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方法文章

使用水溶性化合物非特异性增强线粒体功能治疗 SCA1 小鼠

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DOI：

10.3791/53758

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2017年1月22日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Neuroscience Program, Skidmore College, 2Chemistry Department, Skidmore College, 3Health and Exercise Science Department, Skidmore College

本文内容

摘要

我们提出了一种生化与行为学实验方案，用于评估靶向线粒体的水溶性化合物在治疗脊髓小脑性共济失调1型（SCA1）及其他小脑神经退行性疾病中的有效性。

摘要

线粒体功能障碍在衰老过程及神经退行性疾病中起着重要作用，其中包括多种遗传性脊髓小脑共济失调及其他以小脑进行性退化为特征的运动障碍疾病。本实验方案旨在评估脊髓小脑共济失调1型（SCA1）中的线粒体功能障碍，并通过水溶性化合物琥珀酸靶向调节代谢呼吸，评估其在延缓疾病进展方面的药理学疗效。该方法适用于其他小脑疾病，并可推广应用于多种水溶性治疗手段。

离体（ex vivo）线粒体呼吸分析用于检测和量化与疾病相关的线粒体功能改变。结合遗传学证据（未发表数据）以及脊髓小脑共济失调1型（SCA1）小鼠模型中线粒体功能障碍的蛋白质组学证据，我们通过将水溶性代谢增强剂琥珀酸直接溶解于小鼠饲养笼的饮用水中，评估其治疗效果。可通过高效液相色谱法（HPLC）推断该药物穿越血脑屏障的能力。随后可采用多种行为学范式检测这些化合物的疗效，包括加速转棒实验、平衡木实验和步态足迹分析。小脑的细胞构筑完整性可通过免疫荧光检测方法进行评估，该方法可标记浦肯野细胞的细胞核、树突及胞体。这些方法是评估小脑神经退行性疾病中线粒体功能障碍及水溶性化合物治疗效果的可靠技术。

引言

线粒体是三磷酸腺苷（ATP）的主要生成场所，ATP 是细胞能量代谢所必需的辅酶，其中大部分线粒体 ATP 通过电子传递链介导的氧化磷酸化（OXPHOS）产生。由于大脑具有较高的代谢需求，并依赖氧化磷酸化为神经活动供能，因此极易受到线粒体功能障碍的影响。因此，在衰老过程中会触发线粒体功能障碍 1，并参与多种神经退行性疾病的发病机制2,3,4。因此，线粒体成为治疗神经退行性疾病的重要潜在靶点。

在本实验方案中，我们采用脊髓小脑性共济失调1型（SCA1）作为研究线粒体功能障碍及开发靶向线粒体治疗策略的神经退行性疾病模型。SCA1由ataxin-1基因产物中的多聚谷氨酰胺（polyQ）重复序列异常扩增突变引起，该突变导致小脑浦肯野神经元及其他脑区神经元进行性退化。本研究所用的转基因小鼠品系（称为SCA1小鼠）在浦肯野细胞特异性启动子的调控下表达突变型polyQ ataxin-1转基因，从而可特异性分析SCA1中浦肯野细胞的病理成分5。SCA1小鼠会出现渐进性浦肯野细胞退化，并发展出共济失调步态6。

线粒体复合物功能障碍及线粒体靶向治疗效果可通过一系列分子与行为检测方法进行评估。线粒体复合物功能障碍的检测指标包括 离体 通过呼吸测定法检测小脑组织在电子传递链底物和抑制剂存在下氧消耗的变化 7呼吸测定实验此前已应用于透化组织、线粒体分离物及完整组织。 7,8,9它们能够直接评估线粒体功能，而不同于透射电子显微镜或免疫荧光染色等形态学数据采集方法。使用完整组织而非分离的线粒体，可避免在线粒体分离过程中可能发生的对健康线粒体的偏倚性选择 7当按照所示方案进行调整时，呼吸测定法是检测小脑神经退行性疾病状态下线粒体功能障碍的一种有效方法。

