猪的器官移植模型为研究器官保存机制提供了重要平台。本文描述了一种异位猪自体肾移植模型,可用于探索改善边缘性肾移植物移植效果的新方法。
猪的器官移植模型为研究器官保存机制提供了重要平台。本文描述了一种异位猪自体肾移植模型,可用于探索改善边缘性肾移植物移植效果的新方法。
对于终末期肾病患者而言,肾移植是首选治疗方法。与透析相比,肾移植可提供更长的预期寿命和更高的生活质量。尽管近几十年来肾移植受者的预后已取得显著改善,但可供移植器官的日益短缺已成为全球范围内的严重问题。为了扩大供体来源,目前临床已接受使用来自扩大标准供体(ECD)或循环死亡后捐献(DCD)的边缘性肾移植物进行移植。为进一步改善这些边缘性移植物的术后效果,研究应聚焦于新的治疗策略,如替代性器官保存技术、免疫调节、基因转导以及干细胞应用。
在动物模型中进行实验研究是新技术应用于临床实践前的最后一步。猪肾移植是研究人类移植的良好模型,可用于探索新的方法。猪模型的主要优势在于其解剖结构和生理特征与人体高度相似,有助于将新发现快速转化为临床试验。本文提供了一种自体移植模型的外科手术分步操作方案,并强调了确保实验成功的关键因素。充分的术前和术后饲养管理、细致的麻醉监护以及稳定的手术技术可带来良好的术后结果。切除对侧原生肾脏可为评估移植后移植物功能提供条件。通过放置静脉和尿路导管,结合代谢笼的使用,可进一步实现更详细的评估。对于需要长期随访或研究不同移植物保存技术的实验,自体移植模型优于同种异体移植模型,因其避免了排斥反应和免疫抑制药物带来的混杂偏倚。
对于终末期肾病患者而言,肾移植是首选治疗方法,因为与透析相比,肾移植具有更低的发病率和死亡率1-3。尽管肾移植后患者的预后已取得显著改善,但移植物短缺仍是全球面临的严峻挑战。等待肾移植的患者人数远远超过可供移植的器官数量4-6。为了增加可用于移植的肾脏数量并缩短患者的等待时间,需要拓展更多的肾脏移植物来源。
通常,临床使用脑死亡后捐献(DBD)的标准化标准供体(SCD)和扩展标准供体(ECD)肾脏移植物,以及来自活体捐献者的肾脏(LDKT)。自20世纪90年代以来,为扩大供体来源,越来越多的肾脏移植物来自心脏死亡后捐献(DCD)的情况7,8。然而,DCD和ECD肾脏移植物在移植后的效果尚可,但相对较低,其预后受多种因素影响,如供体年龄、热缺血和冷缺血时间以及所采用的保存技术9-11。因此,仍需进一步研究以改善接受边缘性肾脏移植物患者的预后,并进一步扩大供体池。
猪的肾移植模型已得到充分建立,为研究改善边缘性肾移植物预后的创新方法提供了一个具有重要临床意义的场景。与单叶结构的啮齿类和犬类肾脏不同,猪和人类的肾脏均为多叶结构,在解剖学上尤其在动脉、静脉以及尿液收集系统方面具有高度相似性12,13。此外,猪和人类肾脏在缺血再灌注损伤(IRI)的病理生理学、生物化学及免疫学参数方面也表现出相似性14。因此,猪肾移植模型非常适合用于研究边缘性肾移植物的新型器官保存方法15-17,模拟人类缺血再灌注损伤18,探索免疫通路与同种移植物耐受机制19,开展外科手术培训20-22,测试新的药理学治疗方案23,应用新型医疗器械,以及研究异种移植中的新免疫机制24-26。
猪和人类的肾脏移植环境并不完全类似。本文重点介绍有助于成功建立肾脏自体移植模型的重要技术细节。该方案及视频中描述并演示了针对物种特点优化的术前和术后饲养管理、麻醉给药及严密监测,以及相匹配的外科手术技术。切除对侧原生肾脏可为评估移植肾功能提供条件。静脉和尿路导管的置入,以及代谢笼的使用,有助于进行更深入的功能评估。对于旨在研究移植物替代保存方法及缺血-再灌注损伤(IRI)机制的研究而言,自体移植模型优于同种异体移植模型,因其避免了排斥反应及相关免疫抑制药物使用所带来的并发症和混杂偏倚。
所有动物均得到人道护理,所有研究均按照加拿大动物护理委员会的政策和指南进行。所有操作均在经大学健康网络机构动物护理委员会批准的动物使用方案下进行。
注意:研究方案的示意图见图1。

