为了研究T细胞免疫突触中丝状肌动蛋白的流动速度和方向性，将活细胞超分辨率成像与全内反射荧光技术相结合，并利用时空图像相关光谱法进行定量分析。
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摘要
摘要
丝状肌动蛋白（filamentous-actin）在大多数细胞过程中发挥关键作用，包括细胞运动性，以及在免疫细胞中形成一种重要的细胞间相互作用——免疫突触。人们还推测F-actin在调控细胞膜上的分子分布方面具有作用，包括膜下囊泡动力学和蛋白质聚集。尽管常规光学显微镜技术可实现广义的、受衍射极限限制的观察，但许多细胞和分子事件（如分子聚集和分子流动）发生在远低于常规光学显微镜分辨能力的尺度上。通过将全内反射荧光显微技术与超分辨率成像方法——结构照明显微术（structured illumination microscopy）相结合，研究人员记录了T细胞免疫突触处F-actin的二维分子流动。随后应用了时空图像相关光谱分析法（spatio-temporal image correlation spectroscopy, STICS），该方法可生成可量化的结果，以速度直方图和矢量图的形式反映分子流动的方向性和强度。本实验方案描述了结合超分辨率成像与STICS技术，在亚衍射分辨率水平上生成分子流动矢量的方法。该技术已被用于证实：在T细胞形成免疫突触后，其周边区域存在对称性的、向后且向心的肌动蛋白流动。
引言
本实验的目标是对活体T细胞中丝状肌动蛋白（F-肌动蛋白）的分子流动进行成像和表征，突破衍射极限，以确定在免疫突触（IS）形成过程中F-肌动蛋白流动的方向和强度。该技术将采用结构照明显微镜（SIM），在全内反射荧光（TIRF）模式下进行，对Jurkat T细胞在涂有抗CD3和抗CD28抗体的活化盖玻片上形成人工突触的过程进行成像。免疫突触形成于T细胞与其靶细胞——抗原呈递细胞（APC）之间，由T细胞受体（TCR）激活所触发1,2。由于这是适应性免疫系统决定是否对感染产生免疫应答的第一步，因此对刺激信号响应异常可能导致多种疾病。T细胞与APC之间相互作用的重要性已有充分文献记载，但在初始TCR信号内化后，成熟免疫突触所发挥的作用仍尚未完全阐明。
由于细胞骨架被认为有助于与 TCR 激活相关的两个过程（质膜上分子的移动以及依赖肌动蛋白细胞骨架的信号分子调控3,4 ），了解细胞骨架在空间和时间上的重组方式将有助于阐明免疫突触形成过程中分子重排的各个步骤。F-actin 的向后流动被认为可将 TCR 簇驱赶至免疫突触的中心，这种转位被认为对信号终止和再循环至关重要，有助于维持 T 细胞激活的精细平衡5。
尽管标准荧光显微镜是一种灵活的工具，可为包括细胞间相互作用在内的多种生物学事件提供洞察，但其分辨率受限于系统对距离小于衍射极限的多个荧光团进行准确分辨的能力≈200 nm）之内。由于细胞内的许多分子事件涉及分子的密集群体，并在静息状态或特定刺激下表现出动态重排，常规光学显微镜无法提供完整的图像。
超分辨率成像技术的应用使研究人员能够利用多种方法突破衍射极限。单分子定位显微技术（SMLM），如PALM和STORM6,7，可将分子位置的分辨精度提高到约20 nm，但这些技术依赖较长的采集时间，需通过多帧图像累积构建最终图像。通常要求样品经过固定，或结构具有较低的流动性，以避免单个荧光分子被误判为多个信号点。虽然受激辐射损耗（STED）成像可通过高度选择性的共焦激发实现超分辨率8，但其所需的扫描方式在全细胞视野下可能较为缓慢。此外，由于损耗光束功率的增加，STED在实现更高分辨率时还会表现出显著的光毒性。
结构照明显微镜（SIM9) 为这些方法提供了一种替代方案，可将标准荧光显微镜的分辨率提高一倍，且相较于当前的单分子定位显微技术（SMLM），更适用于活细胞成像。该方法在宽场系统中使用较低的激光功率，能够实现全细胞视野的成像，具有更快的采集速度，并兼容标准的荧光染料标记。SIM 的宽场特性还允许采用全内反射荧光（TIRF）实现高度选择性的激发，其在轴向的穿透深度为 <100 nm
