单细胞核水平下的LINE-1逆转座子插入分析

摘要

本研究采用 FISH 技术，在稳定表达合成 LINE-1 的 HepG2 细胞系染色体铺展样本中，于单细胞核水平追踪 LINE-1 的逆转座活动。

摘要

长散布核元件-1（Long interspersed nuclear element-1，Line-1 或 L1）约占人类基因组中DNA的17%。尽管其中大部分 L1由于5'端截短而失活，但仍有约80-100个此类元件保持逆转座活性，可通过RNA中间体在基因组中不同位置进行扩增。而较古老的 L1s 被认为靶向基因组中富含AT的区域，而更新、活性更强的染色体靶点 L1s 定义尚不明确。本文描述了荧光 原位 杂交（FISH）技术，可用于追踪模式 L1 插入与异位发生率 L1 单细胞核水平的整合. 在这些实验中，采用异硫氰酸荧光素/花青素-3（FITC/CY3）标记的新霉素探针来追踪 L1 逆转座 体外 在稳定表达外源基因的HepG2细胞中 L1该方法可避免因毒性导致的逆转座率估算误差，并能计入多个插入事件发生在同一细胞核中的情况。

引言

人类长散布核元件-1（Long Interspersed Nuclear Element-1, LINE-1）Line-1 或 L1是一种通过以下方式在基因组内传播的自主移动元件 "复制并粘贴" 逆转座机制。一种典型的人类 L1 长约6 kb，包含一个作为启动子的5'非翻译区（5'UTR），以及两个开放阅读框（ORFs）： L1-ORF1 和 L1-ORF2以及带有polyA尾的3'非翻译区。 L1-ORF1蛋白包含三个不同的结构域：卷曲螺旋结构域、RNA识别基序和C端结构域，而 L1-ORF2蛋白含有内切酶、逆转录酶和富含半胱氨酸的结构域^1,2,3,4,5. L1-ORF1 表现出核酸伴侣活性，而 L1-ORF2 提供酶活性，两种蛋白均为逆转座所必需^1,2,6.

一个 L1 逆转座循环始于 RNA 聚合酶 II 从 L1 双顺反子 mRNA 的 5' 非翻译区（5'UTR）启动转录，随后转录产物移位至细胞质并进行翻译。在细胞质中，L1-ORF1 蛋白可表现出 cis-结合，即包装其自身的 RNA，或表现出 trans-结合，即包装其他 RNA（例如，....

方案

注意：除非另有说明，所有步骤均应在室温下进行。有关单个试剂的制备详情，请参见试剂部分。

1. 标记L1探针

注意：探针可通过化学标记或PCR标记进行标记。

1. 化学标记
   1. 在 Tris-乙酸-EDTA (TAE) 缓冲液中配制 0.7–1% 琼脂糖凝胶，微波加热至完全融化，冷却后加入溴化乙锭（0.5 µg/ml）。将凝胶倒入制胶槽，插入梳子，室温下静置使其完全凝固。
   2. 根据制造商说明书，在 37 °C 下用 CY3 或 FITC 标记 SNeo 探针（1-2 µg），孵育 1 小时。
      注意：SNeo 表示 S剪接 Neomycin基因在完成一个完整的逆转座循环后表达。探针大小约为1,000 bp。SNeo可通过PCR从任何载体或基因组DNA中扩增获得。有关链霉亲和素-CY3/FITC标记试剂的信息，请参见材料与试剂表。
   3. 将标记的 SNeo 探针溶液与 1x DNA 上样缓冲液混合，加入每个加样孔中，在 75–100 伏电压下电泳 15–20 分钟。
   4. 使用紫外（UV）成像仪观察探针条带。请注意，SNeo探针的大小可以调整，且也可加入锁核酸（LNA）。图2

结果

示意图 L1 逆转录转座载体被展示于 图1. 该载体包含一个以反义方向排列的新霉素基因 L1 由珠蛋白内含子以正义方向插入而中断的ORF，并位于SD和SA位点之间。当稳定整合到染色体中时， L1 mRNA 由联合的 CMV 和 L1-5'UTR 启动子转录而来（图1）。在RNA加工过程中，珠蛋白内含子从新霉素基因中被剪切出去。Neo-L1 RNA 被包装、转运并整合到基因组中，形成全长或截短的插入序列。如所示， L1 通过使用针对剪接型新霉素（spliced neomycin）的特异性探针进行FISH，可追踪逆转座事件图1).

图2展示了新霉素探针的示意图，其中标记的探针由于激发波长的差异，尺寸较大且荧光较弱。请注意，CY3和FI.......