可以使用非特异性的代谢激活剂来推断神经退行性疾病转基因小鼠模型中的线粒体功能障碍，并有助于开发新的治疗方法。槲皮素、辅酶Q10和肌酸均已被证明可在神经退行性疾病患者及动物模型中改善疾病病理 10,11,12,13,14,15,16。本文中，我们提出一种新型代谢激活剂——琥珀酸，用于促进代谢并增强神经退行性疾病中的线粒体功能。为确保该激活剂能够穿过血脑屏障，我们采用高效液相色谱法（HPLC）检测经处理小鼠神经组织中的药物递送情况 17。

为了评估琥珀酸等代谢靶向性水溶性化合物的治疗效果，可采用一系列行为学范式和免疫病理学研究方法。由于小脑神经退行性疾病存在运动协调功能障碍，常使用足迹跑道实验、横梁实验和加速旋转杆实验来检测行为病理学的改善情况6, 18, 19。这些行为学指标可结合小脑细胞结构的免疫病理学评估进行补充，包括测定小脑皮层分子层厚度（定义为浦肯野细胞树突树的长度）以及在特定小脑叶段内浦肯野细胞胞体数量6, 20, 21。本文介绍了多种用于检测和治疗线粒体功能障碍的神经病理学及行为学方法，结合代谢靶向性水溶性化合物的应用。

我们使用 离体 通过分析SCA1转基因小鼠的线粒体呼吸功能来评估其线粒体功能障碍。此外，我们发现水溶性线粒体增强剂琥珀酸可改善疾病症状和病理变化，进一步表明线粒体功能障碍在SCA1疾病进展中起重要作用。

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方案

本方案遵循斯基德莫尔学院动物护理与使用委员会（IACUC）关于小鼠操作的指导原则。

1. 水溶性化合物处理

  1. 将琥珀酸溶解于小鼠笼具饮用水中，使其浓度达到 0.75 mg/mL。注意：在此步骤中，可根据需要替换为其他水溶性化合物，并调整至目标浓度。搅拌溶液以确保化合物完全溶解。
  2. 当小鼠达到预定的治疗年龄后，将治疗组小鼠笼具中的饮用水更换为步骤 1.1 所得的溶液。
  3. 每天测量治疗组和对照组水瓶的重量，以确保治疗组和对照组小鼠饮水量相同。利用这些测量数据计算每笼小鼠的总药物剂量。在整个实验过程中持续给药，并定期监测水瓶重量。

2. 足印分析

  1. 将跑道放置在封闭房间内的地面或桌面上。将跑道朝向铺有垫料和奖励食物的归巢箱一端设置成轻微向上的角度（例如 含糖谷物）。用一张白纸铺满跑道的整个长度。让受试对象在家居箱中适应环境 5 分钟。
  2. 将受试对象从饲养箱中取出，分别用蓝色和红色无毒水性颜料涂抹其左右后足。颜料足迹将用于计算多种输出行为指标。
  3. 将受试动物置于跑道起点，使其自行走向目标箱。当受试动物进入目标箱后，关闭闸门，让其在目标箱内停留一分钟，随后将其送回相应的饲养笼。每次实验后，用30%乙醇清洁跑道和目标箱，更换垫料、奖励食物及跑道上的纸张，以供下一只受试动物使用。
  4. 根据先前所述的分析方法，量化受试者的步数、步幅宽度、步角以及转身次数 6成功的足迹试验定义为：受试者在不转身或不停止的情况下，朝目标箱方向行走，且至少留下5个连续的足印。