图像相关光谱法（ICS）是一种对荧光强度波动进行相关性分析的方法。ICS 的一种发展形式——时空图像相关光谱法（STICS10），可在时间和空间上对细胞内荧光信号进行相关性分析。通过相关函数将像素强度与滞后帧中周围像素的强度进行关联，从而获得有关流动速度和方向性的信息。为确保静态物体不干扰 STICS 分析，需采用一种不可移动物体滤波器，其原理是减去像素强度的移动平均值。
本文所展示的技术被认为是首次将图像相关光谱学应用于超分辨率显微镜数据，以定量活细胞中的分子流动11。该方法在基于衍射极限的F-actin流动STICS分析基础上实现了提升12，适用于希望利用超越光衍射极限空间分辨率的数据，测定活细胞中二维分子流动的研究人员。
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方案
注意：第1阶段和第2阶段在成像当天之前完成；确保成像当天或之前使用的所有培养基和添加剂均已平衡。平衡方法是将培养基和添加剂置于设定为5% CO2的培养箱中，升温至37 °C。所有细胞培养操作和盖玻片接种步骤均须在超净工作台内的无菌条件下进行。
1. 细胞转染
- 在实验前24小时，使用编码F-actin-GFP荧光融合蛋白的质粒转染待成像的T细胞。注意：为确保细胞处于最佳健康状态并处于对数生长期，应在转染前24小时（即成像前48小时）对细胞进行传代。
- 将5 mL RPMI培养基补充液（RPMI 1640，含10% FBS和1%青霉素-链霉素（可选））加入6孔板的一个孔中，放入培养箱内平衡。
- 将37 °C、5% CO2条件下培养的2 × 107个T细胞用离心管在327 × g下离心5分钟，收集细胞沉淀，并用等体积预热的电穿孔缓冲液洗涤。注意：电穿孔缓冲液为低血清培养基，含有缓冲体系和添加剂（见耗材清单）。
- 再次在327 × g下离心5分钟后，将细胞重悬于500 µL电穿孔缓冲液中，缓慢加入电穿孔杯中，再加入5 µg用于标记F-actin的质粒（溶于PCR级dH2O中）。
- 轻轻敲击电穿孔杯的外壁，确保缓冲液中无气泡残留，以防电击时产生电弧，并使细胞在缓冲液中均匀分布。
- 开启电穿孔仪，设置电压为300 V，电容为290 Ω，采用指数衰减模式电穿孔20毫秒。注意：不同细胞类型或不同质粒构建体可能需要优化电穿孔参数。
- 转染程序完成后，将细胞置于冰上静置1分钟后再继续后续操作。
- 小心地将细胞从电穿孔杯转移至第1.1.1步中已平衡的含5 mL RPMI补充液的6孔板孔中。
- 将细胞在37 °C、5% CO2条件下过夜培养。
2. 包被盖玻片并预热成像培养基补充液
- 使用抗体包被盖玻片以诱导T细胞刺激。
- 在8孔盖玻片的每个孔中加入200 µl PBS，其中含1 µg/ml αCD3和αCD28，进行包被。
- 4 °C过夜孵育。或者，在成像前2小时进行包被，并在37 °C培养箱中保存，以减少盖玻片温度变化，从而降低成像过程中的漂移。
- 制备含有0.1 µm亚衍射荧光微球的盖玻片测试样品。
- 涡旋振荡珠子储备液，避免结块。
- 在与步骤2.1.1中相同类型的新鲜洁净盖玻片上，用移液器吸取5 µl荧光微球储备液滴加至表面（按照制造商说明操作）。
- 用移液器枪头将微球溶液在盖玻片表面铺匀。
- 静置干燥后，加入200 µl封片介质（如PBS）。
注意：封片介质应与成像细胞样品时所用介质一致。
- 将HBSS（含20 mM HEPES，下文称“HBSS补充液”）置于离心管中，放入37 °C、5% CO2培养箱中过夜预热，以达到平衡。
注意：添加HEPES的目的是缓冲CO2；若使用带CO2输入的培养腔，则无需添加此补充成分。
3. 显微镜设置
- 打开 TIRF-SIM 显微镜的载台式培养箱，在显微镜的储水槽中加入足量蒸馏水，确保完全覆盖加热元件底部。让水温平衡至 37 °C. 将加热套环安装到物镜上，并同样设置为37 °C.
