方法文章

采用组合运用各种方法，定义质膜交付在轴突分支和神经元形态发生中的作用

DOI：

10.3791/53743

⸱

2016年3月16日

 ,  , 
1Curriculum in Neurobiology, The University of North Carolina at Chapel Hill, 2Department of Cell Biology and Physiology, The University of North Carolina at Chapel Hill

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

在神经发育过程中，生长的轴突通过细化轴突分支延伸到多个突触伙伴。轴突分支受细胞外引导线索（如 netrin-1）的促进，并导致轴突质膜表面积急剧增加。Netrin-1 依赖性轴突分支可能涉及质膜扩张的时间和空间控制，其成分通过胞吐囊泡融合提供。在这些融合事件之前形成 SNARE 复合物，包括 v-SNARE，例如 VAMP2（囊泡相关膜蛋白 2）和质膜 t-SNARE、syntaxin-1 和 SNAP25（突触体相关蛋白 25）。本文详细介绍了一种多管齐下的方法，用于检查 SNARE 介导的胞吐作用在轴突分支中的作用。组合方法的优势在于以一系列空间和时间分辨率采集数据，从单个神经元中单个囊泡融合事件的动力学到培养神经元群中的 SNARE 复合物形成和轴突分支。该方案利用已建立的生化方法来测定内源性 SNARE 复合物的水平和表达 pH 敏感 GFP （VAMP2-pHlourin） 标记的 VAMP2 的皮层神经元的全内反射荧光 （TIRF） 显微镜，以识别单个神经元中胞外切活性的 netrin-1 依赖性变化。为了阐明 netrin-1 依赖性分支的时间，在数小时内使用单个神经元的延时微分干涉对比 （DIC） 显微镜。固定细胞免疫荧光与裂解 SNARE 机制并阻断胞吐作用的肉毒杆菌神经毒素配对表明 netrin-1 依赖性轴突分支需要 SNARE 介导的胞吐活性。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

最近的估计表明，人脑包含 1011 个神经元和 1014 个突触连接1，这凸显了轴突分支在体内的重要性。细胞外轴突引导线索（如 netrin-1）引导轴突找到合适的突触伴侣并刺激轴突分支，从而增加突触容量2-5。Netrin-1 依赖性轴突树枝化涉及大量的质膜扩张6，我们假设这需要通过 SNARE 复合物依赖性胞吐囊泡融合7 递送额外的膜成分。

研究 SNARE 介导的胞吐作用在 netrin-1 依赖性轴突分支中的作用受到几个因素的复杂化。首先，皮层神经元的异质性增加了识别显著影响所需的样本量，使成像等单细胞技术复杂化。其次，尽管生化技术允许观察在种群水平上发生的变化，但它们缺乏在轴突分支的时间范围内将质膜扩张定位到轴突所需的时间和空间分辨率。最后，尽管轴突分支在数小时内形成，但导致轴突延伸的细胞变化可能在几分钟内开始，并在几秒钟内发生，从而扩展了实验考虑的时间范围。

我们概述了一种多技术方法，用于解决胞吐作用和轴突分支的这些不同的时间和空间尺度，从而增强我们对基本细胞机制的理解。利用这些方法提供了支持 SNARE 介导的胞吐作用在轴突分支中的关键作用的证据。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