3. 光束分析

  1. 根据先前所述的横杆规格设置横杆装置6，包括以下6根横杆：横杆1 = 矩形，28 mm 宽度；横杆2 = 圆形，28 mm 直径；横杆3 = 矩形，12 mm 宽度；横杆4 = 圆形，12 mm 直径；横杆5 = 矩形，6 mm 宽度；横杆6 = 圆形，6 mm 直径。在横杆的一端设置一个遮光的归巢箱，并放入奖励食物。
  2. 训练受试动物通过横杆时，使用横杆3组装装置。将受试动物轻柔地放置在横杆远离归巢箱的一端，使其自行走过横杆。允许每只受试动物最多进行三次、每次2分钟的尝试，成功标准为在2分钟内穿过横杆并进入归巢箱。每次尝试之间，让受试动物在归巢箱中休息2分钟。每只受试动物测试结束后，用30%乙醇清洁横杆和归巢箱，并更换奖励食物，为下一只受试动物做好准备。
  3. 在接下来的两天中，每天重复步骤3.2一次，共完成连续3天的训练。测试日（第4天）应紧接在训练日之后进行。
  4. 在第4天进行测试时，首先使用横杆1组装装置，并按照步骤3.1设置归巢箱。在装置前方放置一台摄像机，确保能够清晰录制整个横杆装置。开始录像后，将第一只受试动物放置在横杆远离归巢箱的一端，允许其最多进行三次、每次2分钟的尝试以完成一次成功测试。每次尝试之间，让受试动物在归巢箱中休息2分钟。
  5. 继续按数字顺序对每只受试动物依次测试六根横杆，每次更换横杆前，让受试动物在归巢箱中休息2分钟。每只受试动物测试结束后，用30%乙醇清洁每根横杆和归巢箱，并更换奖励食物，为下一只受试动物做好准备。
    1. 对每次测试进行录像，并记录每只受试动物在每根横杆上的成功测试次数，记录方式如下：“1”表示受试动物在第一次尝试中成功，“2”表示在第二次尝试中成功，“3”表示在第三次（即最后一次）尝试中成功，“4”表示在三次尝试中均未成功。
  6. 使用测试的录像资料，由对受试动物实验条件设盲的评分者测量踩空次数。踩空定义为后肢在摄像机直接视野下下落到横杆长度方向理论中线以下。对多位评分者的踩空评分结果取平均值。
  7. 为分析成功测试次数和踩空次数的数据，计算每种基因型和实验条件组内的均值及标准误。采用单因素方差分析（one-way ANOVA）及事后多重比较（post-hoc analysis），以确定处理方式和基因型对成功测试次数和踩空次数是否存在显著影响。

4. 加速旋转杆

  1. 在试验开始前10分钟，将实验动物置于检测室中进行适应。在此适应期间，准备转棒仪装置，并用30%乙醇清洁装置的每个通道。
  2. 打开转棒仪软件，将起始转速设为4 rpm，加速时间设为5分钟，最终转速设为40 rpm。这些设置可在5分钟内使转速从4 rpm匀加速至40 rpm。小鼠在加速阶段结束后仍可在40 rpm转速下继续运行最多5分钟，单次最长运行时间为10分钟。
  3. 适应结束后，当转棒以4 rpm旋转时，将实验动物分别放置到对应通道中。待所有动物均放置到位后，开始第一次试验。使用仪器软件记录每只动物跌落的潜伏期；可另用计时器作为备用记录手段。
  4. 一次试验结束后，让每只动物在其对应通道的停留区休息10分钟，再进行下一次试验，以避免疲劳影响。
  5. 重复步骤4.3和4.4，共完成四次试验。
  6. 连续四天重复步骤4.3至4.5，在整个试验期间持续给予相应处理。试验结束后，对每只动物在每次试验中的跌落潜伏期进行量化分析6。

