经动脉给予溶瘤病毒用于大鼠原位肝细胞癌的局部区域治疗

摘要

溶瘤病毒疗法正在被开发作为治疗肝细胞癌（HCC）的新型治疗方法。本文介绍了一种通过肝动脉给予溶瘤病毒进行HCC局部区域治疗的方法。

摘要

肝细胞癌（HCC）是一种治疗选择有限且预后较差的疾病。近年来，溶瘤病毒疗法已被证明是抗击恶性肿瘤的潜在有力工具。由于肝脏具有独特的双重血液供应，可对原位肝肿瘤进行局部治疗，这些肿瘤主要由动脉血流供血。我们此前已证明，通过肝动脉递送溶瘤病毒可安全高效地转导多灶性HCC病灶，显著延长免疫功能健全大鼠的生存期。该操作方式与临床上对许多HCC患者实施的标准姑息治疗——经动脉栓塞术——高度相似。在大鼠中通过肝动脉给予肿瘤治疗的能力，为评估正在研发的新型病毒载体提供了一个高度复杂的临床前模型。本文详细描述了用于输注溶瘤病毒载体以治疗原位HCC的肝动脉显微解剖操作步骤。

引言

肝细胞癌（HCC）是全球第五大常见癌症，也是癌症相关死亡的第三大原因，因此构成了重大的健康问题^1,2。对于不符合肿瘤切除条件或正在等待肝移植的患者，通常采用经动脉栓塞（TAE）或经动脉化疗栓塞（TACE）等局部区域治疗作为标准姑息治疗手段^3,4。这些疗法利用了肝脏独特的双重血液供应特征：肿瘤几乎完全由肝动脉供血，而周围正常肝组织的血液供应则主要来自门静脉^5,6。

由于目前治疗肝细胞癌（HCC）的现有疗法疗效极为有限，溶瘤病毒已成为颇具前景的替代治疗手段。JX-594（最近更名为Pexa-Vec）是一种胸苷激酶缺失的痘苗病毒载体，携带粒细胞-巨噬细胞集落刺激因子（GM-CSF）基因，已完成了针对HCC的II期临床试验⁷。最近，一种表达人干扰素-β的重组水疱性口炎病毒载体（VSV）已进入针对索拉非尼耐药性HCC的I期临床试验（NCT01628640）。随着溶瘤病毒逐渐接近获得用于HCC患者临床应用的批准，迫切需要一种有效的给药途径以靶向多灶性病灶。尽管全身给药由于肿瘤转导效率低下而效果甚微，但瘤内注射可能使治疗效果局限于被注射的肿瘤，导致无法注射的微小病灶仍易发生疾病进展。

我们已建立一种在大鼠中分离肝动脉的方法，用于以局部区域性方式递送溶瘤病毒治疗原位肝细胞癌（HCC）。我们已证明，该给药途径可安全有效地转导多灶性HCC结节，显著延长免疫功能健全大鼠的生存期^8-10。本文中，我们描述了在大鼠中暴露、分离并注射肝动脉的技术步骤。操作流程示意图见图1（先前已发表⁹）

方案

注意：以下步骤均依照本机构及德国巴伐利亚州当地政府的相关规定执行。任何尝试重复本方案的操作，均须遵守当地动物护理与使用委员会所规定的有关动物人道待遇的本地指南。例如，许多研究机构要求在进行啮齿类动物手术时佩戴无菌手套。 此外，病毒相关操作必须遵循当地法规，注意个人和环境安全。需妥善处理被污染的废弃物，并对仪器和工作区域进行清洁。即， 通过高压灭菌并根据制造商说明使用适当的抗病毒消毒剂进行清洁。

1. 手术开始前的准备工作

1. 灭菌手术器械（即， 通过高压灭菌。
2. 将病毒稀释至适当浓度，该浓度将根据所用病毒的特异性毒性和大鼠品系的易感性而有所不同。
   注意：例如，在雄性水牛鼠中使用水疱性口炎病毒时，我们通常注射10⁷ pfu，即该模型可耐受的最大剂量。
   1. 使用无菌技术预填充病毒  在1 ml注射器中装入，并连接30 G针头，注意排除注射器和针头中的空气。
3. 在手术区域准备好所需的所有材料和设备，并用乙醇喷洒消毒。取一小容器盛装无菌生理盐水（0.9% NaCl），用于润湿纱布和棉签。

