方法文章

使用尺寸排阻ICP-MS进行定量金属蛋白质组学分析的标准

17.3K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/53737

⸱

2016年4月13日

 , 
1Metalloproteomics Laboratory, Neuroproteomics Facility, The Florey Institute of Neuroscience and Mental Health

本文内容

摘要

尺寸排阻色谱联用电感耦合等离子体质谱法（ICP-MS）是一种直接从生物样品中测定金属蛋白丰度变化的有力工具。本文介绍了一组用于估算未知蛋白质分子量及其结合金属含量的金属蛋白标准品。

摘要

金属作为催化化学反应的辅因子，对蛋白质功能至关重要。金属稳态的紊乱与多种疾病相关，包括阿尔茨海默病和帕金森病，但这些金属所起的确切作用仍有待完全阐明。金属蛋白质的鉴定面临诸多挑战和困难。本文报道了一种可对复杂样品中的金属蛋白质进行定量分析的方法。该方法通过尺寸排阻色谱联用电感耦合等离子体质谱（SEC-ICP-MS）实现。利用六种已知的金属蛋白质，可对尺寸排阻色谱柱进行校准，并利用相应的痕量元素（铁、铜、锌、钴、碘）进行定量分析。本文展示了人脑组织和血浆样品的SEC-ICP-MS图谱。使用这些金属蛋白质标准品，可在不同生物样品之间对金属蛋白质的丰度进行定量比较。该技术有望为揭示金属蛋白质在神经退行性疾病以及其他与痕量元素失衡相关的疾病中的作用提供重要线索。

引言

必需金属在正常的生物功能中发挥着至关重要的作用，包括作为第二信使通路、代谢通路以及细胞器功能的参与者。据估计，所有蛋白质中有30%为金属蛋白1，所有酶中有50%为金属酶2。金属酶利用这些微量元素作为辅因子，以催化化学反应、稳定蛋白质结构，并发挥诸如第二信使等调控作用。在神经退行性疾病研究中，最受关注的微量元素包括铜、铁和锌3。这些金属被认为参与多种疾病通路，其稳态失衡可能产生不利影响。例如，超氧化物歧化酶（SOD）的金属状态直接影响家族性肌萎缩侧索硬化症（ALS）转基因小鼠模型的寿命和表型4。在阿尔茨海默病中，金属蛋白质组学技术已被用于发现血浆中转铁蛋白的金属结合能力下降5。这些研究凸显了金属蛋白在疾病过程中可能发挥的重要作用。

直接从生物组织中研究金属蛋白是一个正在发展的领域。尽管一些金属酶已被表征，但大多数金属蛋白仍尚未被表征或未知6。测定金属蛋白的主要挑战之一是需要维持蛋白质的天然状态7。传统的自下而上蛋白质组学技术依赖于将蛋白质消化为肽段，该过程会破坏金属与其结合蛋白之间的非共价相互作用，因此无法获得有关蛋白质金属状态的信息。

解决这一问题的方法之一是采用尺寸排阻色谱联用电感耦合等离子体质谱技术8,9（SEC-ICP-MS）。该方法可提供有关蛋白质近似大小及其结合金属元素的信息10。此外，尺寸排阻是一种温和的色谱技术，能够保持酶或蛋白质复合物的天然状态。使用电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）的一个优势在于其定量能力。通过一组金属蛋白标准品，可实现对生物样品中金属蛋白的绝对定量9,11。该过程通过在一系列金属浓度范围内进样已知的金属蛋白，绘制标准曲线来实现。

本方案展示了如何针对多种金属蛋白标准品实现这一目标。本文旨在为生物领域中广泛研究的金属元素建立标准曲线，包括铁（Fe）、铜（Cu）、锌（Zn）、碘（I）和钴（Co）。