5. 小脑提取与固定

  1. 处死小鼠 通过 根据机构IACUC指南，采用二氧化碳窒息法处死动物。将实验对象放入二氧化碳舱内，随后向舱内释放二氧化碳。在实施安乐死过程中须全程观察动物，不得使其无人看管。
  2. 一旦呼吸停止，且通过后肢足部加压确认受试对象无痛觉反应后，将受试对象移出舱室，沿颅骨中线从颅骨中部向后至颅底，通过上皮组织做一正中切口。
  3. 使用解剖剪从脊髓基部沿矢状缝剪至前囟，将颅骨切开。随后沿两侧冠状缝横向剪开，再用钝头镊子取下额骨、顶骨和间顶骨。
  4. 用钝头镊子折断小脑外侧的颅骨。用镊子将小脑与丘脑及脑干分离，并从小脑周围组织中取出。用镊子将小脑分为左、右半球。
  5. 立即 将右侧小脑组织放入液氮中保存，用于HPLC分析；将左侧小脑组织放入预冷的4%多聚甲醛（PFA）中进行组织固定。在剪断主动脉前，按照机构IACUC规定采集其他感兴趣的组织，随后按规范处理 carcass。
    警告： PFA 是一种剧毒、易燃且具有腐蚀性的物质。
  6. 提取后24小时，将经PFA（4% PBS溶液）固定的组织在磷酸盐缓冲液（PBS）中洗涤（每次5分钟，共洗三次），随后将组织置于4 °C的30%蔗糖溶液中浸泡不超过2周。

6. 免疫病理学检测

  1. 将滑动式切片机的水管连接至水龙头和温度控制箱。使用温度控制箱将切片机载物台冷却至 -25 °C。将切片厚度调节旋钮设定为 50 µm。
    注意：如果滑动式切片机的旋钮无法精确调至 50 μm，则将旋钮设为更薄的刻度，并通过多次切片叠加达到目标总厚度（例如，将旋钮设为 10 µm，切片前移动五次，以获得总计 50 µm 的厚度）。
  2. 在载物台上滴加约硬币大小的低温切割最佳介质（Optimal Temperature Cutting, OTC）溶液。在 OTC 冻结前，用镊子将半球形组织放置于 OTC 层上，使其中矢状面切面朝下。操作需迅速，用镊子轻轻调整组织方向，使半球的外侧尖端朝向刀片，且位于载物台上方。待 OTC 完全冻结。
    1. 逐层操作，在组织周围添加额外的 OTC，每加一层后待其完全冻结再进行下一层。在组织上方覆盖一层薄 OTC 并冻结。
  3. 进行切片，切片过程中均匀施加压力于切割刀片上。使用精细的艺术家画笔收集切片，并将其放入含有 1× PBS 的适当标记的孔板中。每次切片之间，如有必要，重新将滑动式切片机的厚度调节旋钮重置为 50 µm。
  4. 将孔板各孔中的 PBS 替换为尿素溶液 [PBS 中含 0.01 M 尿素]，并将孔板置于冰上。准备就绪后，从冰上取出孔板，将切片在尿素溶液中煮沸三次，每次 15 秒，以暴露抗原表位用于免疫标记。此步骤可通过将孔板置于设定为沸腾温度的加热块上来轻松完成。每次煮沸后，将含有组织切片的孔板放回冰上冷却。
    注意：若在 96 孔板中进行尿素处理、封闭、一抗、二抗及 DAPI 染色步骤，则全程使用 100 μL 体积；若使用不同规格的孔，则相应调整试剂体积。若无加热块，也可使用微波炉在尿素溶液中煮沸组织样本。将样本以高功率微波加热，每次 15 秒，共三次。
  5. 煮沸处理后，用 PBS 洗涤切片三次，每次更换溶液后轻轻振荡 10 分钟。
  6. 使用驴血清封闭液（含 3% 正常驴血清和 0.3% Triton X-100 的 PBS 溶液）在室温下轻柔振荡孵育一小时以封闭非特异性结合位点。孵育结束后移除驴血清溶液。
  7. 在驴血清溶液中加入 0.2 µg/mL 抗钙结合蛋白（anti-calbindin）抗体和 1:2,000 稀释的抗ataxin-1 抗体（11NQ）16，对切片进行标记，并在 4 °C 下轻柔振荡孵育 72 小时。
  8. 参照步骤 6.5 的方法用 PBS 洗涤切片，随后在 4 °C 下用适当的二抗溶液（驴血清溶液中稀释 1:500 的 Alexa Fluor-488 标记抗山羊抗体和 1:500 的 Alexa Fluor-594 标记抗兔抗体）轻柔振荡孵育 48 小时。
  9. 参照步骤 6.5 的方法用 PBS 洗涤切片三次，然后用 DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）溶液对细胞核进行染色，DAPI 用 PBS 稀释至终浓度为 0.5 μg/mL。DAPI 孵育时间不得超过十分钟。孵育结束后移除溶液，并参照步骤 6.5 的方法用 PBS 洗涤。
  10. 将组织切片用抗荧光淬灭封片剂封固于 2% 明胶包被的载玻片上，加盖盖玻片并用指甲油封边。
  11. 使用扫描共聚焦显微镜在明场光下定位小脑初级裂。使用 10X UIS2 物镜，依次采用 405 nm 激光二极管、488 nm 氩离子气体激光器和 559 nm 激光二极管激发 DAPI、AlexaFluor-488 和 AlexaFluor-594 荧光通道，配合 DM488/559 nm 二向色镜进行扫描。
    1. 针对每个荧光通道，在初级裂区域内构建 z-堆栈图像，设定 z 范围为 20 μm，步进为 0.1 μm。使用共聚焦显微镜配套的后期处理软件在最终图像中添加尺寸标尺。
      注意：可根据设备条件替换其他可用的激光器、滤光片和荧光染料。若 AlexaFluor-488 或 AlexaFluor-594 的信号较弱，可使用磷化镓（GaAsP）高灵敏度探测器增强信号（如设备支持）。

