方法文章

内源性的免疫荧光分析及外源着丝粒着丝粒蛋白

DOI：

10.3791/53732

⸱

2016年3月3日

 , 
1Center for Childhood Cancer and Blood Diseases, Nationwide Children's Hospital

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在这里，我们报告了检测人类细胞中内源性和外源性着丝粒-着丝粒蛋白的方案，并通过使用固定（多聚甲醛、丙酮或甲醇固定）的间接免疫荧光染色来定量着丝粒-着丝粒的这些蛋白质水平。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

"着丝粒"和"着丝粒"是指在细胞分裂过程中染色体与纺锤体结合的部位。在细胞周期中直接观察着丝粒-着丝粒蛋白仍然是研究这些蛋白质机制的基本工具。荧光显微镜中的先进成像方法提供了着丝粒-着丝粒成分的卓越分辨率，并允许直接观察着丝粒和着丝粒的特定分子成分。此外，使用特异性抗体的间接免疫荧光 （IIF） 染色方法对于这些观察至关重要。然而，尽管有许多关于 IIF 方案的报道，但很少有人详细讨论特定着丝粒-着丝粒蛋白的问题。1-4 在这里，我们报告了通过使用多聚甲醛固定和 IIF 染色对人细胞中内源性着丝粒-着丝粒蛋白进行染色的优化方案。此外，我们报道了检测经丙酮或甲醇固定的人细胞中 Flag 标记的外源性 CENP-A 蛋白的方案。这些方法可用于检测和定量内源性着丝粒-着丝粒蛋白和 Flag 标记的 CENP-A 蛋白，包括人类细胞中的蛋白。

引言

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"着丝粒"被经典定义为遗传学抑制减数分裂重组的区域和以后确认为有丝分裂染色体的主收缩，其中有丝分裂期间起着准确的染色体分离中起重要作用。 "着丝粒"被描述为结合到微管在着丝粒的表面上，所揭示的电子显微镜的多层结构; "着丝粒"后来被定义为在本地化有丝分裂的着丝粒的大分子复合物。尽管脊椎动物中的着丝粒DNA序列的戏剧性发散，动粒的结构和组成是高度保守的。需要有丝分裂过程中染色体分离友们纺锤体微管和动粒之间的动态互动，在着丝粒动粒功能导致非整倍体，从而癌症的缺陷。

在大多数真核生物着丝粒没有定义的DNA序列，而是由包括171 bp的α卫星DNA分子的重复DNA白斑样的大阵列（0.3-5兆）的。除了 ​​在芽殖酵母，着丝粒的身份不是由DNA序列，但由包含组蛋白H3变体CENH3特殊核小体存在下实现（着丝粒蛋白A [CENP-A〕在人类中）。5 CENP-A的核小体定位于哺乳动物着丝粒7并绑定到171 bp的α卫星DNA分子的内板。主动要求着丝粒CENP-含A-核直接组成着丝粒​​相关网络（CCAN）和动粒蛋白的募集，它们共同规范染色体通过纺锤体检查点的有丝分裂纺锤体和随后的周期进程的附件。

另外，在上述证据的光，CENP-A已被提出是着丝粒8的后生标记;然而，这个过程由CENP-A结合我n要着丝粒DNA并负责此掺入的因素尚未充分表征。短丝粒靶向域（CATD）驻....

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方案

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1.细胞培养和转染

  1. 放的盖玻璃（22毫米×22毫米）在6孔聚苯乙烯板。可选的外套盖玻璃，聚L-赖氨酸，0.1％w / v的，水（见材料/设备清单），以保证有丝分裂细胞上按照以下步骤玻璃盖:
    注意:最佳条件，必须对每个细胞系和应用来确定。
    1. 用聚-L-赖氨酸，0.1％重量/体积，在无菌条件下涂层培养表面在水（0.4mL毫升/孔的6孔聚苯乙烯板）。轻轻摇动，以确保即使在培养表面涂层。
    2. 5分钟后，吸删除解决方案，并彻底冲洗用无菌组织培养级别的水面。
    3. 引入细胞和中干前至少2小时。
  2. 种子HeLa细胞17或HeLa细胞的Tet-Off细胞上放置在6孔聚苯乙烯板的盖玻璃（22毫米×22毫米）17,22。检查细胞密度为5.4×10 5每孔。培养细胞在具有10％FBS和1％青霉素 - 链霉素的高葡萄糖DMEM中。
    注意:为了达到最佳效果，凭经验确定播种用的细胞密度。
  3. 孵育在37℃下将细胞在5％的CO 2的气氛中18小时。
    注意:在HeLa细胞的Tet-Off细胞的情况下，外源基因的转录是在不存在诱导剂（ 即 ，四环素/多西环素），因此培养细胞无四环素/多西环素的活性，并与pTRM4表达载体（ 表2瞬时转），其转录由TRE启动子调控（见下文）。
  4. ....