研究伦理的声明 :所有涉及此详述动物实验是受规则和UNC委员会动物护理的法规和标准NIH为照顾和使用实验动物。

1.准备和游离皮层神经元的电镀

  1. 通过CO安乐死定时怀孕女2吸入颈椎脱位。从每个半球胚胎天15.5（E15.5）小鼠和microdissect皮质的头骨取下整个大脑。有关胚胎小鼠皮层的显微请Viesselmann 等 8详细说明。
  2. 放置在1ml​​解剖媒体的不超过4皮质在无菌1.6毫升微型管。加入120微升10X胰蛋白酶和翻转试管3 - 5次混合。
  3. 使用血球，细胞计数种子细胞培养皿。注意事项:1半球皮质APPR提供oximately 3000000细胞。
    1. 对于耐SDS SNARE复合生化检测，每板35mm培养皿6000000细胞，并利用每个条件两道菜。注:这是通过比较多个条件时，使用6孔板简化。
    2. 为支化测定法，对硝酸板神经元在15万的密度以每35mm培养皿250,000个细胞的密度洗涤圆形盖玻片，对轴突分枝板的DIC成像。这些密度避免拥挤和简化分析。
  4. 活细胞的TIRF显微镜，悬浮每转2000000神经元在RT核转染溶液。
    1. 加入100微升细胞悬浮液，以微管，根据制造商协议9含有VAMP2-pHlourin表达质粒电穿孔的10微克带有nucleofector。
    2. 转染后立即加入500μl胰蛋白酶淬火介质，在书房移除试管和细胞板停牌每35毫米PDL镀膜玻璃底菜400,000个单元格的减到。
  5. 板上的所有皮层神经元在2毫升无血清培养基。

2. SNARE复合体形成分析

注:耐SDS SNARE复合物加工成最初描述与10下文详述的修改进行分析。为了证实有效的替代抗体，在这里使用的那些，请参阅材料部分。

  1. E15.5刺激皮层神经元2天体外 （DIV）250毫微克/毫升导蛋白1或假控制裂解前1小时。
  2. 前处理的样品，凉爽离心机至4℃，并设置水浴温度至37℃，并加热块到100℃。
  3. 从孵化器中取出细胞的菜肴，置于冰上。
    1. 从细胞中吸出培养基，替换为约2ml冰冷的磷酸盐缓冲盐水（PBS）轻轻2次，1 - 每次洗涤2分钟。
    2. 对于该测定，使用每个COND 2孔银行足球比赛。
    3. 抽吸PBS从条件的第一阱和替换用250微升匀浆缓冲液。留在冰上5分钟，然后使用细胞升降机，匀化细胞在冰上。
    4. 从相同的条件下的下一个孔吸出PBS和最近匀浆混合物添加到孔中。这会增加蛋白浓度。重复所有条件。
    5. 完成后，吸管匀浆溶液到预先冷却1.6毫升微型管在冰上，加入20％的TritonX-100，达到1％的TritonX-100的最终浓度。磨碎，同时尽量减少泡沫与1000微升吸管搅拌了10倍。
  4. 在冰上孵育管2分钟以溶解的蛋白质。在6,010 RCF在4℃下培养后，离心10分钟以沉淀非溶解材料。移动裂解上清液进入冰冷冻新1.6毫升管。
  5. 用Bradford法进行11蛋白浓度分析和稀释样品到国际泳联3 L蛋白浓度 - 5毫克/毫升剩余补充有1％的TritonX-100和5×样品缓冲液补充有B-巯基乙醇（BME）的匀浆缓冲液。
  6. 平均分配每个实验样品放入试管2。在37℃下进行30分钟（SNARE复合物），以及其他的在100℃下进行30分钟（SNARE单体）孵育一个样本。反转管间歇性地将样本保持在溶液中。
  7. 在-20℃冷冻样品直至准备通过SDS-PAGE分离。前用标准技术通过电泳样品，再沸腾先前煮沸样品在100℃5分钟，但在RT解冻37℃的样品。
  8. 样品的运行重复（30 - 40微克每个样品的蛋白质）在两个8％和15％的凝胶;的8％提供了复杂的理想分离，而15％被用于量化SNARE蛋白单体（SNAP-25〜25kDa，VAMP2〜18kDa，突触-1〜35kDa的）。在70 v使电源直到染料行是通过STAC王露和增加电压90V。运行凝胶，直到染料逃跑。
  9. 为了保持单体，使用冷转移缓冲液，用20％甲醇（MeOH）加入，在70 V代表45分钟传送在冰上蛋白至0.2μm硝酸纤维素膜上。
  10. 在盖菜2小时到0干膜/ N在室温（O / N提供了最好的结果）。
  11. 块SNARE，在10％牛血清白蛋白（BSA）复合膜在RT 1小时。
  12. 以1:1的稀释度制备一抗（识别特定SNARE复合组件）:1000和探针O / N在4℃的旋转振荡器上。
    1. 冲洗在Tris缓冲盐水加0.1％吐温20（TBS-T），每次5分钟，3次印迹。
  13. 以1:1的稀释度制备的荧光第二抗体的解决方案:在TBS-T 20,000在1％BSA和探头1小时，覆盖在RT。 1小时后，重复步骤2.12.1。
  14. 荧光扫描机的图像印迹配有软件套件和定量两种SNARE蛋白合作mplex（以上40kDa免疫反应条带）和单体谱带（25 kDa的，18kDa的，35kDa的用于SNAP-25，VAMP2免疫反应条带和突触-1，分别地）使用制造商的说明用于绘制矩形的ROI。

