大鼠少突胶质细胞前体培养物的制备及利用双红外荧光扫描定量少突胶质生成

摘要

少突胶质细胞是中枢神经系统的髓鞘形成细胞。本方案描述了一种从大鼠大脑皮层分离和培养其前体细胞——少突胶质前体细胞的方法，以及一种快速、可靠的定量评估少突胶质细胞生成的方法 体外 在实验因素作用下的反应。

摘要

高效的少突胶质细胞生成是包括脊髓损伤、新生儿缺氧以及多发性硬化症和横贯性脊髓炎等脱髓鞘疾病在内的多个研究领域的治疗目标。髓鞘形成不仅有助于中枢神经系统内神经冲动的快速传导，还能为 underlying 轴突提供营养支持。少突胶质前体细胞（OPCs）可被用于研究 体外 以帮助识别可能促进或抑制少突胶质细胞分化的因素。迄今为止，可用于评估该过程的许多方法要么需要大量细胞，从而限制了单次可同时研究的条件数量，要么依赖于耗时费力的定量方法。本文中，我们描述了一种用于分离大量高纯度少突胶质前体细胞（OPCs）的方案，以及一种快速、可靠的方法，可同时测定多种条件下少突胶质细胞生成情况。OPCs 从出生后第5至第7天（P5–P7）的新生大鼠大脑皮层中分离获得，并进行培养 体外 分化前三天。分化四天后，采用双红外荧光扫描分析法评估少突胶质细胞生成，以检测髓鞘蛋白的表达。

引言

哺乳动物中枢神经系统（CNS）中高效的神经传导依赖于少突胶质细胞对轴突的髓鞘化。在发育过程中，少突胶质细胞来源于一群少突胶质前体细胞（OPCs），这些前体细胞被认为从发育中的前脑和神经管的室管膜区迁移而来¹迁移后，少突胶质前体细胞分化为成熟的、具有髓鞘形成能力的少突胶质细胞，这些细胞不仅促进神经冲动的高效传导，还为轴突提供营养支持²成年中枢神经系统中存在大量少突胶质前体细胞（OPCs），这些细胞广泛分布于灰质和白质中，约占全部细胞的5-8%³脱髓鞘损伤发生后，少突胶质前体细胞（OPCs）会迁移至损伤部位，增殖并分化，以替代暴露轴突上丢失或受损的髓鞘。然而，在某些疾病或损伤情况下，该过程可能效率低下，甚至完全失败。⁴尽管慢性脱髓鞘被认为会加重疾病负担，但有效的少突胶质细胞生成和再髓鞘化可能缓解症状⁵因此，研究少突胶质前体细胞（OPCs）引起了人们的关注 体外 以确定实验因素对少突胶质发生的影响。

通过鉴定各阶段特异性细胞标志物，现已能够深入了解少突胶质细胞分化过程中的不同阶段。自我更新的早期祖细胞以其表达血小板源性生长因子受体α（PDGFRα）、神经胶质抗原2（NG2）和A2B5为特征。^6-8当少突胶质前体细胞（OPCs）启动其分化程序并退出细胞周期时，它们会下调这些标志物的表达，转而开....

方案

涉及动物受试者的实验程序已获得机构动物护理和使用委员会（IACUC）以及约翰斯·霍普金斯医学院的批准。

1. 检测板、储备液和少突胶质前体细胞基础培养基的制备

注意：此处所述的大鼠 OPC 基础（Sato）培养基源自先前已发表的研究^12,13。其他培养基配方也可能适用于本实验步骤。

1. 用无菌去离子水将多聚-L-赖氨酸（PLL）重悬至浓度为 10 µg/ml。将 400 μl 稀释后的 PLL 加入黑色侧壁、透明底的 24 孔组织培养板的每个孔中。
2. 在 37 °C 组织培养孵育箱中孵育 2 小时，或在 4 °C 冰箱中过夜，以完成组织培养板的包被。
3. 在接种细胞前至少 20 分钟吸除包被后的孔中 PLL 溶液。将 24 孔板盖子部分打开，置于组织培养超净台中，使残留的 PLL 溶液自然干燥。接种少突胶质前体细胞（OPCs）前需确认各孔已完全干燥。若孔内存在液态 PLL，细胞将无法在塑料表面贴附。
4. 配制 N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）储备液（1,000 倍）：将 100 mg N-乙酰-L-半胱氨酸（NAC）溶解于 20 ml 杜尔贝科改良伊格尔培养基（DMEM）中。分装后于 -20 °C 保存。
5. 配制氢化可的松储备液（1,000 倍）：向 1 mg 氢化可的松中加入 1 ml 乙醇，轻轻旋转使其溶解。再加入 19 ml DMEM，混匀后分装，于 -....

结果

通过使用磁性柱分离系统进行阳性细胞筛选，分离出A2B5阳性的少突胶质前体细胞（OPCs）。在分离操作之前，需从出生后5至7天（P5-P7）的大鼠幼鼠中取出全脑。当全脑成功从颅骨中分离后，使用精细的手术镊子去除嗅球和小脑（图1A）。为了分离大脑皮层组织，需通过精细解剖切除下丘脑、丘脑和中脑（图1B）。接着，使用弯头手术镊子去除海马和纹状体（图1C-图1D）。该分离过程可有效去除脑膜细胞和成纤维细胞，但在去除脑膜和血管组织后，酶消化效果更佳（图1E）。最后，将组织切成1 mm × 1 mm大小的组织块，用于后续的组织解离步骤（图1F）。

一次成功的 OPC 分离应在最终离心步骤后获得一个致密的细胞沉淀（图 2A）。接种后，.......