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结果

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内源性CENP-A的免疫荧光分析支持CUL4A-E3连接酶需要CENP-A的本地化着丝粒的假说
我们最近的研究表明，CUL4A-RBX1-COPS8 E3连接酶的活性需要在CENP-A和CENP-A至着丝粒的本地化赖氨酸124（K124）的泛素化17最初，相间着丝复合体（ICEN）被隔离抗CENP-A:原生染色质免疫沉淀，32-34，它一直推测，一些ICEN蛋白质可能在定位CENP-A至着丝粒的作用。因此，进行siRNA敲除实验以筛选诱导CENP-A的离域在着丝粒17，其不存在表达的蛋白质（数据未显示）:异步生长HeLa细胞与滞蛋白4A（CUL4A）siRNA或RBX1的siRNA转染的倍所需的最佳蛋白质消耗（48小时r代表CUL4A和72小时的RBX1）。与CUL4A的siRNA转染的细胞显示CENP-A的在着丝粒一个显著离域（ 图1A-C）。如在图2G所示，在CUL4A的siRNA转染细胞的总.......

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讨论

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近年来，许多研究已经在着丝粒动粒生物学为固定细胞开发了不同的定量显微镜测定。42进展通常需要的蛋白质的着丝粒特异性或特异性着丝点功能的理解，其中亚细胞时空调控反映不断变化的功能在细胞周期的这些蛋白质。因此，这里我们开发IIF染色和定量的IIF分析特异性分析内源性和外源性CENP-A蛋白的相对水平，这可以适用不同处理的样品中的方法。目前，我们实现了内源性CENP-I，CENP-H，KNL1，Hec1和Ska1在这项研究中采用方案2的成功IIF染色（见Niikura 等人 24和 ​​数据未显示;材料/设备清单抗体的信息） 。在将来，可以应用同样的方法来量化不同着丝粒动粒蛋白的水平（均endog源性和Flag标记的外源蛋白）选择特异性抗体，但是，我们的IIF方法不包括在活细胞中或在期间整个细胞周期的特定单电池这些蛋白质的检测。因为这些过程需要细胞被固定并在单独的盖玻片处理，我们引入以相当比较不同样品之间的信号和提高了测定的准确度为正常化的目的的参考信号（ 例如 ，ACA或CENP-B）。因为ACA涉及内源性和/或外源CENP-A的信号，CENP-B作为用于标准化.......

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披露

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作者宣称，他们没有竞争的经济利益。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这项工作是由美国国立卫生研究院资助GM68418的支持。

....

