我们提出了一种生化与行为学实验方案，用于评估靶向线粒体的水溶性化合物在治疗脊髓小脑性共济失调1型（SCA1）及其他小脑神经退行性疾病中的有效性。
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摘要
摘要
线粒体功能障碍在衰老过程及神经退行性疾病中起着重要作用，其中包括多种遗传性脊髓小脑共济失调及其他以小脑进行性退化为特征的运动障碍疾病。本实验方案旨在评估脊髓小脑共济失调1型（SCA1）中的线粒体功能障碍，并通过水溶性化合物琥珀酸靶向调节代谢呼吸，评估其在延缓疾病进展方面的药理学疗效。该方法适用于其他小脑疾病，并可推广应用于多种水溶性治疗手段。
离体（ex vivo）线粒体呼吸分析用于检测和量化与疾病相关的线粒体功能改变。结合遗传学证据（未发表数据）以及脊髓小脑共济失调1型（SCA1）小鼠模型中线粒体功能障碍的蛋白质组学证据，我们通过将水溶性代谢增强剂琥珀酸直接溶解于小鼠饲养笼的饮用水中，评估其治疗效果。可通过高效液相色谱法（HPLC）推断该药物穿越血脑屏障的能力。随后可采用多种行为学范式检测这些化合物的疗效，包括加速转棒实验、平衡木实验和步态足迹分析。小脑的细胞构筑完整性可通过免疫荧光检测方法进行评估，该方法可标记浦肯野细胞的细胞核、树突及胞体。这些方法是评估小脑神经退行性疾病中线粒体功能障碍及水溶性化合物治疗效果的可靠技术。
引言
线粒体是三磷酸腺苷（ATP）的主要生成场所，ATP 是细胞能量代谢所必需的辅酶，其中大部分线粒体 ATP 通过电子传递链介导的氧化磷酸化（OXPHOS）产生。由于大脑具有较高的代谢需求，并依赖氧化磷酸化为神经活动供能，因此极易受到线粒体功能障碍的影响。因此，在衰老过程中会触发线粒体功能障碍 1，并参与多种神经退行性疾病的发病机制2,3,4。因此，线粒体成为治疗神经退行性疾病的重要潜在靶点。
在本实验方案中，我们采用脊髓小脑性共济失调1型（SCA1）作为研究线粒体功能障碍及开发靶向线粒体治疗策略的神经退行性疾病模型。SCA1由ataxin-1基因产物中的多聚谷氨酰胺（polyQ）重复序列异常扩增突变引起，该突变导致小脑浦肯野神经元及其他脑区神经元进行性退化。本研究所用的转基因小鼠品系（称为SCA1小鼠）在浦肯野细胞特异性启动子的调控下表达突变型polyQ ataxin-1转基因，从而可特异性分析SCA1中浦肯野细胞的病理成分5。SCA1小鼠会出现渐进性浦肯野细胞退化，并发展出共济失调步态6。
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方案
本方案遵循斯基德莫尔学院动物护理与使用委员会（IACUC）关于小鼠操作的指导原则。
1. 水溶性化合物处理
- 将琥珀酸溶解于小鼠笼具饮用水中，使其浓度达到 0.75 mg/mL。注意：在此步骤中，可根据需要替换为其他水溶性化合物，并调整至目标浓度。搅拌溶液以确保化合物完全溶解。
- 当小鼠达到预定的治疗年龄后，将治疗组小鼠笼具中的饮用水更换为步骤 1.1 所得的溶液。
- 每天测量治疗组和对照组水瓶的重量，以确保治疗组和对照组小鼠饮水量相同。利用这些测量数据计算每笼小鼠的总药物剂量。在整个实验过程中持续给药，并定期监测水瓶重量。
2. 足印分析
- 将跑道放置在封闭房间内的地面或桌面上。将跑道朝向铺有垫料和奖励食物的归巢箱一端设置成轻微向上的角度（例如 含糖谷物）。用一张白纸铺满跑道的整个长度。让受试对象在家居箱中适应环境 5 分钟。
- 将受试对象从饲养箱中取出，分别用蓝色和红色无毒水性颜料涂抹其左右后足。颜料足迹将用于计算多种输出行为指标。
- 将受试动物置于跑道起点，使其自行走向目标箱。当受试动物进入目标箱后，关闭闸门，让其在目标箱内停留一分钟，随后将其送回相应的饲养笼。每次实验后，用30%乙醇清洁跑道和目标箱，更换垫料、奖励食物及跑道上的纸张，以供下一只受试动物使用。
- 根据先前所述的分析方法，量化受....
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结果
通过使用琥珀酸对小脑线粒体进行药理学靶向干预，我们能够在脊髓小脑共济失调1型（SCA1）小鼠模型中预防线粒体功能障碍。将琥珀酸脱氢酶的经典电子供体琥珀酸溶解于SCA1小鼠的居家饲养饮水之中，持续给药一个月；行为学评估从给药第二周开始，治疗结束后进行神经病理学评估（图1A）。琥珀酸治疗22可改善SCA1小鼠在足迹实验、横梁实验和加速转棒实验中的表现。所观察到的行为学改善表明小鼠的运动协调能力和运动学习能力得到增强（图1B-D）。
行为学表现的改善与小脑组织的保存同时出现（图2）。与未经治疗的 SCA1 小鼠相比，琥珀酸处理显著保留了 SCA1 小鼠小脑原裂区域浦肯野细胞的胞体，并增加了分子层厚度（提示浦肯野细胞树突分支延伸）。浦肯.......