7. 分子层厚度和浦肯野细胞数量的定量分析

  1. 使用 ImageJ 打开染色原发裂的 z 轴层叠图像，并通过从菜单栏选择“Image”，在 Image 选项卡中选择“Color”，然后在 Color 选项卡中选择“Split Channels”，将每幅图像拆分为红色、蓝色和绿色通道。
  2. 对拆分后的每个通道创建最大 Z 投影。当目标通道图像打开时，从菜单栏选择“Image”，在 Image 选项卡中选择“Sections”，然后在 Sections 选项卡中选择“Z-project”。在“Z-project”命令窗口中，选择“Max Z projection”，然后点击“Okay”。对每个通道重复此操作。
  3. 通过从菜单栏选择“Plugins”，在 Plugins 选项卡中选择“Analyze”，然后在 Analyze 选项卡中选择"Cell Counter"，打开细胞计数插件。
    注意：ImageJ 及其 ImageJ 细胞计数插件可从材料与设备表中提供的网站下载。
  4. 通过计数沿原发裂前部和后部预设 200 µm 区段分布的 ataxin-1 标记的细胞核，量化浦肯野细胞数量。通过从菜单栏选择“Image”，在 Image 选项卡中选择“Adjust”，然后在 Adjust 选项卡中选择“Threshold”，生成目标通道（如 ataxin-1 标记细胞核对应的红色通道）的阈值图。
    1. 选择一个可在整个量化过程中标准化的像素范围（例如 31–225 像素）。在阈值窗口中勾选 "Dark Background" 以去除图像中的噪声。为便于计数，可对图像信号进行反相处理。
  5. 使用“Split Channels”和“Threshold Map”工具（如步骤 7.1 和 7.2 所述），在绿色通道中量化分子层厚度。以每幅图像上的尺寸标记为参考，在每幅原发裂图像中两个指定的 200 µm 区段内，随机测量三个分子层长度。测量范围应从浦肯野细胞体基部的浦肯野树突分支近端，延伸至树突分支的远端。
  6. 将浦肯野细胞计数和分子层厚度记录为均值 ± 标准误差。采用单因素方差分析（one-way ANOVA）结合事后多重比较（post-hoc analysis），检验处理条件或基因型对细胞数量及树突分支长度的影响。