讨论

全基因组测序、反向PCR和Southern印迹等方法已被用于研究L1逆转座。尽管这些方法在定位基因组中L1插入位点方面具有极高价值，但它们共同面临的一个复杂挑战是需要借助in-silico程序对序列进行重新组装。本文所述的荧光原位杂交（FISH）方法旨在补充这些技术，尤其适用于需要分析培养细胞中异位L1逆转座的研究。该方法可用于对逆转座事件进行定性和定量评估，并可应用于间期细胞核。该方法具有后续用于确定异位L1插入位点的in-silico序列比对方法的准确性¹⁶。由于同聚物的形成，重复序列的比对可能具有不确定性；此外，在引物扩增模板过程中，重复序列可能丢失，导致重复序列的代表性不足。FISH方法可克服这些问题，因为FISH探针能够与同聚物退火，且不太可能对完整的重复序列产生偏倚¹⁶。此外，与基于细胞培养的逆转座检测方法相比，FISH可在单个细胞核水平上确定逆转座频率。因此，该方法可避免对逆转座频率的低估或高估，因为单个细胞核中可能发生多次插入事件¹⁶。近期来自高通量.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
标记探针
Go Tag DNA聚合酶	Promega	M3178
GO Tag 10x无色缓冲液	Promega	M3178
单个dNTP	Sigma	DNTP10	将dATP、dGTP、dCTP的浓度调整为2 mM，dTTP调整为1.5 mM，溶于无核酸酶水中。
dUTP-16-生物素（0.5 mM）	Roche	11093070910
dUTP-FITC（0.5 mM）	Thermo Scientific	R0101
dUTP-CY3（0.5 mM）	Sigma	GEPA53022
MIRUS FISH标记试剂盒	MIRUS	MIR3625
MIRUS FISH标记试剂盒	MIRUS	MIR3225
NucleoSpin PCR纯化试剂盒	Qiagen	1410/0030	可使用任何PCR纯化试剂替代NucleoSpin PCR纯化试剂盒
PCR仪			可使用任意热循环仪扩增标记产物。
琼脂糖	Sigma	A9539
制备染色体铺展
秋水仙胺（Colcemid）	Life Technologies	15212-012	将秋水仙胺直接加入培养基中，终浓度为0.4 µg/ml
1 M KCl	Sigma	P9541	将1 M KCl溶液稀释至75 mM，配制低渗溶液
卡诺固定液（Carnoy Fixative Solution）			按3体积甲醇与1体积乙酸混合配制卡诺固定液。每次使用前新鲜配制。
甲醇	Sigma	322415
乙酸	Sigma	320099
Hoechst-33342	Thermo Scientific	62249	将Hoechst-33342溶于PBS中，终浓度为1 mg/ml。
钻石点标记笔	Thermo Scientific	750
磨砂载玻片	Thermo Scientific	2951-001
胰蛋白酶-EDTA（0.25%）	Life Technologies	R001100	为消化细胞，将细胞在胰蛋白酶中孵育5分钟，然后加入等体积完全培养基终止反应。
盖玻片	VWR	48366067
柯普林瓶（Coplin Jars）	Thermo Scientific	107
加热金属块			可使用任意加热金属块，但推荐使用专为加热载玻片设计的加热块。
烧杯（600 ml）	Sigma	CLS1003600	在烧杯中加水至沸腾，利用热蒸汽使染色体破裂。
尼康显微镜	Nikon	125690	可使用任意显微镜观察染色体铺展质量。
FISH实验试剂与材料
柠檬酸三钠	Sigma	S1804
氯化钠	Sigma	S3014
甲酰胺	Sigma	F9037
Tween-20	Sigma	F1379
硫酸葡聚糖	Sigma	D8906
SDS	Sigma	L3771
鲑鱼精DNA	Life Technologies	15632-011
牛血清白蛋白（BSA）	Sigma	A8531
HCl（N）	Sigma	38283
乙醇	Sigma	459844
甲醇	Sigma	322415
DPBS	Life Technologies	14190-250
NaOH	Sigma	S8045
RNase A	Sigma	R4642
胃蛋白酶	Sigma	P6887
多聚甲醛（PFA）	Sigma	P6148
Hoechst-33342	Thermo Scientific	62249	将Hoechst-33342溶于PBS中，终浓度为1 mg/ml。
橡胶胶水/细胞粘合密封剂		2020-00-1
七个柯普林瓶	Thermo Scientific	107
避光湿盒	Sigma	CLS2551
盖玻片	VWR	48366067
干燥数字加热金属块	VWR	13259
荧光显微镜
20x 柠檬酸钠-氯化钠溶液（20x SSC）			将175 g NaCl和88.2 g柠檬酸三钠溶于800 ml分子级H2O中，搅拌并调节pH至7。待所有盐完全溶解后，定容至1 L，经0.22 µm滤膜过滤。4 °C保存。
1 mg/ml RNase A			将20x SSC缓冲液稀释为2x SSC缓冲液，将RNase A溶于2x SSC缓冲液中，终浓度为1 mg/ml。每次使用前新鲜配制。
1% 胃蛋白酶			将胃蛋白酶（W/V）溶于10 mM HCl中，配制成终浓度为1%的溶液。每次使用前新鲜配制。
4% 多聚甲醛（4% PFA）			在通风橱中称取4.0 g PFA，加入50 ml 1x PBS，搅拌并加热至60 °C，逐滴加入NaOH调节pH，直至PFA完全溶解且溶液澄清。定容至100 ml，经0.22 µm滤膜过滤，分装为5 ml每份，于-20 °C保存。后续使用时，于37 °C融化一份PFA，持续10-15分钟。根据多聚甲醛用量调整滤膜规格。
洗涤缓冲液			将100 ml甲酰胺（20%）与2.5 ml 20x SSC混合，用1.0 M HCl调节pH至7，并用分子级H2O定容至500 ml。
杂交缓冲液			在2x SSC缓冲液中加入50%甲酰胺、10%硫酸葡聚糖、0.1% SDS和300 ng/ml鲑鱼精DNA。甲酰胺的含量决定染色单体的聚焦程度；需进行梯度优化。
检测缓冲液			将20x SSC缓冲液稀释为4x，并加入0.2% Tween-20，配制成检测缓冲液。
封闭缓冲液			在4x SSC缓冲液中加入5%牛血清白蛋白（BSA）和0.2% Tween-20。
脱水溶液			配制70%、80%和95%的乙醇溶液。