注意：由于设备对环境较为敏感，这些步骤需在成像前一晚完成，以便光学组件在成像前达到稳定的温度。 - 将适用于TIRF 488的光栅模块置于显微镜光路中，并固定到位。
- 将激光床和显微镜载物台上的通道模式及光纤电缆分别切换至“Single”位置，以启用TIRF-SIM模式的正确光路。注意：跳过此步骤将导致错误图1A）在软件窗口内。
- 打开所有显微镜和计算机组件，并启动采集控制软件。
- 打开 OC 面板、Ti Pad、N-SIM Pad 和 ND Acquisition 窗口（图1B）。在“OC面板”中选择“TIRF 488”选项（图2B，黄色箭头）。
- 在 N-SIM Pad 窗口中，选择“TIRF-SIM”和“Moving”设置（图2C，黄色箭头）。选择设置按钮（图1C，黄色方框）从下拉菜单中选择“TIRF 488（用于100x TIRF 488nm）”，点击“Apply”和“OK”。
- 在“DU897设置”中将相机参数设为：帧率50毫秒，读出模式，EM增益3 MHz（14位），EM增益倍增器300，转换增益为1图1C，绿色方框）。
注意：帧率选择请参见代表性结果部分。 - 在“N-SIM Pad”上选择100倍1.49数值孔径CFI复消色差TIRF物镜，将488 nm激光功率调至10%，以校准显微镜在TIRF-SIM模式下的照明。
注意：原始图像的像素大小为60 nm，视场为512 × 512像素。 - 使用镜头纸清洁物镜，以去除灰尘和油渍。
- 找到TIRF-SIM的焦平面。
- 从最低的 z 平面开始。在物镜上滴加一滴镜油，并将步骤 2.2 中的荧光微球样品置于显微镜载物台上。
- 选择位于显微镜机身上的完美聚焦系统（PFS）功能。
- 缓慢移动物镜沿z轴方向上移，直至PFS按钮停止闪烁，以确认已到达焦平面。
- 在控制软件中切换至“实时”视图，并使用PFS微操作轮对微球进行成像，以完成最终调整。
- 观察75 nm衰逝波以上无失焦荧光发射的均匀照明。
注意：通过观察荧光微球样品中波动的照明模式，确认结构化照明已实现。 - 测量荧光微球样品，并通过观察强度分布的半高全宽（FWHM）来量化成像分辨率的提升。
- 打开 Analyze 软件（v4.20.01），确保已安装 NIS-Elements N-SIM Analysis 模块，然后选择“应用程序”－> 显示 N-SIM 窗口
- 将照明调制对比度（IMC）和高分辨率噪声抑制（HRNS）设置为1，用于TIRF-SIM数据集（图2），重建微球样品图像，生成一幅像素尺寸为30 nm、分辨率为1,024 × 1,024像素的重建图像。
- 使用线轮廓工具，宽度设置为1像素（图3A，黄色方框），穿过单个微球的中心画一条线。
- 选择 FWHM 按钮（图3B，黄色方框）并单击高斯分布的强度极大值，随后单击其强度极小值。
- 确认微球的半高宽（FWHM）在100 nm范围内（图3C）。注意：对生物样本成像时所达到的分辨率将取决于标记效率和背景荧光所产生的信噪比，因而会有所差异。
4. 成像样品制备
- 盖玻片准备。
- 从冰箱或培养箱中取出步骤 2.1 中制备的抗 CD 抗体（αCD）包被的盖玻片，并移除各孔中含 αCD3 和 αCD28 的 PBS 溶液。
- 向盖玻片的每个孔中加入 200 µl 步骤 2.3 中预热的 HBSS 补充液，洗涤并移除液体，以确保溶液中残留的 αCD3 和 αCD28 最少。再向盖玻片各孔中加入 200 µl HBSS 补充液。
- 使用镜头纸清洁盖玻片底面，去除油渍和颗粒物。
- 将盖玻片置于显微镜载物台上，并使用步骤 3.4 中确定的 PFS z 平面找到盖玻片的全内反射荧光（TIRF）焦平面。
- 细胞准备。
- 用移液器将步骤 1.1.8 中含有转染细胞的 200 µl 培养基转移至微量离心管中。
- 在微型离心机中以 268 × g 离心 20 秒，沉淀细胞并弃去培养基。
- 用步骤 2.3 中预热的 200 µl HBSS 补充液重悬细胞。
5. 成像细胞
- 将含有细胞的 HBSS 补充液转移至显微镜下，轻轻移取 200 µl 加入其中一个孔中。
- 在物镜平面聚焦模式（PFS模式）下保持于盖玻片的TIRF焦平面时，使用显微镜目镜和落射荧光照明追踪接近盖玻片的荧光标记细胞。