方案

1. 缓冲液和样品的制备

  1. 准备 500 ml 缓冲液，200 mM 硝酸铵，pH 7.6–7.8（用氨水（NH₄OH）调节 pH）4OH）中加入铯（Cs）和锑（Sb），使其终浓度为10 ppb。使用铯和锑作为内标，以监测ICP-MS响应信号的漂移。使用前经0.22 μm滤膜过滤缓冲液。
  2. 根据样本类型（液体、组织或细胞培养物）制备样本。
    1. 对于需要均质化的样本（例如, 组织或细胞），确保不含去污剂。样品制备时使用 Tris 缓冲液。也可使用磷酸盐缓冲液，但其可能随着时间推移或经历冻融循环后对金属蛋白质组产生不利影响12.
    2. 通过手动Dounce匀浆器或超声处理5分钟，对组织或细胞培养样品进行匀浆 使用含蛋白酶抑制剂（不含乙二胺四乙酸（EDTA））的Tris缓冲盐溶液（50 mM Tris pH 8.0，150 mM 氯化钠（NaCl））。
    3. 在16,000 × g离心5分钟以澄清匀浆。收集上清液。将样品置于4 °C保存。
      注意：所有样品在装入高效液相色谱（HPLC）小瓶前必须进行离心，以防止颗粒物堵塞尺寸排阻色谱（SEC）柱。
  3. 在各样品间标准化上样到色谱柱的总蛋白量。使用微量紫外分光光度计在280 nm处测定蛋白浓度。13上样量为20至150 µg蛋白质。通常进样体积范围为2 - 80 µl。 根据样品浓度而定。
    1. 使用蒸馏水清洁微量紫外分光光度计的样品臂，然后加载样品。样品臂是用于加载蛋白质样品的区域。
    2. 用2 µl样品对仪器进行空白校正 样品缓冲液。然后，上样 2 µl 将每个样品点样至检测臂，于280 nm处测定吸光度。
    3. 测定浓度。对于粗提蛋白质样品，使用消光系数 1 Abs = 1 mg/ml。为确定样品中蛋白质的浓度，应用比尔-朗伯定律 A = ε × l × c，其中 A 为吸光度，ε 为消光系数，l 为光程（单位：厘米），c 为浓度。

2. 使用电感耦合等离子体质谱法对金属蛋白标准品进行批量分析

  1. 按照制造商的规程对仪器进行预热和调谐。
  2. 仪器预热并调谐完成后，进行整体ICP-MS分析。
    注意：纯化的金属蛋白储备液通常在测量前需要稀释。标准品中的金属浓度可根据已知的蛋白质:金属化学计量比以及估算的蛋白质浓度进行估计。该信息可用于确定适当的稀释倍数，以使样品浓度落在标准曲线的范围内。
    1. 使用1%硝酸将金属蛋白标准品——甲状腺球蛋白、铁蛋白、铜蓝蛋白、Cu/Zn超氧化物歧化酶（SOD）和维生素B12——稀释，确保其浓度落在0 - 500 µg/L范围内。为达到此范围内的标准品浓度，稀释倍数不应超过1:20。如需，可先用水进行系列稀释，再进行最终稀释。
    2. 设置进样顺序。首先分析七个校准点，其浓度范围为0 - 500 µg/L，随后分析金属蛋白标准品。七个校准点分别为0、1、5、10、50、100和500 µg/L。
    3. 选择目标元素。此处选择Fe、Cu、Zn、Co和I，因为这些是蛋白标准品所结合的元素。在采集方法中，打开元素选择选项卡，添加待分析的元素及其相应的同位素质量数。
    4. 运行样品分析，仪器及配套软件将自动为每种待测元素生成校准曲线。软件通过将检测到的金属的计数/秒 （counts/sec）与标准品中应含有的金属量（以µg/L表示）作图，从而生成校准曲线。利用这些校准曲线确定未知样品中金属的浓度。
      注意：软件利用校准曲线确定每种金属蛋白标准品中金属的浓度。
    5. 根据整体分析结果，制备包含哺乳动物组织中三种最丰富的痕量元素的金属蛋白标准品混合液，其中包含Cu/Zn超氧化物歧化酶（SOD），稀释至铜和锌的浓度均为200 µg/L，以及铁蛋白（FTN），最终铁浓度为2,000 µg/L。

3. 高效液相色谱系统设置与尺寸排阻色谱柱的平衡 

注意：本步骤应与上一步骤同时进行，因为两者均需要约 1 - 1.5 小时 完成。

  1. 使用步骤1.1中配制的缓冲液冲洗HPLC泵，并以5 ml/min的流速冲洗泵5分钟 。
  2. 系统冲洗完毕后，将流速设为0.1 ml/min，并连接尺寸排阻色谱柱（4.6 × 300 mm，3 µm，150 Å）。
    注意：使用润湿的管路与色谱柱连接，可避免连接过程中产生气泡。
  3. 使用PEEK管将色谱柱的另一端连接至紫外检测器，并设置检测波长为280 nm。
  4. 逐步以0.05–0.1 ml/min的增量提高色谱柱流速，直至达到最终流速0.4 ml/min。在此过程中，检查色谱柱管路连接处是否泄漏。通过软件中色谱图上的压力曲线监测系统压力，确保其不超过色谱柱的耐压上限。
  5. 让色谱柱在目标流速下平衡5– 10个柱体积。平衡完成后，连接仪器以进行样品分析。
  6. 建立HPLC方法，以0.4 ml/min的流速在色谱柱上运行泵缓冲液A，持续15分钟。

