皮层肌动蛋白流通过结构照明显微镜数据的时空图像相关光谱量化性T细胞

该实验的目标是图像，并为了在免疫突触（IS）的形成建立流动方向和幅度表征filamentous-（F - ）的肌动蛋白的分子流在活的T细胞，超出衍射极限。这种技术将进行使用结构照明显微镜（SIM）中的全内反射荧光（TIRF）模式，成像的Jurkat T细胞上形成激活盖玻片包被有抗CD3-和抗CD28抗体的人工突触。 T细胞和目标之间的IS形式;抗原呈递细胞（APC）在T细胞受体（TCR）活化^1,2。由于这是在确定是否适应性免疫系统产生要感染的免疫应答的第一步，不正确的响应性对刺激的后果可能导致许多疾病。的T细胞的APC相互作用的重要性是有据可查的，然而，初始TCR SI后成熟的作用（S）为gnal内化是尚未得到充分的理解。

作为细胞骨架被认为有助于两个链接到TCR活化（分子在质膜的移动和信号分子依赖于肌动蛋白骨架^3,4的控制），了解如何细胞骨架重排的空间过程和时间上会阐明的步骤在突触形成的分子重组。 F-肌动蛋白逆行流动被认为是托起TCR集群对免疫突触的中心，这种易位被认为是信号停止和回收至关重要;辅助T细胞活化⁵的良好的平衡。

而标准荧光显微镜是一种灵活的工具，继续提供对多生物学事件，包括细胞 - 细胞相互作用的洞察力，它是由该系统的准确地解决多个荧光团位于比DIFFR接近能力的限制对方的行动限制（≈200纳米）。当细胞内的许多分子事件涉及的分子密集的人口，并表现出无论是在静止状态或在特定的刺激动态重配置，常规光学显微镜不​​能提供完整的图片。

采用超分辨率成像已经使研究人员能够绕过使用多种技术的衍射极限。单分子定位显微镜（SMLM）如PALM和STORM ^6,7-必须解决分子的位置最多约20纳米的精度的能力，然而，这些技术依赖于长采集时间，建立一个图像在许多帧。通常这要求样品是固定的或对结构表现出低移动性，以便单一荧光团不误解为多个点。而受激发射损耗（STED）成像允许超分辨率通过非常有选择性的共焦激发^8，所需的扫描方法可以是在视全细胞字段慢。受激发射损耗还演示显著光毒性更高的分辨率增加所致在耗尽光束的功率。

结构照明显微镜（SIM ^9）提供了一个替代这些方法，能够在标准的荧光显微镜的分辨率增加一倍，并且是与活细胞成像比目前SMLM技术更兼容。它采用较低的激光功率，在一个宽视场系统的视图全细胞领域;提供更高的采集速度，并与标准荧光标记兼容。 SIM的宽视场的性质也允许全内反射荧光（TIRF），用于高选择性激励的利用率，以在<100纳米的轴向尺寸的穿透深度。

图像相关光谱（ICS）是荧光强度相关的波动的方法。 ICS的演变;时空IM年龄相关光谱（STICS ^10）相关的时间和空间内的荧光信号。通过关联像素强度与经由相关函数围绕滞后帧中的像素，将信息获得关于流的速度和方向。为了确保静态对象不与STICS分析干扰，不动的对象滤波器实现的，它的工作原理是减去像素强度的移动平均值。

这里提出的技术被认为是图像相关光谱的被施加到超分辨率显微镜数据，量化活细胞¹¹的分子流的第一个示范。此方法对经由STICS分析¹² F-肌动蛋白流衍射限制成像改进并会适合研究者谁希望确定二维分子流在活细胞中，从在超出光的衍射极限的空间分辨率获得的数据。

注:阶段成像的前一天1和2来进行;确保前或上成像的天平衡到所使用的所有媒体和补充剂。平衡是通过媒体和补充变暖在培养箱设定为_5％的CO 2来实现至37℃。所有细胞培养物的工作和盖玻片电镀步骤在无菌条件下在层流罩。