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讨论
如果按照所述方法进行操作，能够检测并缓解小脑神经退行性疾病小鼠模型中由氧化磷酸化介导的线粒体功能障碍。结合生化与行为学检测方法，可多角度评估线粒体功能障碍对小脑神经退行性疾病病理过程的贡献程度。通过给予琥珀酸处理小鼠以刺激代谢并增强线粒体功能，我们能够观察到小脑行为缺陷和小脑退行性病变的改善。
本文所述方法可用于测试多种水溶性、代谢靶向化合物，以评估其治疗小脑神经退行性疾病的潜力。琥珀酸在水中的溶解度为0.75 mg/mL，因此可通过饮水给药，无需制备添加药物的饲料颗粒。其他水溶性化合物也可轻松替换入本方案中。若使用非水溶性的代谢靶向化合物，本方法可便捷地调整为通过添加药物的饲料颗粒进行给药11，12。在测试新化合物时，必须在开始治疗前通过高效液相色谱分析（HPLC）或其他合适的检测方法，验证药物是否能够进入小脑组织。
选择这一系列病理学评估方法是因为它们在检测小脑神经退行性病变方面具有已报道的有效性。足迹实验.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
我们感谢明尼苏达大学的 Harry Orr 博士慷慨赠送转基因小鼠。我们还要感谢以下斯基德莫尔学院的校友，他们参与了前期实验工作：Monica Villegas、Porter Hall、Mitchell Spring、Nicholas Toker、Jenny Zhang、Chloe Larson 和 Cheyanne Slocum。此外，我们感谢斯基德莫尔学院为这些方法的开发提供资金支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 二磷酸腺苷 | Sigma Aldrich | A2754 | ADP |
| 抗坏血酸 | Sigma Aldrich | A7631 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma Aldrich | A2153 | BSA |
| 4',6-二脒基-2-苯基吲哚 | Sigma Aldrich | D9542 | DAPI |
| Digitonin | Sigma Aldrich | D141 | |
| 二硫苏糖醇 | Sigma Aldrich | D0632 | DTT |
| 驴血清 | Sigma Aldrich | D9663 | |
| 谷氨酸 | Sigma Aldrich | 1446600 | |
| 苹果酸 | Sigma Aldrich | 6994 | |
| 甘露醇 | Sigma Aldrich | M4125 | |
| 多聚甲醛 | Sigma Aldrich | P6148 | |
| 钾-乳酸盐山梨酸盐 | 生物糖 | 69313-67-3 | |
| 鱼藤酮 | Sigma Aldrich | R8875 | |
| 皂苷 | Sigma Aldrich | 47036 | |
| 琥珀酸 | Sigma Aldrich | S3674 | |
| N,N,N′，N′-四甲基-p-苯二胺 | Sigma Aldrich | T7394 | TMPD |
| Triton X-100 | Sigma Aldrich | T9284 | |
| 尿素 | Sigma Aldrich | U0631 | |
| Vectashield封片剂 | Vector Labs | H-1000 | |
| <强>抗体 | |||
| 11NQ 抗体（抗 ataxin-1） | 塞尔瓦迪奥， 等 1995，PMID：7647801 | ||
| Alexa Fluor 488 抗小鼠二抗 | Life Technologies | A-11015 | |
| Alexa Fluor 594 抗兔二抗 | Life Technologies | A-11012 | |
| Calbindin 抗体（山羊） | Santa Cruz | C-20 | |
| <强>动物 | |||
| 对照转基因小鼠 | Harry Orr，博士 | A02 | 伯赖特, 等 1997，PMID：9217978 |
| SCA1 小鼠 | Harry Orr，博士 | B05 | 伯赖特, 等 1997，PMID：9217978 |
| 野生型小鼠 | 杰克逊实验室 | 001800 | |
| <强>仪器设备 | |||
| ESM-100L 切片机 | ERMA | 滑动式切片机 | |
| Fluoview FV1200 共聚焦显微镜 | 奥林巴斯 | ||
| 甘油-明胶载玻片 | FD Neuro Technologies | PO101 | |
| 汉密尔顿注射器 | Sigma Aldrich | VCAT 80465 | |
| OXYT1 氧电极控制单元 | Hansatech Instruments | ||
| 聚四氟乙烯纸 | Cole-Parmer | UX-08277-15 | |
| Rotallion 转棒仪 | PPP&G | 联系通讯作者以获取信息 | |
| Ultimate 3000 高效液相色谱仪 | Dionex | ||
| <强>软件 | |||
| ImageJ | 美国国立卫生研究院 | http://imagej.nih.gov/ij/ | |
| 细胞计数插件（用于 ImageJ） | 美国国立卫生研究院 | http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html | |
| 3P&G Rota-Rod v3.3.3（转棒软件） | PPP&G | 联系通讯作者以获取信息 | |
| Phidget21.dll（旋转杆软件所需） | DLL-Files.com | https://www.dll-files.com/phidget21.dll.html |
参考文献
- Stucki, D. M., et al. Mitochondrial impairments contribute to Spinocerebellar ataxia type 1 progression and can be ameliorated by the mitochondria-targeted antioxidant MitoQ. Free Radic Biol Med. 97, 427-440 (2016).
- Breuer, M. E., Willems, P. H., Russel, F. G., Koopman, W. J., Smeitink, J. A.
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重印与许可