图1. 研究方案。 请点击此处查看此图的放大版本。
1. 动物
2. 肾脏移植物获取
3. 肾脏移植物移植
4. 术后随访
以下展示了肾自体移植实验的结果(n = 4)。在初次获取移植物后,猪只在饲养区域恢复。与此同时,肾脏移植物在冰上保存,平均时间为7小时35分钟(±18分钟)。在重新诱导麻醉并再次进行剖腹手术后,切除对侧肾脏,并按照所述方法将冷保存的移植物异位移植。脱离呼吸机后,猪只从手术中恢复,并随访10天(见图1)。术后第1至第4天每日采集血样,第6至第10天每两天采集一次,用于进行血气分析;为评估肾功能,检测血清肌酐和血液尿素氮(BUN)水平。作为对照,本文还展示了一例同种异体移植肾脏的结果。该猪只接受免疫抑制治疗,包括环孢素100 mg口服和皮质醇250 mg静脉注射,每日两次。手术技术与自体移植方案相同,未施加任何热缺血时间。
所有猪在随访期间均处于良好的临床状态。血清肌酐和尿素氮(BUN)水平在术后第1天达到最高值(肌酐 2.8 ± 0.7 mg/dl,BUN 25.3 ± 7 mg/dl),随后逐渐下降,至术后第10天接近初始基线水平(肌酐 1.7 ± 0.4 mg/dl,BUN 10.7 ± 4 mg/dl)。同种异体移植肾在经历初期良好的移植物功能后,其肌酐和BUN水平高于自体移植组,最可能的原因是发生了排斥反应(图2 和 图3)。酸碱平衡(图4)和电解质水平(图5)在未进行干预的情况下保持稳定。组织学检查显示,自体移植肾的肾小管间质结构得以保留(图6),而同种异体移植肾则出现弥漫性间质炎症、小管炎和肾小球炎(图7)。