1.细胞转染

1. 转染T细胞进行成像24小时的实验用质粒编码荧光融合构建的F-肌动蛋白GFP标记和成像之前。注:细胞应分裂24小时，在转染前（48小时之前，成像），以确保细胞在最佳的健康，并在其对数生长期。
   1. 放置5毫升的RPMI补充剂（RPMI 1640 + 10％FBS和1％青霉素 - 链霉素（可选））在6孔板的单个孔进入孵化器中平衡。
   2. 沉淀^2×10 7个T细胞崇拜使用离心机管中于327×g离心5分钟，置的，在_37℃5％的CO 2在RPMI补充和洗涤在预热的电介质的等体积。注:电穿孔介质是含有缓冲区和补充（见消耗品）降低血清培养基。
   3. 后重新制粒在327×g离心5分钟，重悬细胞于500μl电介质，慢慢添加至试管中，添加5微克质粒的PCR级的dh _{2 O}用于标记F-肌动蛋白。
   4. 轻轻拍打引擎盖上的工作区的反应杯，以确保去除任何气泡在媒体上，这可能会导致电力的电弧和向媒体内均匀地分布在细胞。
   5. 打开电穿孔装置和设置电压300 V和电容290Ω。使用指数衰减为20毫秒电穿孔样品。注:可能需要不同的细胞和不同的质粒构建优化。
   6. 一旦转染协议完成后，存储单元冰上继续之前1分钟。
   7. 小心从试管转移细胞到从步骤1.1.1含有平衡的RPMI补充的5毫升的6孔板中。
   8. 孵育细胞O / N在37℃+ _5％CO 2。

2.外套盖玻片和预暖成像补充

1. 外套盖玻片与抗体诱导T细胞刺激。
   1. 涂层的8孔盖玻片用1微克/毫升αCD3和αCD28在200μlPBS中的各腔室。
   2. 储存在4°CO / N。可替代地，涂层盖玻片2小时之前，成像和保持在培养箱中在37℃至通过最大限度地减少温度变化到盖玻片在成像过程中减少漂移。
2. 创建具有0.1μm的子衍射荧光微球盖玻片测试样品。
   1. 珠粒涡旋原液，以避免团块。
   2. 在th的一种新的，干净的盖玻片e型中的那些相同步骤2.1.1使用，吸管5微升荧光微球原液到表面上（根据制造商的说明）。
   3. 分布在与枪头盖玻片微球的解决方案。
   4. 晾干，然后申请200微升安装介质如PBS。
      注意:安装介质应与用于成像的细胞样品。
3. 平衡的HBSS（+ 20mM的HEPES，以下称为"补充的HBSS'）在一个离心管放置在培养箱中预暖O / N在37℃+ _5％CO 2。
   注:加HEPES的是，如果使用的是孵化室_的二氧化碳输入跳过此补充缓冲CO _2。