4. 尺寸排阻-电感耦合等离子体质谱法的设置与运行 

注意：不同仪器和型号的操作程序可能有所不同。请联系仪器技术专家，了解有关所用ICP-MS配置的更多信息。

  1. 在更改硬件设置之前，先将ICP-MS置于待机模式。
    1. 进入待机模式后，关闭自动进样器的通信，并将样品引入方式更改为 "其他".
      注意：根据软件和硬件配置的不同，选择 "高效液相色谱法" 可作为样品引言来源使用。请联系仪器技术专家，确认此选项是否可用。
  2. 使用PEEK管（内径0.13 mm）将紫外检测器的流出液直接连接至ICP-MS的雾化器。
  3. 重新启动ICP-MS电源，使仪器预热10至20分钟。
  4. 等离子体点燃后，将ICP-MS的远程电缆连接到HPLC自动进样器的背面。必须在等离子体点燃后进行此操作；否则，由于ICP-MS未开启，HPLC系统将自动关闭。
  5. 将ICP-MS方法更改为用于LC-ICP-MS的数据采集模式。
    1. 将采集方法从光谱模式更改为时间分辨采集（TRA）。
    2. 选择待分析元素，包括 Fe、Cu、Zn、Co、I 以及其他感兴趣的元素，并设置积分时间（通常为 0.05 - 0.3 秒）。在选定目标元素后，调整采集时间以匹配色谱运行时间。例如， 900 秒，用于 15 分钟的色谱运行。
    3. 手动调节ICP-MS的灵敏度和碰撞池氦气（He）流速，调节时使用含有Cs和Sb的色谱缓冲液流动。He流速通常比用于整体分析时低约1 ml/min。待金属离子计数稳定且相对标准偏差（RSD）值低于5%后，系统即可投入使用。
  6. 在高效液相色谱（HPLC）和电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）软件程序中分别创建样品运行列表。样品运行列表应包含各样品的进样顺序以及数据保存时所使用的文件名称。检查两个程序中样品总数是否一致。
  7. 在进行高效液相色谱（HPLC）之前，先启动电感耦合等离子体质谱（ICP-MS）的样品批次，因为HPLC进样会触发ICP-MS开始采集数据。若操作顺序不当，将导致数据缺失。
  8. 通过进样不同体积的 SOD 和 FTN 混合标准品，生成校准曲线点，进样浓度范围为 200 µg/L 至 6,000 µg/L（以柱上进样量计），用于 Cu & Zn 为 2,000 µg/L 至 60,000 µg/L（Fe）。进样体积范围为 1 至 30 µl。
    注意：这些浓度范围涵盖了在复杂匀浆液中通常观察到的 Fe、Cu 和 Zn 的浓度。对于仅含有纯化蛋白的样品，应根据实际情况相应调整标准曲线的最大浓度范围，因为蛋白结合的金属含量可能需要更小或更大的检测范围，此类样品受其他因素的干扰较少。
  9. 分析每种未知样本的组织、血浆或细胞培养物。

5. 数据分析、处理与可视化

  1. 将数据以逗号分隔值（csv）文件格式存储，并根据需要加载到处理程序中。
  2. 为控制仪器漂移，将每种元素每秒的计数除以铯（Cs）或锑（Sb）每秒的计数。
  3. 为每种元素生成校准曲线。
    1. 在首选的数据分析软件中进行峰面积积分，确定每次进样中对应于金属结合的金属蛋白的金属峰下的面积。
    2. 将金属峰下的面积对每次运行中注入色谱柱的金属总量作图，铜（Cu）和锌（Zn）为 200 - 6,000 µg/L，铁（Fe）为 2,000 - 60,000 µg/L。按照软件协议进行线性回归分析。
    3. 将线性回归分析所得的斜率结果作为换算因子，将每秒计数转换为皮克每秒（pg/sec）。将色谱图中每个每秒计数的数据点除以该直线的斜率值。
  4. 以皮克每秒（pg/sec）为单位对色谱时间作图。确定目标峰下的面积。峰下面积代表该蛋白 所结合的金属总量，单位为皮克（pg）。
  5. 根据已知金属蛋白的分子量及其洗脱时间建立校准曲线。利用该曲线估算复杂样品中蛋白峰的大小。