2. 大鼠的准备

1. 在开始手术程序前30分钟，按照当地动物护理与使用委员会规定，给予适当剂量的镇痛剂。例如，给予高剂量的安乃近（100–200 mg/kg）。
2. 使用吸入（异氟烷）或注射（即， 右美托咪定（0.15 mg/kg）、咪达唑仑（2 mg/kg）和芬太尼（0.005 mg/kg）混合麻醉剂（又称MMF麻醉剂）。通过挥发器给予异氟烷，浓度为1-3%，根据需要调整浓度以维持正常的呼吸和心率。
   1. 操作前，通过捏压足垫并观察有无反应，确认大鼠已完全麻醉且无痛觉。
   2. 使用兽用眼膏以防止麻醉期间角膜干燥。
3. 使用小型兽用毛发剪刀从胸骨开始向下至生殖器上方区域进行剃毛。注意贴近皮肤剃净毛发，同时避免损伤皮肤。
4. 用胶带将大鼠的前肢和后肢固定于手术台上，若使用吸入麻醉，则将大鼠鼻部置入合适尺寸的鼻罩中。在大鼠身下放置加热垫以维持体温。使用消毒剂对腹部区域进行消毒 外科级消毒剂，随后用酒精冲洗并涂抹抗菌剂。 

3. 剖腹手术

1. 使用小型弯柄手术刀（如#15号），在皮肤层正中线上做一小的垂直切口，向上延伸至剑突。接着，用Adson镊轻轻提起肌层，以手术刀切开，再用手术剪沿正中线向上剪至剑突。注意避免刺破腹腔器官，勿损伤剑突两侧的小血管。
2. 在腹部放置牵开器，撑开肌肉和皮肤，暴露整个腹腔区域。
3. 润湿两张 7.5 x 7.5 cm 的² 无菌纱布拭子 生理盐水，并分别覆盖于手术切口的上方和下方，如图所示 图2A.

4. 肝动脉的分离

1. 使用两根用无菌生理盐水润湿的棉签，轻轻抬起肠管和盲肠 ，将其移出腹腔，并放置在下方的纱布上。将纱布折叠覆盖，以保持器官湿润并将其固定于一侧。
2. 使用两根润湿的棉签，轻轻抬起左侧肝叶，该肝叶在此时视野中最明显。将肝叶向上翻起，使用小型弹簧剪刀剪开肝叶下方的纤维膜，使肝叶完全翻转至上方，并置于先前放置的纱布上。将纱布覆盖在肝叶上，以固定其位置。
3. 继续处理下一个肝叶（前尾状叶），该叶此时位于视野最前方。在解剖显微镜和精细镊子的辅助下，分离包绕该肝叶的薄层膜，使其松解并可自由向上翻起。将该肝叶与左侧肝叶一同置于纱布下方。
4. 观察此时已可见的后尾状叶。重复步骤4.3，完全分离后尾状叶，并将其向上翻起，连同先前放置的肝叶一起包裹于纱布内。
5. 在尾状叶原始位置的正下方，找到肝总动脉，此时其因明显的搏动而清晰可见且易于识别。沿动脉向解剖学右侧追踪，可见一层较厚的膜状组织遮挡了胃十二指肠动脉和肝固有动脉的视野。使用精细镊子轻轻提起该组织并小心撕开，注意避免损伤该区域内的小血管。如有出血，使用棉签进行止血。
   1. 在膜组织被充分分离后，借助解剖显微镜可清晰观察到动脉分支。
6. 使用两把精细无创镊子，仔细分离肝总动脉、胃十二指肠动脉和肝固有动脉，使其完全脱离周围膜组织（图2B）。

5. 注射前动脉的准备

1. 将7-0 Prolene缝线穿过胃十二指肠动脉下方，并使用显微持针器在远端、分叉上方处打一个永久性结扎（正确位置参见图1）。结扎后两端各保留约2英寸长的缝线，并用持针器夹住，以便牵拉使动脉绷紧，如图2C所示。
2. 在肝总动脉上放置一个小夹子，以暂时阻断血流（图2C）。
   注意：此步骤至关重要，可防止针头拔出后发生大出血。此外，阻断动脉血流有助于减缓病毒注射速度，提高转导效率。
   1. 重要提示：操作应迅速，尽量缩短血流阻断时间——在夹闭肝总动脉后5分钟内完成注射及后续的动脉结扎。
3. 如条件允许，增加解剖显微镜的放大倍数，使胃十二指肠动脉清晰聚焦并显得足够大，以便准确插入30 G针头。将注射器针头插入胃十二指肠动脉管腔，缓慢推动推杆。
   注意：正确插入针头后，注射液将直接经肝固有动脉流向肝脏。
   1. 注射过程应极其缓慢，以最大化转导效率。
4. 完成全部注射体积后，缓慢将针头从动脉中撤出。
   注意：注射部位不应出现出血。若发生出血，表明夹子位置不当，需立即调整。