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Lipofectamin 2000Life Technologies/Invitrogen11668转染试剂 I
Lipofectamin RNAiMAXLife Technologies/Invitrogen13778转染试剂
II Opti-MEM ILife Technologies/Invitrogen31985减血清培养基，在 37 &°C 中温热;C 水浴 使用前
高葡萄糖 DMEM （Dulbecco's 修改后的鹰's 培养基）Life Technologies/BioWhittaker12-604高葡萄糖 DMEM，在 37 &°C 中加热;使用前 C 水浴
胎牛血清，认证，热灭活，美国来源Life Technologies/Gibco10082FBS（胎牛血清）
聚-L-赖氨酸溶液SIGMA-SLDRICHP 8920聚-L-赖氨酸，0.1% w/v，水溶液
超纯蒸馏水Life Technologies/Invitrogen/Gibco10977无菌组织培养级水 
微型盖板玻璃 （22 mm x 22 mm） Surgipath105盖玻片 （22 mm x 22 mm） 
6 孔细胞培养集群Fisher/Corning Incorporated07-200-836 孔聚苯乙烯板 
青霉素、链霉素;LiquidFisher/Gibco15-140青霉素-链霉素
PAP 笔 结合位点AD100.1疏水屏障笔（用于免疫荧光染色中的防水屏障）
紫杉醇（紫杉醇）SIGMA-SLDRICHT7402紫杉醇，用于有丝分裂细胞分析
TN-16，微管抑制剂 （TN16）Enzo Life SciencesBML-T120TN16，用于有丝分裂细胞分析
BSA（牛血清白蛋白）SIGMA-SLDRICHA7906封闭试剂
Triton X-100SIGMA-SLDRICHT8787去污剂
多聚甲醛SIGMA-SLDRICHP6148固定反应剂
DAPISIGMA-SLDRICHD9542用于核染色
对苯二胺SIGMA-SLDRICHP6001用于封固介质
VWR 微载玻片，磨砂VWR International48312-013微型滑轨 
抗 CENP-A 抗体Stressgen/Enzo Life SciencesKAM-CC006小鼠单克隆抗体;稀释比例为 1：100 （IIF）、1：5000 （WB）
CENP-B 抗体Novus BiologicalsH00001059-B01P小鼠单克隆抗体;稀释比为 1：200 （IIF，甲醇/丙酮固定）-1：400 （IIF，多聚甲醛固定）
抗 CENP-B 抗体 abcamab25734兔多克隆抗体;稀释比例为 1：200（IIF，甲醇/丙酮固定）-1：400（IIF，多聚甲醛固定）
抗着丝粒抗体 （ACA）Fitzgerald Industries International， Inc.90C-CS1058人着丝粒抗血清;稀释比为 1：2000 （IIF）
抗 CENP-H 抗体Bethyl LaboratoriesBL1112 （A400-007A）兔多克隆抗体;稀释比为 1：200 （IIF）
抗 CENP-H 抗体BD612142小鼠单克隆抗体;稀释比为 1：200 （IIF）
抗 CENP-I 抗体N/A，Katusmi Kitagawa 博士 N/A，KatusmiKitagawa博士兔多克隆抗体;稀释比为 1：1000 （IIF）;Niikura et al.， Oncogene， 4133-4146 （2006）
抗 KNL1 抗体Novus BiologicalsNBP1-89223兔多克隆抗体;稀释比例为 1：100 （IIF）
抗 Hec1 抗体Novus Biologicals / GeneTexNB 100-338 / GTX70268小鼠单克隆抗体;稀释比例为 1：100 （IIF）
抗 Hec1 抗体GeneTexGTX110735兔多克隆抗体;稀释比例1：100 （IIF）
抗 Ska1 抗体abcamab46826兔多克隆抗体;稀释比例为 1：100 （IIF）
抗 Flag 抗体SIGMA-ALDRICHF3165小鼠单克隆抗体;稀释比例为 1：1000 （IIF）、1：5000 （WB）
抗 Flag 抗体SIGMA-ALDRICHF7425兔多克隆抗体;稀释比例为 1：1000 （IIF）、1：5000 （WB）
抗 CUL4A抗体N/A，Pradip Raychaudhuri 博士N/A，Pradip Raychaudhuri 博士兔多克隆抗体;稀释比为 1：3000 （WB）;Shiyanov et al.， The Journal of biological chemistry， 35309-35312 （1999）
抗RBX1抗体Cell Signaling4397兔多克隆抗体;稀释比为1：2000 （WB）
抗GAPDH抗体ChemiconMAB374小鼠单克隆抗体;稀释比为1：5000 （WB）
Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠IgGLife Technologies/InvitrogenA11001荧光基团偶联的二抗（亲和纯化的二抗）
Alexa Fluor 594 山羊抗小鼠 IgGLife Technologies/InvitrogenA11005荧光基团偶联的二抗（亲和纯化的二抗）