结果

使用金属结合蛋白标准品可对凝胶过滤色谱柱进行校准。图1A展示了基于所结合金属（Fe、Co、Cu、Zn 和 I）的标准品——甲状腺球蛋白、铁蛋白、铜蓝蛋白、Cu/Zn 超氧化物歧化酶（SOD）和维生素B12的洗脱曲线。图1B展示了基于蛋白标准品的分子量及其洗脱时间绘制的凝胶过滤色谱柱校准曲线，以洗脱体积（Ve）与色谱柱空体积（Vo）的比值形式表示。用于生成该标准曲线的蛋白质包括刀豆球蛋白A、卵清转铁蛋白、铜蓝蛋白、铁蛋白、超氧化物歧化酶（SOD）和甲状腺球蛋白。

图 2A 显示在色谱柱上进样 2,000 - 60,000 pg Fe 范围内铁蛋白的洗脱情况 图 2D 回归分析是使用峰面积进行的。 图2B 和 2C Cu/Zn SOD 中 Cu 和 Zn 的洗脱曲线 2E 和 2F 使用峰面积生成的回归分析。回归分析的结果用于将原始数据（单位：counts/sec）进行转换 至 pg/秒 因此可定量测定与蛋白质结合的金属含量。换算方法是将每秒计数（counts/sec）相除 线性回归的斜率例如，334.6（计数/秒）×（秒/皮克）铜。

如前所述，该技术可用于鉴定复杂生物样品中的金属蛋白。已有研究对人脑组织和血浆样本应用了该技术，其结果分别如图3和图4所示。人脑样本经SEC-ICP-MS分离的结果显示在图3A-3C中，每张图代表一种不同的目标金属（Cu、Zn或Fe）。图4A-4C展示了对人血浆样本应用该技术所获得的检测信号 。样本的复杂性和丰度会影响所观察到的峰的数量。与预期一致，血浆中的金属蛋白种类较少，主要以铜蓝蛋白和转铁蛋白为主。

figure-results-1
图1. 尺寸排阻色谱-电感耦合等离子体的校准 - 利用已知金属蛋白进行质谱分析 (A基于各自金属的金属蛋白标准品的洗脱曲线。B) 蛋白质标准品甲状腺球蛋白（i）、铁蛋白（ii）、铜蓝蛋白（iii）、伴清蛋白（iv）、Cu/Zn SOD（v）和刀豆球蛋白A（vi）的分子量校准曲线。 请点击此处以查看此图的放大版本。

figure-results-2
图2. 利用铁蛋白和Cu/Zn SOD作为金属蛋白标准品，测定复杂生物样品中与金属蛋白结合的铜、铁或锌的含量。（A）铁蛋白在2,000 - 60,000 µg/L铁浓度范围内的洗脱曲线。（B）和（C）分别为Cu/Zn SOD在200 - 6,000 µg/L铜和锌浓度范围内的洗脱曲线。（D）、（E）和（F）分别为铁、铜和锌的回归分析结果。请点击此处查看该图的放大版本。

figure-results-3
图3. 人脑中的铜、铁和锌金属蛋白质组。（A）铜的洗脱曲线（B）铁的洗脱曲线（C）锌的洗脱曲线。每种金属对应的蛋白质标准品的洗脱峰以黑色曲线显示，其分子量标注在图下方。请点击此处查看该图的放大版本。

figure-results-4
图4. 人血浆中铜、铁和锌的金属蛋白质组。（A）铜的洗脱曲线（B）铁的洗脱曲线（C）锌的洗脱曲线。每种金属对应的蛋白质标准品的洗脱峰以黑色曲线表示，其分子量标注在图下方。请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