6. 结束

1. 在胃十二指肠动脉下方穿过第二根7-0 Prolene缝线，并在注射部位上方结扎第二个永久性结扎线。
2. 移除肝总动脉上的夹子，确认肝固有动脉向肝脏方向的血流已恢复。
   1. 剪断结扎线的游离端。
3. 在将肠道和肝脏复位至腹腔前，确认无出血；注意将阑尾恢复至其原始位置。
4. 使用带弯针的4-0 Vicryl缝线材料分层缝合肌肉和皮肤；连续缝合时针距约为1 mm，并拉紧缝线。
   1. 缝合过程中，给予镇痛药物，例如布托啡诺（0.05 mg/kg）。
5. 使大鼠从麻醉中苏醒。若使用异氟烷麻醉，大鼠应在数分钟内恢复意识；若使用MMF作为注射麻醉剂，则需皮下注射阿替美唑（0.75 mg/kg）、氟马西尼（0.2 mg/kg）和纳洛酮（9.12 mg/kg）进行拮抗，以逆转麻醉作用，使动物在20分钟内恢复意识。在初始苏醒阶段，使用红外加热灯保持大鼠体温。
   1. 在动物恢复足够意识、能够维持胸卧位之前，不得无人看护。
   2. 接受手术的动物在完全恢复前，不得放回与其他动物同居的环境中。
6. 术后监测大鼠是否存在痛苦的病理体征，并根据当地动物护理与使用委员会的要求给予后续镇痛处理。例如，可每12小时给予一次布托啡诺（0.05 mg/kg）。

结果

随着经验的积累，成功率几乎可达100%（即成功分离并注射动脉，且动物术后存活）。然而，大鼠术前的健康状况（肿瘤负荷程度、基础肝功能） 等等。) 显然会影响手术干预的结果。术后大鼠可能会出现短暂的体重下降以及肝酶轻度、短暂性升高，即使注射的仅为缓冲液而未含病毒。

我们此前已证明，在原位多灶性肝细胞癌（HCC）模型中，经肝动脉途径给予溶瘤型水疱性口炎病毒（VSV）或新城疫病毒（NDV）可实现高效的肿瘤转导及肿瘤特异性病毒复制^8,9。尽管这两种病毒在瘤内复制动力学上存在差异，但在各自病毒复制达到峰值的时间点，仅在HCC结节内可观察到大量病毒传播灶，表现为LacZ报告基因的阳性酶染信号，而周围正常肝组织未见病毒复制迹象（图3 和 图4，先前发表的数据^8,9）。此外，对随机选取的VSV治疗组肿瘤结节进行形态计量学分析表明，肿瘤转导效率...

讨论

尽管直接瘤内注射无疑是实现单个肿瘤结节高效转导的最简单方法，但肝动脉灌注是靶向多灶性、原位肝细胞癌（HCC）的理想给药途径。该方法在使用溶瘤病毒治疗免疫功能健全大鼠的HCC时，已被证实安全且有效。此外，由于HCC患者通常接受经动脉化疗栓塞治疗，因此本文所述方法可直接转化为临床应用。

在临床前啮齿类动物模型中，经肝动脉递送肿瘤治疗药物的一个明显缺点是该操作具有侵入性，且需要较长的时间，包括手术过程本身以及术后对大鼠的护理。研究人员若希望掌握这一技术，必须投入大量时间进行练习，以达到操作熟练，从而获得可重复的实验结果和较高的存活率。此外，由于肝动脉直径极小，迄今为止尚无在小鼠中实施肝动脉输注的报道。这是一个遗憾，因为肝细胞癌（HCC）的遗传学模型主要是在小鼠中构建的，因此我们目前只能在大鼠的移植性或化学诱导性HCC模型中测试经肝动脉给药的治疗方法。而化学诱导HCC本身常伴随普遍的肝毒性，出于安全性考虑，这可能使大鼠无法符合接受此类治疗干预的实验入选标准。

与侵入性的剖腹手术途径进行肝动脉病毒递送相比，理论上可行的方法是通过股动脉插...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
兽用剪毛器	Aesculap	GT415	小巧、无线设计的修剪器，适用于清除手术区域的毛发
体视显微镜	Zeiss	Stemi SV6
30 G 针头	Braun	4656300	30 G x ½”
1 ml 注射器	Braun	9161406V	结核菌素注射器
一次性手术刀	Feather	2975#15	#15 刀片
标准外科剪刀	Fine Science Tools	14001-13	尖头/钝头，用于切开皮肤和肌肉
艾德森齿镊	Fine Science Tools	1101-12	带齿，用于夹持皮肤和肌肉
阿尔姆拉钩	Fine Science Tools	17008-07	带钝齿，用于术中撑开腹腔
纱布拭子	Lohmann & Rauscher	18504	7.5 cm × 7.5 cm，使用前应高压灭菌
棉签拭子	Lohmann & Rauscher	11970	无菌
细尖镊子	Fine Science Tools	11063-07	0.4 mm，弯头，用于解剖肝动脉
万纳斯弹簧剪	Fine Science Tools	91500-09	用于精细切割
显微持针器	Fine Science Tools	12076-12	用于结扎胃十二指肠动脉
持针器	Fine Science Tools	12005-15	碳化钨咬合面
7-0 Prolene 缝线	Ethicon	8648H	带弯针的聚丙烯缝线，用于结扎胃十二指肠动脉
4-0 Vicryl 缝线	Ethicon	V3040H	附带弯针
红外保温灯	Beurer	IL11	用于术后维持体温