3.成像胞吐通过TIRF显微镜活动

注意:此协议需要专门显微镜设备，包括一个环境室，以保持温度，湿度和CO 2，配备有表面荧光照明，高倍率/高数值孔径（NA）的TIRF目标，一个自动XYZ台一个倒置的TIRF显微镜，和敏感电荷耦合器件（CCD）检测器。该协议使用配备了100倍1.49NA TIRF目标固态491 nm激光和电子倍增CCD（EM-CCD）的全自动倒置显微镜。所有设备由成像和激光控制软件控制。此前开始的ENVIR成像协议电源onmental室，舞台，灯，计算机和摄像机。

  1. 成像软件中选择目标。一旦该目标是到位，拧紧领围绕目标加热器。
  2. 确认目标是在舞台插槽固定阶段孵化器之前完全降低。倒入蒸馏水注入阶段培养箱入口均匀，以防止溢出。
  3. 打开孵化系统。打开阀门到CO 2罐和确认的压力是适当的每个制造商的说明该系统。允许腔一些时间来达到5％的CO 2和37℃。之前加入的摄像培养皿，放置一个空盘在孵化器，以避免对目标冷凝水。
  4. 功率激光源。
  5. 开阶段培养箱和浸油添加到该透镜。将样品中的孵化器，并与稳定的武器或一盘菜的重量稳定。提高物镜直到油使与样品的底部接触。 SWITCh至透射光照明，并通过目镜发现神经焦平面。
  6. 启动激光软件并连接到激光控制软件。设置照度广角并选择正在使用的目标（建议100X 1.49 NA TIRF）。样品的设定折射率（细胞〜1.38）。通过取消选中"TTL"为491 nm激光调节激光强度。调整滑块到100，然后把它回落到一个值之间20 - 40％。重新检查"TTL"。
  7. 在透射光照明再次聚焦样本。转到成像软件，并选择491 nm激光照明和开启快门。细调整天花板上的激光的焦点和中心的点与除去冷凝器闭合场光阑的中心。将聚光光学板凳上倒挂，以免划伤镜头。
  8. 更换冷凝器和去TIRF软件，并设置穿透深度（PD）到110纳米。从切换广角照度TIRF ILLUM萌发的模式进行成像。
  9. 查找VAMP2-phluorin采用宽视场落射荧光与啶光源表达通过目镜细胞。
    1. 调整摄像参数（​​曝光时间，增益和激光功率），使用最小的曝光时间和激光强度以减少漂白和光毒性（例如最大化信噪比和动态范围:50之间的曝光 - 100毫秒，用15 - 30获得30％的最大激光功率）。
    2. 每单元设置连续自动对焦。获取图像时光倒流与并购发生的每0.5秒5分钟设置。为的netrin-1刺激的情况下，1的netrin-加入500纳克/毫升的细胞的培养皿在层流罩和盘返回到培养箱中成像前1小时。
  10. 要在开放的ImageJ图像堆栈通过将文件拖动到窗口或将文件>打开>文件名 ​​（ 图量化每个单元面积和时间归胞吐事件的频率0; 2A插图1）。
    1. 要除去稳定的荧光信号，不代表囊泡融合事件，创建一个使用图像>栈> Z-项目>投影类型整个堆栈的平均ž预测:平均强度。从每个图像使用过程中的缩时​​>图像计算器减去这意味着图像> Image1的:你的栈操作:减去IMAGE2新创建的平均ž投影。这强调胞吐事件（ 图2A插图2 - 3）。
    2. 由伯爵眼外融合的事件。胞吐事件被定义为受衍射限制的荧光信号，从而迅速扩散作为VAMP2-phluorin质膜（ 图2A插图6）内扩散的外观。
    3. 使用阈值命令用图片来突出第一图像>调整>阈值>直到整个细胞是门槛凸显（ 图2A插图7 - 8）调整滑块。
    4. 在安娜lyze，选择SetMeasurements和检查区和显示标签。选择使用棒跟踪工具，然后按"M"来衡量（ 图2A插图7 - 8）阈值的蜂窝区。
    5. 转让双方外融合事件计数，细胞面积测量，并经过成像时间到电子表格来计算（ 图2A插图9）的胞吐事件/毫米2 /次号码。