8. 治疗后小脑琥珀酸浓度的高效液相色谱分析

  1. 样品分析前准备
    1. 在进行高效液相色谱（HPLC）分析前，称量每份收获的右侧小脑半球。每次将一个半球组织置于预冷的Dounce匀浆器中切碎，并向每个匀浆后的组织中加入0.5 mL体积比为75:25的水:甲醇溶液17。
    2. 使用窄径预冷匀浆器，以5次Dounce冲打初步破碎组织。随后使用较宽径的匀浆器进一步精细匀浆，进行20次Dounce冲打。
    3. 将匀浆液转移至预冷的微量离心管中。每处理完一个样品后，用0.5 mL冰浴的水:甲醇溶液冲洗匀浆器，并将冲洗液一并加入微量离心管中。
    4. 在25 °C条件下，以1,300 × g离心30分钟，收集上清液至洁净的微量离心管中。
    5. 将上清液通过装有再生纤维素滤膜（标称分子量截留值为10千道尔顿，kDa）的离心过滤装置进行过滤。若不立即进行HPLC分析，应将过滤后的样品储存在-80 °C条件下。
  2. HPLC仪器设置与条件
    1. 将一根长度至少为30 cm、粒径为7 µm的离子排阻色谱柱连接至高效液相色谱仪。
    2. 配制足量的1 mM乙酸盐缓冲液，并进行脱气处理，调节其pH至5。
    3. 设置HPLC流动相流速为0.8 mL/min。若使用紫外-可见光（UV-vis）检测器，选择224 nm作为检测波长。在此条件下，琥珀酸的典型洗脱时间在10至12分钟之间。
  3. 标准品与样品的运行及分析
    1. 在乙酸盐缓冲流动相中配制一组琥珀酸浓度介于0至250 ppm之间的标准品溶液。
    2. 依次运行各标准品，并根据每次运行测得的峰面积绘制标准曲线。
    3. 获得准确的标准曲线后，将先前制备的样品用乙酸盐缓冲液稀释后上样分析。为提高测量准确性，可在样品中加入已知浓度的琥珀酸标准品（用流动相稀释），所有样品均需设置三重复进样。
    4. 通过标准曲线分析HPLC色谱图，确定各样品中琥珀酸的浓度，再乘以样品体积并除以原始样品质量，计算最终浓度。