3.显微镜建立

1. 打开TIRF-SIM显微镜和地方足够的蒸馏水的在显微镜的贮存阶段顶培养箱完全覆盖加热元件的基座。允许水以电子邮件quilibrate至37℃。加热套环添加到物镜，也设定为37℃。
   注:由于在设置了灵敏度，这些步骤是以前做过的晚上，所以光学组件处于稳定的温度之前，成像。
2. 放置TIRF 488兼容光栅挡在显微镜的光路，并固定到位。
   1. 切换通道模式和光纤电缆连接到激光床和显微镜的阶段，"单"的位置分别从事的TIRF-SIM模式，正确的光路。注意:跳过此步骤会导致软件窗口内的错误（图1A）。
3. 打开所有的显微镜和计算机部件，打开采集控制软件。
   1. 打开超频板，钛垫，N-SIM卡垫和ND采集窗口（ 图1B）。在"超频面板"中选择选项"TIRF 488'（ 图2B，黄色箭头）。 在N-SIM板窗口中，选择"TIRF-SIM"和"移动" 设置 （图2C，黄色箭头）。选择设置按钮 （图1C，黄色方框），然后选择"全内反射荧光488（用于100X TIRF 488nm的）'从下拉菜单中，点击"应用"和"确定"。
   2. 帧速率50毫秒，读出模式，EM增益3 MHz的14位和EM增益倍数300为1的转换增益（ 图1C，绿框）内的"DU897设置"来设置相机设置。
      注:请参阅帧速率的考虑代表性的成果。
   3. 通过选择100×1.49 NA CFI复消色差透镜的TIRF目的，对"N-SIM垫'校准为TIRF-SIM显微镜的照明转动488纳米的激光功率为10％。
      注:原始图像的像素大小为60纳米，与美景的512×512像素的领域。
   4. 清洁使用镜头纸，以去除灰尘和油物镜。
   找到TIRF-SIM焦平面。
   1. 开始与在尽可能低的z平面的目标。放置透镜油对目标的下降，并从步骤2.2到显微镜阶段添加荧光微球样品。
   2. 选择位于显微镜的身体完美对焦系统（PFS）的功能。
   3. 通过Z平面缓慢移动的目标，直到PFS按钮停止闪烁，以确认焦平面已经达到。
   4. 切换到控制软件和图像的微球通过使用PFS微机械手轮做最后的调整"现场"视图。
4. 观察均匀照明与离焦的无荧光以上75nm的渐逝波发射。
   注意:确认结构照明通过观察从荧光微球的样品波动的照明模式实现。
5. 测量荧光微球的样品和量化改进成像resolut离子通过观察全宽的强度分布的半最大值（FWHM）。
   1. 打开分析软件（v4.20.01），安装了NIS-A N-SIM分析模块，并选择"应用程序" - >"显示为N-SIM窗口"。
   2. 与照明调制对比度（IMC）和高分辨率的噪声抑制（HRNS）设置为1的TIRF-SIM数据集（图2），重建微球体样本图像生成的1024×1024个像素的重建图像以30像素尺寸纳米。
   3. 与1个像素（ 图3A中，黄色盒）的宽度使用线轮廓工具，通过一个单一的微球体的中心画线。
   4. 选择将FWHM 按钮 （图3B，黄色盒），并点击在高斯分布的强度最大值，随后其强度最小量。
   5. 确认微球体的FWHM是在100nm（图3C）的范围内。注:分辨率阿赫ieved成像当生物样本将取决于信噪比从标记效率和背景荧光变化。

4.样品制备成像

1. 盖玻片准备。
   1. 从冰箱或保温箱步2.1检索αCD涂层的盖玻片，并从每个孔取出PBS含αCD3和αCD28。
   2. 从步骤2.3加入200μl预热HBSS补充到盖玻片的每个孔中。洗净并除去，以确保最小αCD3和αCD28留在溶液中。添加另一个200微升HBSS补充盖玻片井。
   3. 清洁盖玻片的下侧与镜头纸以除去油和颗粒。
2. 在显微镜台位置盖玻片并通过使用PFS z平面找到盖玻片TIRF焦平面如在步骤3.4中找到。
3. 细胞的准备。
   1. 吸取200微升媒体CON的泰宁转染的细胞从步骤1.1.8成微离心管中。
   2. 沉淀细胞在微离心机中以268×g离心20秒并除去细胞介质。
   3. 悬浮细胞在200μl来自步骤2.3预先温热的HBSS补充。

5.成像细胞

1. 取含细胞的HBSS补充到显微镜，轻轻移液加入200μl至孔中的一个。
2. 而在盖玻片（在PFS模式）留在TIRF焦平面，用显微镜目镜落射荧光照明跟踪荧光细胞接近盖玻片。
3. 一旦细胞土地上的盖玻片，切换到"现场"模式，在N-SIM垫带来的图像上的显示器，并检查细胞处于焦点的电脑屏幕上。
4. 要记录时间的课程，打开ND采集窗口，选择"时间"选项卡上，单击"添加"，并设置"间隔"为无延迟，"长"至10分钟，"环路"设置为1。
   注意:持续时间可以根据所关注的方法来改变;当以"无延迟"捕获的STICS软件可以提取与≈10帧图像堆栈定量结果。
5. 以相同的采集设置到胎圈样品，首先在ND采集窗口中选择"立即运行"记录数据。

6.重建SIM图片

1. 成像完成后，打开分析软件（v4.20.01），安装了NIS-A N-SIM分析模块，并选择"应用程序" - >"显示为N-SIM窗口"。
2. 与照明调制对比度（IMC）和高分辨率的噪声抑制（HRNS）设置为1的TIRF-SIM数据集（图2），重建一个（或多个使用批量工具）原始SIM文件，以产生重构的SIM图像。
3. 确认重构文件具有30nm的像素大小，在所指示的图像状态栏。
   注意:像素大小不影响STICS分析，但它应该是在尺寸比在PSF空间分辨率的至少2倍小，以确保像素之间的空间相关性。
4. 导出数据为.tiff文件，准备STICS分析。