4.微分干涉对比（DIC）轴突分支的显微缩时

注:完整的协议与示范的一般方法DIC成像可用12。虽然这种协议利用DIC时，也可以使用其它的透射光显微术的方法为相同的目的（例如:相衬）。

  1. 在2 DIV，包含预热的环境室未转染的神经元发生玻璃底菜成像，以保持潮湿ENV用5％的CO 2和37℃ironment。利用最佳的图像质量和分辨率装有60X计划复消色差透镜的显微镜，1.4的NA DIC物镜和高NA冷凝器。
  2. 调整焦平面发现通过使用透射光照明目镜神经元。
  3. 在使用图像软件多区域采集功能，找到并节省至少6个细胞的XYZ位置。阶段的位置，使的视图以取得最佳效果的领域内感兴趣拟合神经元。
    1. 250纳克刺激/ ml的导蛋白1，然后按"启动多区域获取"。在每个位置顺序地获取图像每20秒24小时，暂停采集和再聚焦是必要的。
  4. 查看使用应用程序中的图像处理软件图像>查看多维数据>打开的文件名。鉴定稳定轴突分支（20微米长）的成像会议期间的形式。用画线工具来测量一个stableaxon branc从在轴突到尖端的基部小时以确保在20微米长度资格得到满足。
    1. 在电子表格中，记录帧号的netrin刺激后当膜的突起中时新生的分支达到20微米的长度，其中分支以后形成以及netrin的刺激后的帧号码的区域开始。
    2. 由20秒乘以突起和分支地层之间的帧的数目来计算每个分支的形成时间。