确保蛋白质处于天然状态，需要特别注意所用缓冲液及样品的保存条件。并非所有层析技术或样品制备方法都适用。在整个样品制备和层析过程中，所用缓冲液必须不含金属螯合剂，并应使用能够模拟生理pH值和盐浓度的缓冲液。需要避免的其他条件包括加热样品或添加蛋白质变性剂（例如，尿素）。应尽量减少冻融循环次数。所选缓冲液与二价金属结合的能力也很重要，因此通常选择Tris或硝酸铵缓冲液，而非磷酸盐缓冲液。

与其他色谱技术相比，凝胶过滤色谱的分辨率和峰容量较低，这是该技术的主要局限性。然而，凝胶过滤色谱操作温和的特性对于维持蛋白质的天然状态、从而保留相对较弱的金属-蛋白质结合至关重要。为保持蛋白质的天然状态，必须特别注意样品的处理，包括限制冻融循环次数，避免使用金属螯合剂（例如，EDTA）或变性盐和去污剂。 

如果在复杂的样品中，该技术的低分辨率会影响与特定蛋白质结合的金属含量的定量能力，因为所观察到的峰将包含多种蛋白质。因此，通过峰面积积分所确定的金属含量仅反映在此洗脱时间点所有洗脱蛋白质结合的金属总量，而不仅仅是一种特定蛋白质的金属含量。为了克服这一局限性，需要在天然条件下对目标蛋白质进行进一步纯化，从而能够更准确地定量与该蛋白质结合的金属含量。该技术的另一个潜在局限性是蛋白质可能因不可逆地结合到色谱柱上而发生损失。为确定是否发生此类情况，应进行回收率实验，即分析从色谱柱洗脱出的蛋白质量，以判断其是否与上样量相符。同样，也可通过整体ICP-MS测量洗脱组分和起始材料中的金属含量来进行评估。色谱柱的回收率可能因实验条件不同而有所差异，但已有研究表明，从尺寸排阻色谱柱中完全回收蛋白质是可行的9。因此，重要的是需验证在所使用的操作条件下是否存在任何损失。

对实验方案的修改可能涉及所使用的金属蛋白标准品以及待分析的元素。所采用的金属蛋白标准品类型将根据所关注的元素而有所不同。对于铜（Cu）、铁（Fe）和锌（Zn）等元素，可分别使用超氧化物歧化酶（SOD）和铁蛋白（ferritin）。任何其他具有已知化学计量比的金属蛋白也可使用，本文已列出若干示例。

使用该技术可能产生的一大问题是ICP-MS炬管中盐晶体的积聚。为防止盐晶体积聚，每通过系统500至1,000 ml 缓冲液后，或通过目视检查确定炬管需要清洗时，均应用蒸馏水冲洗炬管。另一个可能出现的问题是样品锥和提取锥清洁度下降速度加快。这些部件需按照制造商的规程定期清洗。

初始样品制备是本实验方案中最关键的步骤。如果蛋白质-金属复合物发生任何改变，所获得的信息将无效。这是该技术的主要局限性之一；此外，使用低分辨率的尺寸排阻色谱柱只能提供对生物学中金属蛋白真实复杂性的有限解析。

此处所述技术有助于拓展对生物体金属蛋白质组的认识。整体分析仅能粗略反映样品中金属含量的变化。除需考虑的一般因素外，该技术提供了一种可用于定量与蛋白质结合的金属含量的工具。 以及通过比较获得的图谱来鉴定存在差异的金属蛋白。该技术可用于识别不同疾病状态之间的差异。所鉴定出的金属蛋白可进一步研究，以帮助确定其在疾病过程中的作用。联用ICP-MS技术在确定含杂原子（如铂、碘或铜）药物的作用机制方面具有广阔的应用前景，因为ICP-MS可用于鉴定药物结合的蛋白质。