9. 离体 使用氧电极控制单元分析小脑线粒体功能

  1. 使用市售系统制备克拉克型电极：首先在铂阴极上滴加一滴氯化钾（50% w/v KCl）溶液，剪取一块面积为1.5 cm2的商用卷烟纸，轻轻覆盖在铂阴极上。
    1. 用一块2.5 cm2的聚四氟乙烯（P.T.F.E）膜覆盖阴极及周围的阳极，并用O型圈紧密固定两层膜，确保膜内无皱褶或气泡。向周围凹槽中滴加50% KCl溶液。
  2. 将预制电极固定于检测室中，并加入已饱和空气的水。将检测室加热至30 °C，在溶液中放入一根0.8 cm的搅拌子，并使用仪器软件以70 rpm的速度搅拌。通过建立零氧状态校准检测室：依次向溶液中加入少量还原剂连二亚硫酸钠晶体。
    1. 校准完成后，先用70%乙醇清洗检测室一次，再用去离子水清洗六次，然后让检测室在1.5 mL呼吸缓冲液（5 mM MgCl2、60 mM KCl、100 mM甘露醇、10 mM KH2PO4、0.5 mM Na2EDTA、60 mM Tris-HCl [pH 7.4]）中平衡适应7。
      注意：在进行呼吸实验测定氧浓度前，必须在清洗步骤中彻底去除所有连二亚硫酸钠残留。
  3. 将称重后的小脑半球组织在0.5 mL匀浆缓冲液（0.25 M蔗糖、0.5 mM EDTA、50 mM Tris-HCl [pH 7.4]）中轻轻匀浆。将匀浆液转移至洁净的1.5 mL微量离心管中，保持低温直至开始检测。
  4. 将匀浆液加入检测室，使终体积达到2 mL。加入40 µL毛地黄皂苷或皂苷（5 mg/mL）以通透化小脑匀浆；使匀浆组织在溶液中孵育10分钟。
    注意：毛地黄皂苷和皂苷具有毒性，孵育时间应尽可能缩短。
  5. 为开始记录耗氧量，分别通过底物和抑制剂激活或抑制氧化磷酸化链，以评估线粒体功能（每个底物记录3分钟）。
    1. 使用洁净的注射器依次加入以下底物：10 µL 2 M谷氨酸 [终浓度 (f.c) 0.01 M]、5 µL 0.8 M苹果酸 [f.c. 2 mM]、20 µL 0.5 M二磷酸腺苷（ADP）[f.c. 5 mM]、1 µL 1 mM鱼藤酮 [f.c. 0.5 µM]、20 µL 1 M琥珀酸 [10 mM]、1 µL 5 mM抗霉素A [f.c. 2.5 µM]、1 µL 0.8 M抗坏血酸 [f.c. 0.4 mM]，以及5 µL 0.2 M四甲基对苯二胺（TMPD）[f.c. 0.5 mM]。向检测室中添加底物时，注意避免引入气泡。
      注意：每种底物和抑制剂所诱导的功能效应的详细信息已在先前发表的方案中描述7。对于尚未研究过的样本/组织/物种，可能需要建立个体化的剂量-反应曲线，以确定底物和抑制剂的最佳浓度。同样，该方案也可根据所研究组织/物种固有的代谢特性（如底物偏好性）进行优化。
  6. 数据采集完成后，轻柔吸出小脑匀浆液，并用乙醇和去离子水清洗检测室。清洗干净后，只要P.T.F.E膜保持完整，即可在无需重新校准的情况下继续运行其他小脑匀浆样本。最终使用结束后，用去离子水和乙醇清洗电极，并与硅胶或干燥剂一同储存。
    注意：同一天内多次运行之间，应将检测室充满去离子水，确保膜不会干燥。
  7. 利用仪器软件生成的数据表，将从添加底物后两分钟开始的40分钟呼吸数据导出至电子表格程序。
  8. 计算每种底物或抑制剂条件下的呼吸速率。通过将总呼吸速率除以抗坏血酸-TMPD底物添加时的呼吸速率，对数据进行归一化处理。
    注意：呼吸速率可进一步根据组织蛋白含量进行归一化，这在组织含量可能发生变化的神经退行性疾病实验中尤为必要。为此，可保留步骤9.3中的50 μL样品匀浆液，用于标准蛋白定量分析。

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结果

通过使用琥珀酸对小鼠小脑线粒体进行药理学靶向干预，我们能够在脊髓小脑性共济失调1型（SCA1）小鼠模型中预防线粒体功能障碍。将琥珀酸脱氢酶的经典电子供体——琥珀酸溶解于SCA1小鼠的笼内饮用水中，持续给药一个月；行为学评估从给药第二周开始，治疗结束后进行神经病理学评估（图1A）。琥珀酸治疗22可改善SCA1小鼠在足印实验、横梁实验和加速转棒实验中的表现。所观察到的行为学改善表明小鼠的运动协调能力和运动学习能力增强（图1B-D）。

行为学表现的改善与小脑组织的保存同时出现图2）。与未经治疗的 SCA1 小鼠相比，琥珀酸处理显著保留了 SCA1 小鼠小脑原裂区域浦肯野细胞的胞体，并增加了分子层厚度（提示浦肯野细胞树突分支延伸）。浦肯...