5.毒素操作和固定细胞免疫荧光

  1. 在2 DIV，治疗中的实验条件下的神经元用250纳克/毫升的netrin-1和/或10nM的A型肉毒毒素（BONTA），其裂解SNARE蛋白SNAP25和有效地抑制SNARE介导的胞吐13，再加上250纳克/毫升netrin- 1。留下一组神经元未处理作为控制条件的。
    注意:BONTA需要用眼和呼吸道的防护的准备和使用时，解决方案。尽快维护所有被污染的材料的生物危险材料和高压灭菌。
  2. 在3 DIV（24小时后处理）抽吸介质，并立即与至少1毫升PHEM修复（详情见表1）更换加热到37℃。孵育在室温黑暗中20分钟。
  3. 用PBS冲洗3倍（以备将来使用密封用封口膜和储存在4°C）。
  4. 在黑暗中，加湿染色室地方盖玻片和透化细胞膜在新鲜稀释的0.2％的TritonX-100的PBS 10分钟（从10％的TritonX-100的库存。制造）。
  5. 除去透化溶液，并用50微升1×的用PBS冲洗。块，用于在30分钟内约10％牛血清白蛋白的50μl的在PBS（BSA-PBS），或10％在RT水煮驴血清在PBS中。
  6. 用1X PBS冲洗一遍。孵育盖玻片在50μl初级抗体（1:1000βIII微管蛋白，以确认神经同一性）在1％BSA-PBS在RT 1小时， 在黑暗中。
  7. 在PBS进行3次5分钟洗涤。孵育盖玻片在50μl光谱上不同的第二抗体对微管蛋白（1:400），和荧光鬼笔环肽（通过激发而异:488鬼笔环肽在1:400，647鬼笔环肽在1:100），在1％BSA-PBS中1小时。
  8. 在1X PBS洗涤3次5分钟并安装到盖玻片幻灯片安装介质。
  9. 从盖玻片和密封用透明指甲油的边缘多余的真空安装介质。
  10. 在具有40X 1.4NA目标，啶能力和EM-CCD倒置显微镜收集广角落射荧光图像。
    1. 手动分析使用ImageJ分支。在开放的ImageJ图像堆栈通过将文件拖动到窗口或将文件>打开>文件名 ​​（ 图4A插图1）。
    2. 使用线>分割线，微量轴突，定义为从体细胞（ 图4A插图2 - 3）延伸的最长的神经突。
    3. 使用分析>工具>投资回报率经理，保存轴突作为跟踪感兴趣的区域。跟踪和保存每个分支轴突，定义为突起≥20微米长。包括在分析（ 图4A插图3 - 4）只有小学支（副产物从轴突发芽直接）。
    4. 按"M"来测量感兴趣的保存区域，并且以像素为单位的长度传输到电子表格，计算在微米的长度。
    5. 划分轴突分支≥20微米长度的次数，通过在微米轴突除以100得到每100μm长度轴突分枝的数目的长度。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

利用体外生物化学技术以测定神经元群体SDS抗性SNARE复合物的量。 图1示出探查SNAP-25，syntaxin1A和VAMP2的耐SDS SNARE复合测定的所得印迹以下完成。

在基底细胞膜TIRF显微镜提供了在单个细胞个体胞吐融合事件的高清晰度的图像。 图2A展示了用于识别VAMP2-phluorin介导的胞吐事件图像分析方法。插图显示作为发生囊泡融合和VAMP2-phluorin质膜内扩散。 图2B示出了在皮层神经元中发生过时间（秒）的胞吐事件的一个例子的单胞吐事件。缩放插图表示胞体，轴突分支，显示spati轴突生长锥此测定的人效用。圆表示单胞吐融合事件，其可以经由TIRF显微镜看到。

的netrin的缩时...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

轴突分支是一个基本的神经发育过程，支撑着哺乳动物神经系统的广泛神经连接。了解局部质膜扩张所涉及的机制对于我们理解正常和病理性神经发育至关重要。使用结合群体水平和单细胞水平方法的多管齐下的方法增强了可重复性并提高了空间和时间分辨率，而不会影响群体水平分析。在单细胞水平上，利用固定细胞和活细胞方法来检查网蛋白依赖性轴突分支具有三重好处：能够在多个实验中收集大样本量，DIC成像的时间分辨率以及使用TIRF显微镜的胞外细胞融合的时空分辨率。

SDS耐药SNARE复合物测定可以测量SNARE活性，从而解释培养中皮质神经元的异质性。SNARE复合物非常稳定;而大多数其他蛋白质复合物通过添加 SDS 解离。SNARE复合物具有抗SDS性，但不耐温。这一特性使得量化SNARE复合物和SNARE单体的量成为可能。由于需要以不同的丙烯酰胺百分比运行多个 SDS-PAGE 凝胶，因此以每孔不低于 600 万个的密度接种细胞以获得足够量的蛋白质非常重要。由于该测定需要常见的实验室试剂、进行蛋白质印迹的能力和内源性SNARE蛋白的抗体，因此这是一种相对具有成本效益且简单的方法，可用于产生有关胞外活性SNA...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者没有什么可透露的。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