讨论

本文所述方案介绍了一种快速、可靠的大鼠少突胶质前体细胞（OPCs）分离与定量方法 体外 少突胶质细胞生成对实验因素的响应。通过阳性筛选，可直接获得高产量的有活力且纯度高的少突胶质前体细胞用于实验。该方法将分离、培养和分化步骤简化至一周内完成，固定后的细胞可方便地在4 °C保存数周，且检测灵敏度无任何损失。

基于扫描仪的荧光检测方法的一个主要优势在于，与传统的基于相机的显微镜技术相比，数据采集和分析速度显著加快。尽管显微镜技术已成功应用于高通量筛选以鉴定少突胶质前体细胞（OPC）分化的诱导剂，但其数据采集本质上较慢，因为需要编程设定图像采集序列，耗时数小时的数据收集，分析数百至数千个图像文件，并依赖用户自定义算法来识别单个细胞体以进行归一化或分析^18,19。此外，使用基于相机的显微系统无法从培养容器的整个表面获取数据。相反，必须从单个孔内的不同区域获取代表性图像，这可能导致位置偏差和假阳性结果。相比之下，本检测方法可检测给定孔内所有细胞的MBP表达情况，并且可同时扫描多块板。虽然该方法可适用于96孔板或384孔板格式，但在测试处理组较少的情况下.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
解剖材料
不含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 PBS	Mediatech	21-040-CV	1x
10 cm 聚苯乙烯培养皿	Fisherbrand	0857512
体视解剖显微镜	Motic	SM2-168
解离材料
管式旋转仪	Miltenyi Biotec	130-090-753	解离用管式旋转仪
神经组织解离试剂盒（P型）	Miltenyi Biotec	130-092-628	酶解解离试剂盒
含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 PBS	Corning	20-030-CV	1x
40 μm 细胞筛	Corning	352340
A2B5 柱层析纯化
A2B5 抗体偶联磁珠	Miltenyi Biotec	130-097-864	磁珠结合的 A2B5 抗体
LS 层析柱	Miltenyi Biotec	130-042-401	磁性分离柱
EDTA	Corning	46-034-Cl	2 mM
含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 PBS	Corning	20-030-CV	1x
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A9647	0.50%
培养材料
PDGF-AA	PeproTech Inc	100-13A	20 ng/ml
二甲基亚砜	Sigma-Aldrich	D2650	Hybri-Max 100 ml
三碘甲腺原氨酸	Sigma-Aldrich	T6397	45 nM
富马酸氯马斯汀盐	Sigma-Aldrich	SML0445-100MG	1 μM
富马酸喹硫平半盐	Sigma-Aldrich	Q3638-10MG	1 μM
N-乙酰半胱氨酸	Sigma-Aldrich	A9165	5 μg/ml
孕酮	Sigma-Aldrich	P8783	60 ng/ml
多聚-L-赖氨酸	Sigma-Aldrich	P1524	10 μg/ml
腐胺	Sigma-Aldrich	P7505	16 μg/ml
亚硒酸钠	Sigma-Aldrich	S5261	40 ng/ml
氢化可的松	Sigma-Aldrich	H0135	50 ng/ml
d-生物素	Sigma-Aldrich	B4639	10 ng/ml
胰岛素	Sigma-Aldrich	I6634	5 μg/ml
脱辅基转铁蛋白	Sigma-Aldrich	T1147	100 μg/ml
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A4161	100 μg/ml
微量元素 B	Corning	25-022-Cl	1x
B-27 添加剂	Life Technologies	17504044	1x
青霉素/链霉素	Life Technologies	15140122	1x
DMEM	Life Technologies	11995-065	1x
带盖 24 孔黑色 Visiplate	Perkin Elmer	1450-605	组织培养级
免疫细胞化学与定量分析
多聚甲醛	Sigma-Aldrich	100-13A	4%
吐温 X-100	Sigma-Aldrich	78787	0.10%
正常山羊血清	Jackson Immuno Research	005-000-121	5%
小鼠单克隆抗 MBP 抗体	Biolegend	SMI-99P	1:1,000 稀释
兔多克隆抗肌动蛋白抗体	Santa Cruz Biotecnology	SC-7210	1:200 稀释
兔多克隆抗 Olig2 抗体	Millipore	AB9610	1:1,000 稀释
山羊抗小鼠 680RD 抗体	Licor	926-68070	1:500 稀释
山羊抗兔 800CW 抗体	Licor	926-32211	1:500 稀释
Alexa Fluor 594 标记山羊抗小鼠抗体	Life Technologies	A11032	1:1,000 稀释
Alexa Fluor 488 标记山羊抗兔抗体	Life Technologies	A11008	1:1,000 稀释
含 DAPI 的 Prolong Gold 抗荧光淬灭封片剂	Life Technologies	P36931
含 Ca2+ 和 Mg2+ 的 DPBS	Corning	21-030-CV
Licor Odyssey Clx 红外成像系统	Licor