7. STICS分析

1. 下载并解压缩STIC（C）S Matlab软件包（怀斯曼实验室;可作为补充信息）。脚本stics_vectormapping.m是单通道STICS分析的核心和第一30行的代码被用作在手册的第2.1节中定义来定义的输入参数。打开这个脚本，并定义的输入参数TIRF-SIM卡的数据分析。建议也与子文件夹添加STIC（C）S文件夹复制到本地机器Matlab的路径，该手册的附录中详细说明。
   1. 通过编辑代码的相应行定义的输入参数的数据进行分析
   2. 要执行全日空的TIRF-SIM数据的裂解，以产生1向量地图，在第31行设置瞬时参数到颞分区域的帧的最大数量，并在管线32到1的时移为获得时间序列的矢量地图改变这些参数。
   3. 对于不动去除过滤器，设置参数'过滤'（23行），以"移动平均"，并设置为21'MoveAverage"参数（第24行）。
      注意:该设置已被显示能用于移动较慢的和大的荧光信号，因为它是基于减去帧的串行数据帧被分析。
   4. 更改线路33-38来设置输出文件和输出矢量地图的标题名称，以及输出目录路径，并确定以何种格式的矢量地图的图像应保存。

2. 打开在Matlab编辑器窗口中的脚本run1ChannelSTICS。通过运行线这个脚本的1-23加载图像序列。
   注意:此脚本可用于加载和预处理图像系列，绘出矢量地图和速度直方图和运行批处理处理多个文件。如果需要的话，通过使用这个脚本的线24-26剪切图像的感兴趣的区域。
   1. 运行线路run1ChannelSTICS 29-35启动STICS分析。提示时，选择一个多边形来表示的感兴趣区域（ROI）的特定区域，如果需要的话。确保将ROI不与小区边缘重叠，边界伪影出现时STICS分析这些重gions。
   2. 运行线路38-52，显示矢量地图。要绘制速度幅度直方图，运行线路53-72。

显微镜设置

在成功地实现所有步骤研究者将具有F-肌动蛋白的流动是T细胞中突触的完成结构照明（SIM）成像（视频1），并量化这个分子流通过时空图像相关光谱（图4 11）。记录图像之前，确保样本照明是在9个原始图像均匀且在莫尔条纹在样品中观察到的形式，结构照明（图5），这些都是指标盖玻片平放在阶段和TIRF- SIM建立正确对齐。

它保持激光功率低（≤10％），以确保细胞保持尽可能健康在实验过程中是非常重要的。如果荧光表达低，甚至的T优化后他电穿孔的步骤，增加每个原始帧以上规定的50毫秒和/或转换增益设置的曝光时间。作为TIRF-SIM要求9原始帧，1对每个每重建图像所需要的9照明取向，增加曝光时间将降低帧速率。在该实验中，一个50毫秒的曝光允许≈1每秒（也包括格旋转时间）重建帧，减少看时更快的事件移动通过多个照明最大值在一原始帧的运动伪影的风险。

取决于分子流的速度正在研究，增加曝光时间可能会引入运动伪影;研究人员应该保持的曝光时间需要一个良好的信号最小。由于像素大小的SIM图像比标准的荧光图像更小，分子群体呈现出更快的流速可以通过次区域后续FR前获取火焰。为STICS软件来关联在该小区域的荧光信号更快的图像速率，需要比标准荧光数据集。例如8×8象素的SIM数据的子区域的大小代表了240×240纳米区域，同时从标准荧光数据集中的8×8像素分区表示为1.7微米的面积（具有200nm的假定像素大小）。

对于更长的时间课程（> 3分钟）的数据批次可以使用"ND收购"，以减少在突触形成激光曝光（采取例如，成像，持续10秒每分钟10分钟将电池暴露在相同的累计激光功率作为成像<连续2分钟）。

从SIM卡成像亚最佳重建演示了在图6中，其中，相同的原始数据已被使用不同的高resoluti重构上的噪声抑制（HRNS）设置，正向傅立叶变换（FFT）和所述突出光纤的半峰全宽轮廓也示。设置HRN越来越多的重建文物由于不良的信号与噪声和提高分辨率之间的平衡。甲HRN太低（<1）会导致粗糙的图像具有增加的六角形的SM假象，而过高的HRNS设置（> 1）可以"夹"并丢弃高分辨率数据（视为减小FFT直径）。中> 100nm的决议将表明需要重新运行重建不同的设置，如果分辨率仍然是次优与优化的显微镜设置重新获得可能需要的数据。