RO1 - GM108970（SLG）和F31-NS087837（CW）:这项工作是由美国国立卫生研究院的支持。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
6 孔组织培养处理板Olympus Plastics25-105
玻璃盖玻片Fisher scientific12-545-8112CIR-1.5;必须进行硝酸处理 24 小时，用去离子水冲洗 2 次，并在使用前干燥。必须用 1 mg/ml 聚-d-赖氨酸包被并在接种细胞前冲洗。
Amaxa 核转染溶液LonzaVPG-1001100 ml/转染
Amaxa Nucleofector/电穿孔仪Lonza程序 O-005
35 mm 玻璃底活细胞成像培养皿Matek Corporationp356-1.5-14-C必须涂有 1 mg/ml 聚-d-赖氨酸，并在电镀细胞前冲洗
奥林巴斯 IX81-ZDC2 倒置显微镜 奥林巴斯
Lambda LS 氙气灯Sutter Instruments Company
环境舞台顶部培养箱Tokai Hit
100x 1.49 NA TIRF 物镜奥林巴斯
Andor iXon EM-CCDAndor
Odyssey Licor 红外成像系统LI-COROdyssey CL-X用于扫描印迹
图像工作室软件套件LI-COR用于在 Odyssey Infrared 系统上进行扫描;用于离线分析印迹的 Image Studio lite
林巴斯 Moleculardevices， LLC版本 7.7.6.0所有成像和 DIC 延时分析的软件
CELL TIRF 控制软件奥林巴斯软件用于控制激光进行 TIRF 成像
斐济（Image J）NIHImageJ 版本 1.49t
60x Plan Apochromat 1.4 NA 物镜奥林巴斯
40x 1.4 NA 平面复消色差物镜奥林巴斯
Neurobasal 培养基GIBCO21103-049无血清和胰蛋白酶淬灭培养基的基础溶液
补充剂 B27GIBCO17504-044500 ml/50 ml 无血清培养基和胰蛋白酶淬灭培养基
L-谷氨酰胺35050-0611 ml/50 ml 无血清培养基
牛血清白蛋白Bio Basic 掺入9048-46-810% 溶液，溶于 1x PBS 中，用于封闭盖玻片;5% 溶于 TBS-T 中，用于封闭硝酸纤维素膜。
10x  胰蛋白酶Sigma59427C
HEPESCELLGRO25-060-CL
杜尔贝科磷酸盐缓冲盐水（DPBS）+ Ca + Mg康宁21-030-cm
胎牛血清康宁/CELLGRO35-010-CV
汉克平衡盐溶液（HBSS）康宁/CELLGRO20-021-CV
NaClFisher scientificBP358-10
EGTAFisher scientificCAS67-42-5
MgCl2Fisher scientificBP214-500
TRIS HClSigmaT5941-500
TRIS 碱Fisher scientificBP152-5
N-丙基没食子酸酯MP 生物医学102747
甘油光度级Acros Organics18469-5000
甘油（非光学级）Fisher scientificCAS56-81-5
B-巯基乙基Fisher scientificBP176-100
SDSFisher scientificBP166-500
蒸馏水 GIBCO152340-147
聚-D-赖氨酸Sigmap-7886溶于无菌水中，浓度为 1 mg/ml
肉毒杆菌 A 毒素 BoNTA列表 生物实验室128-A
兔多克隆抗人 VAMP2细胞信号传导11829
小鼠单克隆抗大鼠 Syntaxin1ASanta Cruz Biotechnologysc-12736
山羊多克隆抗人 SNAP-25Santa Cruz Biotechnologysc-7538
小鼠单克隆抗人和 β;III-微管蛋白 CovanceMMS-435P
Alexa Fluor 568 和 Alexa Fluor 488 鬼笔环肽，或 Alexa Fluor 647Invitrogen
LI-COR IR-染料二抗LI-CORP/N 925-32212，P/N 925-68023，P/N 926-68022800 驴抗小鼠、680 驴抗兔、680 驴抗山羊
0.2 μm 孔径硝酸纤维素膜Biorad9004-70-0
吐温-20Fisher scientificBP337-500
甲醇Fisher scientificS25426A
溴酚蓝SigmaB5525-5G
蔗糖Fisher scientificS6-212
多聚甲醛Fisher scientificO-4042-500
Triton-X100Fisher scientificBP151-500
TEMEDFisher scientificBP150-20
40% 双丙烯酰亚胺Fisher scientificBP1408-1
名称Company目录号评论
Alternative 验证抗体
小鼠单克隆抗突触融合蛋白 HPC-1 克隆Sigma AldrichS0664
 小鼠单克隆突触蛋白 2 （VAMP2）突触系统104-211
单克隆 SNAP25突触系统111-011
奥 用于 用于小鼠