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讨论

如果按照所述方法进行操作，能够检测并缓解小脑神经退行性疾病小鼠模型中由氧化磷酸化介导的线粒体功能障碍。结合生化与行为学检测方法，可多角度评估线粒体功能障碍对小脑神经退行性疾病病理过程的贡献程度。通过给予琥珀酸处理小鼠以刺激代谢并增强线粒体功能，我们能够观察到小脑行为缺陷和小脑退行性病变的改善。

本文所述方法可用于测试多种水溶性、代谢靶向化合物，以评估其治疗小脑神经退行性疾病的潜力。琥珀酸在水中的溶解度为0.75 mg/mL，因此可通过饮水给药，无需制备添加药物的饲料颗粒。其他水溶性化合物也可轻松替换入本方案中。若使用非水溶性的代谢靶向化合物，本方法可便捷地调整为通过添加药物的饲料颗粒进行给药11，12。在测试新化合物时，必须在开始治疗前通过高效液相色谱分析（HPLC）或其他合适的检测方法，验证药物是否能够进入小脑组织。

选择这一系列病理学评估方法是因为它们在检测小脑神经退行性病变方面具有已报道的有效性。足迹实验...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢明尼苏达大学的 Harry Orr 博士慷慨赠送转基因小鼠。我们还要感谢以下斯基德莫尔学院的校友，他们参与了前期实验工作：Monica Villegas、Porter Hall、Mitchell Spring、Nicholas Toker、Jenny Zhang、Chloe Larson 和 Cheyanne Slocum。此外，我们感谢斯基德莫尔学院为这些方法的开发提供资金支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
二磷酸腺苷Sigma AldrichA2754ADP
抗坏血酸Sigma AldrichA7631
牛血清白蛋白Sigma AldrichA2153BSA
4',6-二脒基-2-苯基吲哚Sigma AldrichD9542DAPI
DigitoninSigma AldrichD141
二硫苏糖醇Sigma AldrichD0632DTT
驴血清Sigma AldrichD9663
谷氨酸Sigma Aldrich1446600
苹果酸Sigma Aldrich6994
甘露醇Sigma AldrichM4125
多聚甲醛Sigma AldrichP6148
钾-乳酸盐山梨酸盐生物糖69313-67-3
鱼藤酮Sigma AldrichR8875
皂苷Sigma Aldrich47036
琥珀酸Sigma AldrichS3674
N,N,N′，N′-四甲基-p-苯二胺Sigma AldrichT7394TMPD
Triton X-100Sigma AldrichT9284
尿素Sigma AldrichU0631
Vectashield封片剂Vector LabsH-1000
<强>抗体
11NQ 抗体（抗 ataxin-1）塞尔瓦迪奥， 等 1995，PMID：7647801
Alexa Fluor 488 抗小鼠二抗Life TechnologiesA-11015
Alexa Fluor 594 抗兔二抗Life TechnologiesA-11012
Calbindin 抗体（山羊）Santa CruzC-20
<强>动物
对照转基因小鼠Harry Orr，博士A02伯赖特, 等 1997，PMID：9217978
SCA1 小鼠Harry Orr，博士B05伯赖特, 等 1997，PMID：9217978
野生型小鼠杰克逊实验室001800
<强>仪器设备
ESM-100L 切片机ERMA滑动式切片机
Fluoview FV1200 共聚焦显微镜奥林巴斯
甘油-明胶载玻片FD Neuro TechnologiesPO101
汉密尔顿注射器Sigma AldrichVCAT 80465
OXYT1 氧电极控制单元Hansatech Instruments
聚四氟乙烯纸Cole-ParmerUX-08277-15
Rotallion 转棒仪PPP&G联系通讯作者以获取信息
Ultimate 3000 高效液相色谱仪Dionex
<强>软件
ImageJ美国国立卫生研究院http://imagej.nih.gov/ij/
细胞计数插件（用于 ImageJ）美国国立卫生研究院http://rsb.info.nih.gov/ij/plugins/cell-counter.html
3P&G Rota-Rod v3.3.3（转棒软件）PPP&G联系通讯作者以获取信息
Phidget21.dll（旋转杆软件所需）DLL-Files.comhttps://www.dll-files.com/phidget21.dll.html

参考文献

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使用水溶性化合物非特异性增强线粒体功能治疗 SCA1 小鼠
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