成像和量化分子流

将图像的分子流，时间序列数据取T细胞的降落并形成突触上的刺激coversliP，F肌动蛋白中可以看出，以一个逆行方式从向小区中心细胞周边流动。如F-肌动蛋白密度变小面对电池STICS分析的中心仅进行在突触的周边，这种区域也是其中信令微聚合是已知的，从在延长的突触形成起源。

当获得和使用STICS分析数据，以了解程序依赖于相关联的选定的子区域内的荧光的波动，以形成一个更高和更平滑的相关函数（CF）是重要的。需要产生一个成功的STICS输出帧的绝对数量不准确，因为软件更依赖于产生通过这些子区域内的建设性信号波动的总数的输出。例如，如果数据集具有20移动，在每个子区域中流动相同的方向STICS标记蛋白质将需要基因更少的帧评价一个可靠的输出，同时与5手机的蛋白质导致较弱的相关功能和次区域可能需要更多的帧。使用的帧和分大小的确切数量取决于分子事件被成像的性质和应该由用户进行优化。

使用STICS'时空帧作物"工具也能够分析分子流的子集，通过时刻:使研究人员能够看到，如果流率取决于不同的细胞的条件或环境刺激如之前和药物治疗后在同一小区内发生变化。不可移动物体滤波器被设计，以除去任何不动的荧光人口分析所述移动荧光人口之前。使用这种方法，包含静态的人口比例高达90％，还是可以成功的图像分析10。设置不动的过滤器，以21帧过滤掉任何仍在荧光人群静态为这一段时间或更长的时间，在此期间免疫突触稳定，不会向动态逆行流。

图1。 显微镜采集设置。（A）的亮点用于实验和"错误的光纤"的错误的N SIM卡垫设置时不被选择的单通道和光纤模式。 （B）的所需设置，记录和重建一个结构照明图像在SIM系统上的所有窗口。 （C）N-SIM卡垫和N-SIM卡设置弹出窗口（黄框）用于选择后实际配售488纳米光栅入镜光栅设置。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3. 全宽半最大值（FWHM）的测量值。使用分析软件（A）示出的高斯曲线图从线强度工具选择（黄色盒），并通过一个小珠样 ​​品的重构的SIM图像绘制。 （ （C）的表示在此情况下为120纳米的分辨率。荧光强度的倾角由噪音引起的SIM重建一个已知的假象，来抑制这种影响高分辨率噪声抑制可降低（ 图5C），以成本来解决。 请点击此处查看该图的放大版本。 。

使用TIRF-SIM上的刺激盖玻片的免疫突触生成图4。代表结构照明的数据和STICS输出，一个的Jurkat T细胞表达绿色荧光蛋白标记的F-肌动蛋白成像。接触五分钟后，经时取出并使用STICS分析程序进行分析。黄色拖曳代表放大区域而矢量地图展示F-肌动蛋白的在突触周边的逆行流。矢量的颜色表示该分区域的分子流的速度，速度数据被绘制在​​直方图。由于激发的TIRF-SIM提供的z选择性，样品可以从焦点丢失，如果它分离或移动远离盖玻片通过实验的时间过程由于皱裂或蠕动。这是在这里看到在右上面板作为载体密度的降低。的减少是STICS的结果施加动过滤器分区域从而衍生出的时间由用户设定的时间内没有荧光的波动。该结果强调了包含在整个时间序列的荧光信号仅选择区域的重要性。平直">点击此处查看该图的放大版本。

图5.原始的SIM图像。九个原始图像在左侧显示需要生产一个TIRF-SIM图像的栅格图案的9方向。细胞成像是一个的Jurkat T细胞表达GFP标记的F-肌动蛋白，细胞缩小显示九个原始图像中的一个，显示非均匀照明用的莫尔条纹，特别是围绕在细胞周围。虽然结构照明是不可见的光照和样品之间的相互作用创建的光照变化强度区域，重建后这导致具有改进的分辨率的图像。这两种比例尺为5微米。 请点击此处查看该图的放大版本。

提交人声明，他们没有竞争的经济利益。