稀释比例为 1:10000（IIF） |
| Openlab 版本 5.5.2 科学成像软件 | Improvision/PerkinElmer | 软件 A | |
| Volocity 版本 6.3 3D 图像分析软件（Volocity Acquisition） | PerkinElmer | 软件 B1 | |
| Volocity 版本 6.3 3D 图像分析软件（Volocity Quantification） | PerkinElmer | 软件 B2 | |
| Branson SONIFIER 450 | 超声破碎仪 | ||
| Branson Ultrasonics 超声破碎仪微探头，阶梯型，实心，螺纹 9.5 mm | VWR Scientific Products Inc. | 33995-325 | 用于超声破碎的破碎探头 |
| Branson Ultrasonics 超声破碎仪微探头，锥形 6.5 mm | VWR Scientific Products Inc. | 33996-185 | 用于超声破碎的微探头 |
| Odyssey CLx 红外成像系统 | LI-COR Biosciences | 用于免疫印迹检测的红外成像系统 | |
| Image Studio 分析软件版本 4.0 | LI-COR Biosciences | 软件 C | |
| Molecular Imager Versadoc MP4000 系统 | Bio-Rad | 用于免疫印迹检测的化学发光成像仪 | |
| Quantity One 1-D 分析软件 | Bio-Rad | 软件 D | |
| SuperSignal West Femto 最高灵敏度底物 | Thermo | 34095 | 超敏增强型化学发光（ECL）底物 |
参考文献
- DeLuca, J. G., et al. Hec1 and nuf2 are core components of the kinetochore outer plate essential for organizing microtubule attachment sites. Molecular biology of the cell. 16, 519-531 (2005).
- Earnshaw, W. C., Halligan, N., Cooke, C., Rothfield, N.
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