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Drachman, D. A. Do we have brain to spare? Neurology. 64 (12), 2004-2005 (2005).
  2. Serafini, T., et al. Netrin-1 Is Required for Commissural Axon Guidance in the Developing Vertebrate Nervous System. Cell. 87 (6), 1001-1014 (1996).
  3. Métin, C., Deléglise, D., Serafini, T., Kennedy, T. E., Tessier-Lavigne, M. A role for netrin-1 in the guidance of cortical efferents. Development. 124 (24), 5063-5074 (1997).
  4. Kennedy, T. E., Serafini, T., de la Torre, J. R., Tessier-Lavigne, M. Netrins are diffusible chemotropic factors for commissural axons in the embryonic spinal cord. Cell. 78 (3), 425-435 (1994).
  5. Sun, K. L. W., Correia, J. P., Kennedy, T. E. Netrins: versatile extracellular cues with diverse functions. Development. 138 (11), 2153-2169 (2011).
  6. Pfenninger, K. H. Plasma membrane expansion: a neuron's Herculean task. Nature Reviews Neuroscience. 10 (4), 251-261 (2009).
  7. Winkle, C. C., McClain, L. M., Valtschanoff, J. G., Park, C. S., Maglione, C., Gupton, S. L. A novel Netrin-1-sensitive mechanism promotes local SNARE-mediated exocytosis during axon branching. The Journal of Cell Biology. 205 (2), 217-232 (2014).
  8. Viesselmann, C., Ballweg, J., Lumbard, D., Dent, E. W. Nucleofection and Primary Culture of Embryonic Mouse Hippocampal and Cortical Neurons. Journal of Visualized Experiments. (47), e2373(2011).
  9. Miesenböck, G., De Angelis, D. A., Rothman, J. E. Visualizing secretion and synaptic transmission with pH-sensitive green fluorescent proteins. Nature. 394 (6689), 192-195 (1998).
  10. Hayashi, T., et al. Synaptic vesicle membrane fusion complex: action of clostridial neurotoxins on assembly. The EMBO Journal. 13 (21), 5051-5061 (1994).
  11. Bradford, M. M. A rapid and sensitive method for the quantitation of microgram quantities of protein utilizing the principle of protein-dye binding. Analytical Biochemistry. 72, 248-254 (1976).
  12. Centonze Frohlich, V. Phase Contrast and Differential Interference Contrast (DIC) Microscopy. Journal of Visualized Experiments. (17), (2008).
  13. Blasi, J., et al. Botulinum neurotoxin A selectively cleaves the synaptic protein SNAP-25. Nature. 365 (6442), 160-163 (1993).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

申请许可以重复使用本 JoVE 文章的文本或图表

申请许可

标签

Axon BranchingNeuronal MorphogenesisSNARE Mediated ExocytosisTIRF MicroscopyVAMP2 pHlourinDIC ImagingWestern BlotBotulinum ToxinNetrin 1 StimulationCortical Neurons

相关文章