披露

作者无任何利益冲突需要披露

致谢

我们感谢维多利亚州政府运营基础设施支持计划、澳大利亚研究理事会合作项目计划（与安捷伦科技公司合作）、澳大利亚国家卫生与医学研究理事会、维多利亚脑库、精神健康合作研究中心以及神经蛋白质组学设施提供的支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Agilent 1290 Infinity 二元泵AgilentG4220A
Agilent 1290 Infinity 自动进样器AgilentG4226A
Agilent 1200 系列自动进样器恒温器AgilentG1330B
Agilent 1290 Infinity 恒温柱温箱AgilentG1316C
Agilent 1290 Infinity 可变波长检测器AgilentG1314E
Agilent 7700 ICP-MSAgilentG3282A
 氢氧化铵，痕量金属级   Sigma338818
 硝酸铵 Sigma 256064实验当天新鲜配制 200 mM 溶液
 锑 Choice analytical 10002-3 
 铜蓝蛋白 Sigma
 铯 Choice analytical 100011-1 
 完全型，无 EDTA 蛋白酶抑制剂  Roche11873580001
 伴清蛋白 SigmaC7786
 来自刀豆（Canavalia ensiformis）的刀豆凝集素 A SigmaL7647
 Cu, Zn 超氧化物歧化酶 SigmaS9697
 铁蛋白 SigmaF4503
 ICP-MS 多元素校准标准品 AccuStandard用 1% 硝酸稀释至所需浓度
 微量紫外分光光度计 Thermo Scientific
 65% 硝酸 Millipore100441稀释至 1% 后使用
 peek 管路  Agilent5042-6461
 尺寸排阻色谱柱 BioSEC-3 PLC 柱，4.6 × 300 mm，3 μm，150 Å Agilent5190-2508
 氯化钠 Chem SupplySA046
 三羟甲基氨基甲烷盐酸盐 ICN Biomedicals inc. 103130
 甲状腺球蛋白 SigmaT9145
 维生素 B12 SigmaV2876

参考文献

  1. Holm, R. H., Kennepohl, P., Solomon, E. I. Structural and Functional Aspects of Metal Sites in Biology. Chem Rev. 96, 2239-2314 (1996).
  2. Andreini, C., Bertini, I., Cavallaro, G., Holliday, G., Thornton, J. Metal ions in biological catalysis: from enzyme databases to general principles. J Biol Inorg Chem. 13, 1205-1218 (2008).
  3. Roberts, B. R., Ryan, T. M., Bush, A. I., Masters, C. L., Duce, J. A. The role of metallobiology and amyloid-beta peptides in Alzheimer's disease. J Neurosci. 120 (Suppl 1), 149-166 (2012).
  4. Roberts, B. R., et al. Oral Treatment with CuII (atsm) Increases Mutant SOD1 In Vivo but Protects Motor Neurons and Improves the Phenotype of a Transgenic Mouse Model of Amyotrophic Lateral Sclerosis. J Neurosci. 34, 8021-8031 (2014).
  5. Hare, D. J., et al. Decreased plasma iron in Alzheimer's disease is due to transferrin desaturation. ACS CHEM NEUROSCI. , (2015).
  6. Cvetkovic, A., et al. Microbial metalloproteomes are largely uncharacterized. Nature. 466, 779-782 (2010).
  7. Barnett, J., Scanlan, D., Blindauer, C. Protein fractionation and detection for metalloproteomics: challenges and approaches. Anal Bioanal Chem. 402, 3311-3322 (2012).
  8. Fernandez Sanchez, L., Szpunar, J. Speciation analysis for iodine in milk by size-exclusion chromatography with inductively coupled plasma mass spectrometric detection(SEC-ICP MS). J. Anal. At. Spectrom. 14, 1697-1702 (1999).
  9. Manley, S., Byrns, S., Lyon, A., Brown, P., Gailer, J. Simultaneous Cu-, Fe-, and Zn-specific detection of metalloproteins contained in rabbit plasma by size-exclusion chromatography-inductively coupled plasma atomic emission spectroscopy. J Biol Inorg Chem. 14, 61-74 (2009).
  10. Richarz, A. N., Brätter, P. Speciation analysis of trace elements in the brains of individuals with Alzheimer's disease with special emphasis on metallothioneins. Anal Bioanal Chem. 372, 412-417 (2002).
  11. Hare, D. J., et al. Profiling the iron, copper and zinc content in primary neuron and astrocyte cultures by rapid online quantitative size exclusion chromatography-inductively coupled plasma-mass spectrometry. Metallomics. 5, 1656-1662 (2013).
  12. Balkhi, S. E., et al. Human Plasma Copper Proteins Speciation by Size Exclusion Chromatography Coupled to Inductively Coupled Plasma Mass Spectrometry. Solutions for Columns Calibration by Sulfur Detection. Anal Chem. 82, 6904-6910 (2010).
  13. Desjardins, P., Hansen, J. B., Allen, M. Microvolume Protein Concentration Determination using the NanoDrop 2000c Spectrophotometer. J Vis Exp. , e1610(2009).

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

ICP MS SEC ICP MS

相关文章