- 细胞落在盖玻片上后，切换至 N-SIM Pad 中的“Live”模式，将图像显示在显示器上，并检查细胞在计算机屏幕上的对焦情况。
- 打开 ND 采集窗口，选择“时间”选项卡，点击“添加”，将“间隔”设置为无延迟，“持续时间”设置为 10 分钟，“循环次数”设置为 1，以记录时间序列。
注意：持续时间可根据所关注的过程进行调整；STICS 软件能够利用图像序列提取定量结果 ≈以“无延迟”模式采集时共获取10帧图像。 - 使用与珠样样本相同的采集设置，在ND采集窗口中选择“Run now”以开始记录数据。
6. 重建SIM图像
- 成像完成后，打开已安装 NIS-A N-SIM 分析模块的 Analyze 软件（v4.20.01），并选择“应用程序”－> 显示 N-SIM 窗口
- 将照明调制对比度（IMC）和高分辨率噪声抑制（HRNS）设置为1，用于TIRF-SIM数据集（图2），使用重建工具（或批量工具重建一个或多个原始SIM文件）以生成重建后的SIM图像。
- 确认重建文件的像素大小为 30 nm，该数值显示在图像状态栏中。
注意：像素大小不会影响STICS分析，但其尺寸应至少比点扩散函数（PSF）空间分辨率小2倍，以确保像素之间的空间相关性。 - 将数据导出为 .tiff 文件，以备进行 STICS 分析。
7. STICS 分析
- 下载并解压 STIC(C)S Matlab 软件包（Wiseman 实验室；可作为补充信息获取）。脚本 stics_vectormapping.m 是单通道 STICS 分析的核心，其前 30 行代码用于定义手册第 2.1 节中所述的输入参数。打开该脚本，并为 TIRF-SIM 数据分析设置输入参数。建议同时按照手册附录中的说明，将包含子文件夹的 STIC(C)S 文件夹添加到本地计算机的 Matlab 路径中。
- 通过编辑代码中相应的行来定义数据分析的输入参数
- 若要对 TIRF-SIM 数据进行分析以生成 1 张矢量图，需将第 31 行的时间子区域参数设为最大帧数，将第 32 行的时间偏移参数设为 1。若要获得一系列时间上的矢量图，则需调整这些参数。
- 对于不动成分去除滤波器，将第 23 行的“filtering”参数设为“Moving average”，并将第 24 行的“MoveAverage”参数设为 21。
注意：该设置适用于移动较慢且荧光信号较大的情况，因其原理是通过从待分析帧中减去连续帧实现的。 - 修改第 33–38 行，以设置输出文件的名称、输出矢量图的标题、输出目录路径，以及定义矢量图图像的保存格式。
| 像素大小（µm） | 0.03 µm | 第 19 行 |
| 帧率（秒） | 1 秒 | 第 20 行 |
| 最大滞后时间（帧） | 20 帧 | 第 21 行 |
| 子区域大小（像素） | 8 像素 | 第 29 行 |
| 子区域间距（像素） | 1 像素 | 第 30 行 |
- 在 MATLAB 编辑器窗口中打开脚本 run1ChannelSTICS。通过运行该脚本的第 1–23 行来加载图像序列。
注意：此脚本可用于加载和预处理图像序列、绘制矢量图和速度直方图，并对多个文件进行批量处理。如有需要，可通过运行该脚本的第 24–26 行将图像裁剪至感兴趣区域。- 运行 run1ChannelSTICS 的第 29–35 行以启动 STICS 分析。当系统提示时，可选择一个多边形以指定特定的感兴趣区域（ROI）。请确保 ROI 不与细胞边缘重叠，因为当 STICS 分析这些区域时会出现边界伪影。
- 运行第 38–52 行以显示矢量图。要绘制速度大小直方图，请运行第 53–72 行。
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结果
显微镜设置
成功完成所有步骤后，研究人员将实现T细胞突触中F-肌动蛋白流动的结构光照明显微成像（视频1），并利用时空图像相关光谱法对这种分子流动进行了定量分析（图411）。在记录图像之前，应确保样品在九幅原始图像中的照明均匀，并在样品处观察到以莫尔条纹形式呈现的结构照明（图5）；这两者均表明盖玻片在载物台上放置平整，且TIRF-SIM系统已正确对准。