Alexa Fluor 488 山羊抗兔 IgGLife Technologies/InvitrogenA11008荧光基团偶联的二抗（亲和纯化的二抗）
Alexa Fluor 594 山羊抗兔 IgGLife Technologies/InvitrogenA11012荧光团偶联二抗（亲和纯化二抗）
脱脂奶粉（批准替代康乃馨奶粉）Fisher ScientificNC9255871（重新订购编号 190915;Lot# 90629）脱脂牛奶
Leica DM IRE2 电动荧光显微镜 徕卡电动荧光显微镜 
HCX PL APO 63x 油浸镜头徕卡LEICA HCX PL APO NA 1.40 油 PH 3 CS63X 油浸镜头
HCX PL APO 100x 油浸镜头徕卡LEICA HCX PL APO NA 1.40 油浸 PHE100X 油浸镜头
徕卡 EL6000 紧凑型光源徕卡用于荧光激发的外部紧凑型光源
ORCA-R2 数字 CCD 相机 滨松C10600-10B数码 CCD 相机 
Openlab 5.5.2 版科学成像软件 Perkin Elmer/Improvision用于图像观察、采集、量化和分析
Velocity 版本 6.1.1 3D 图像分析软件 Perkin Elmer/Improvision用于图像观察、采集、定量和分析
不含 EDTA 的完整蛋白酶抑制剂混合物Roche11873580001/11836170001蛋白酶抑制剂混合物片
PlusOne 2-D 定量试剂盒Amersham Biosciences80-6483-56用于测量蛋白质浓度的商业蛋白质检测试剂 I（与 2% SDS 兼容）
Bio-Rad 蛋白检测Bio-Rad500-0006用于测量蛋白浓度的市售蛋白检测试剂 II（与 0.1% SDS 兼容）
Immobilon-FLEMD MilliporeIPFL00010PVDF 膜，用于转移
IRDye 800CW 山羊抗小鼠 IgGGLI-COR Biosciences926-32210IR 荧光染料偶联的二抗（亲和纯化的二抗）;稀释比例1：20000 （IIF）
IRDye 680 山羊抗兔 IgGLI-COR Biosciences926-32221IR 荧光染料偶联二抗（亲和纯化二抗）;稀释比 1：20000 （IIF）
山羊抗小鼠 IgG DyLight 549Fisher ScientificPI35507DyLight 偶联二抗IR 荧光染料偶联二抗（亲和纯化二抗）;稀释比为 1：20000（IIF）
山羊抗兔 DyLight 649Fisher ScientificPI35565DyLight 偶联二抗IR 荧光染料偶联二抗（亲和纯化二抗）;稀释比为 1：20000 （IIF）
山羊抗小鼠 IgG-HRPSanta CruzSC-2005HRP 偶联二抗DyLight 偶联二抗IR 荧光染料偶联二抗（亲和纯化的二抗抗体）;稀释比为 1：10000 （IIF）
山羊抗兔 IgG-HRPSanta CruzSC-2004HRP 偶联二抗DyLight 偶联二抗IR 荧光染料偶联二抗（亲和纯化二抗）;稀释比为 1：10000 （IIF）
Openlab 5.5.2 版。科学成像软件 Improvision/PerkinElmer软件 A
Volocity 版本 6.3 3D 图像分析软件（Volocity Acquisition）PerkinElmerSoftware B1
Volocity 版本 6.3 3D 图像分析软件（Volocity Quantification）PerkinElmer软件 B2
Branson SONIFIER 450超声波仪
Branson 超声波超声波仪 Microtip Step， Solid，螺纹 9.5 mmVWR Scientific Products Inc. 33995-325用于超声处理的干扰器喇叭
Branson Ultrasonics 超声仪 Microtip 锥形 6.5 mmVWR Scientific Products Inc. 33996-185超声处理微尖
Odyssey CLx 红外成像系统 LI-COR Biosciences用于免疫印迹检测的红外成像系统
Image Studio 分析软件版本 4.0 LI-COR Biosciences软件 C
分子成像仪 Versadoc MP4000 系统 用于免疫印迹检测的Bio-Rad
Quantity One 1-D 分析软件 Bio-Rad软件 D
SuperSignal West Femto 最高灵敏度底Thermo34095超灵敏增强型化学发光 （ECL） 底物
透化抗 剂 化学发光成像仪物

参考文献

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  1. DeLuca, J. G., et al. Hec1 and nuf2 are core components of the kinetochore outer plate essential for organizing microtubule attachment sites. Molecular biology of the cell. 16, 519-531 (2005).
  2. Earnshaw, W. C., Halligan, N., Cooke, C., Rothfield, N.

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