实验过程中应保持激光功率较低（≤10%），以确保细胞尽可能保持健康状态。如果荧光表达水平较低，即使在优化电穿孔步骤后仍不理想，可增加每个原始图像帧的曝光时间（超过所述的50毫秒）和/或提高转换增益设置。由于TIRF-SIM需要9个原始帧（每个重建图像需要9种不同照明方向，每种方向对应一个原始帧），...
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讨论
该技术将使研究人员能够对表达荧光的细胞中以往无法分辨的细节进行成像和定量分析。我们的结果表明，在T细胞免疫突触（IS）中，F-actin从细胞周边向细胞中心呈对称性流动。这些发现与此前基于一维线轮廓图解数据的研究结果一致13，并进一步将分析能力扩展至二维及超分辨率数据。
当前技术是从走时成像发展而来，后者仅限于通过单条一维直线随时间绘制荧光强度波动。相比之下，本技术能够对整个细胞的分子流动进行定量分析，并提取流动的方向性和速度信息。尽管散斑成像也已展示了二维环境中肌动蛋白的动力学行为14，但散斑成像技术可能受限于标记密度难以优化，且只能可视化肌动蛋白的一个亚群。
要获得这些结果，最重要的步骤是优化研究人员所用特定细胞的转染效率，以及对SIM显微镜的光学系统和光栅图案进行校准。选择正确的子区域大小取决于样本特性，这一点至关重要：若设置过小，相关性分析将丢失快速移动的荧光信号；而若子区域过大，则可能导致超分辨率方法所获取的额外数据中的细微差异丢失。
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
D.M.O. 感谢欧洲研究理事会资助编号 337187 以及玛丽·居里职业整合资助编号 334303。P.W.W. 感谢加拿大自然科学与工程研究理事会发现资助项目。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 耗材： | |||
| Jurkat E6.1 细胞 | APCC | ATTC TIB-152 | |
| RPMI | Life Technologies | 21875-091 | |
| FBS | Sigma | F7524-500ML | |
| 青霉素-链霉素 | Life Technologies | 15140-122 | |
| HBSS | Life Technologies | 14025-050 | |
| HEPES | Life Technologies | 15630-056 | |
| #1.5 8孔盖玻片 | NUNC, Labtek | 155409 | |
| LifeAct GFP 载体 | Ibidi | 60101 | |
| OptiMem | Life Technologies | 51985-042 | |
| 抗CD3抗体 | Cambridge Bioscience | 317315 | |
| 抗CD28抗体 | BD Bioscience / Insight Biotechnology | 555725 | |
| PBS | Life Technologies | 20012-019 | |
| 镜油 | |||
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| 设备： | |||
| Gene Pulsar Xcell 系统 | BioRad | 165-2660 | |
| 电转杯（0.4 cm） | BioRad | 165-2088 | |
| 离心机（5810R） | Eppendorf | 5805 000.327 | |
| 离心机（Heraeus） | Biofuge pico | 75003235 | |
| 6孔板 | Corning | 3516 | |
| 载物台培养箱 | Tokai Hit | INUH-TIZSH | |
| Nikon N-SIM 显微镜 | Nikon | 联系公司 | |
| Nikon Analyse 软件 | Nikon | 联系公司 | |
| 培养箱（190D） | LEEC | 联系公司 |
参考文献
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