图2. 血清肌酐值。 术前基线及术后10天的血清肌酐值(均值±标准差)。请点击此处查看该图的放大版本。

图3. 血清BUN值。手术前基线及术后10天的血清BUN值(均值±标准差)。请点击此处查看该图的放大版本。

图4. 酸碱稳态。 术前基线及术后10天的酸碱稳态(均值±标准差)。请点击此处查看该图的放大版本。

图5. 电解质水平。 术前基线及术后10天的电解质水平(均值±标准差)。请点击此处查看该图的放大版本。

图6. 组织学(H&E染色),100倍放大。 自体移植肾术后10天显示正常的肾小管间质结构。 请点击此处查看该图的放大版本。

图7. 组织学(H&E染色),100倍放大。 同种异体移植肾术后10天,可见广泛的间质性炎症、小管炎和肾小球炎,符合排斥反应的特征。请点击此处查看该图的放大版本。
由于在手术操作、生理学、生物化学和免疫学方面具有相似性,猪肾移植模型为推动人类器官移植领域的发展提供了独特的机会14。
根据实验研究目的的不同,肾自体移植模型相较于同种异体移植模型具有多项优势。尽管已有多个研究团队报道了同种异体移植后良好的肾移植物功能28,但在猪模型中实施免疫抑制治疗具有挑战性,尤其是在肾移植中。术前可通过血液样本分析以确保猪白细胞抗原(SLA)相容性,但该方法成本高昂且不具实用性14。术后通常建议口服或静脉给予他克莫司和环孢素等免疫抑制剂(钙调磷酸酶抑制剂,CNI)28。然而,口服给药并不现实,因为猪通常拒绝吞服药物。此外,肠道梗阻可能影响免疫抑制药物的充分吸收,从而难以维持治疗所需的血药浓度。在活动性动物中持续静脉输注CNI在技术上要求较高。静脉推注给药则会导致血药峰值过高,引发毒性反应。因此,在评估新型器官保存技术的研究中,肾自体移植模型具有明显优势。如上文展示的同种异体移植肾移植物代表性结果所示,肌酐和尿素氮(BUN)的峰值延迟且升高,提示发生排斥反应,这一结果经组织学评估得以证实。
猪自体移植模型此前已被用于研究新的器官保存技术14,18,29。然而,在心跳状态下,自体移植猪术后血清肌酐和尿素氮(BUN)的报道值因实验体系不同而存在显著差异22,30。本文所介绍的心跳供体方案导致术后血清肌酐峰值较低,为2.8 mg/dl(± 0.7),BUN峰值为25.3 mg/dl(± 7.4)。这些结果与Hanto等28和Snoeijs等31报道的低峰值水平相当。
为了确保猪自体移植模型中肾移植术后获得成功的结果,我们已确定若干关键的技术因素,可最大限度地降低特定并发症的发生率。使用组氨酸-色氨酸-酮戊二酸盐溶液(HTK)可降低血管痉挛的风险,因其钾含量较威斯康星大学溶液(UW)更低。为进一步降低再灌注时发生血管痉挛的风险,可在肾动脉内注射维拉帕米,并在器官获取期间及再灌注后局部应用罂粟碱。此外,持续输注去甲肾上腺素并滴定剂量以维持收缩压高于100 mmHg,有助于实现均匀的再灌注。建议至少在猪处于俯卧位之前维持该血压水平。此外,移植肾的放置位置至关重要,以防止新吻合的血管发生扭曲。因此,在缝合移植肾的吻合口之前,切除对侧左肾有助于避免过度的机械操作。完成输尿管吻合后,将小肠包裹于移植肾周围,可在关闭腹壁后固定其位置。尽管因肠道扭曲所致的肠梗阻等并发症较为罕见,但仍可能引发严重后果,包括麻痹性肠梗阻、肠穿孔甚至死亡。总体而言,精确的外科技术、细致的麻醉管理以及术后密切监测,是确保良好临床结果和移植肾功能的重要因素。
动脉和静脉吻合可采用不同的技术进行。移植物的原位放置允许肾动脉和肾静脉进行端对端吻合。在异位移植的情况下,移植物可置于对侧肾窝以进行端对端吻合,或直接吻合至髂血管或远端主动脉。在此模型中,优先选择将移植物以端侧方式直接吻合至主动脉和下腔静脉的异位移植方式,因其可降低血栓形成和血管痉挛的风险32。当存在静脉早期分叉等解剖变异时,可能需要分别缝合两条独立的静脉吻合口。如果动脉或静脉相对较短,可将移植物旋转180°以延长血管长度。输尿管侧对侧吻合可在不引起狭窄或尿漏等并发症的情况下获得良好的实验效果。
总体而言,与其他动物模型相比,猪的肾移植模型具有多种优势。如上所述,猪与人类在某些方面存在相似性,这使得新技术能够相对较快地转化为临床应用。该移植技术在操作上比啮齿类动物模型更为简便。此外,通过放置静脉导管,可方便地采集外周血样并进行后续分析。尿液的收集有助于进一步评估肾脏损伤及功能状态。为采集尿液样本,可将经皮导管插入膀胱。为避免猪自行干扰导管,导管远端应经皮下隧道引至动物背部。另一种尿液采集方法是使用代谢笼,可实现长时间尿液收集,用于估算肌酐清除率及尿液中其他生物标志物的浓度。可进行超声检查、CT扫描和MRI成像。通过在器官获取前施加热缺血处理,可模拟循环死亡后捐献(donation after circulatory death)的实验方案。此外,若对猪进行去势以限制其攻击性行为,则相对更容易操作和管理。
缺点包括动物购买、饲养、手术及其他医疗设备和人力的高成本。这些因素导致在每个研究组中纳入大量动物不可行。此外,与啮齿类动物模型相比,文献中可供参考的猪的正常生物学数据较为有限。作为评估新开发技术(如新型保存方法)的替代方案,其他研究团队已描述了常温灌注 离体 将再灌注作为肾移植的替代方案 33,34该技术操作更简便且成本较低。然而,标准化的肾脏移植模型更接近临床实践,可实现更长的随访时间,因此能够对移植物进行更为真实的评估。
总之,异位肾自体移植的猪模型为研究改善肾移植效果的创新方法提供了一个具有重要临床意义的实验场景。特别是,本方案包含若干关键技术细节,有助于成功建立肾自体移植模型,并促进新发现快速转化为临床试验。
作者无任何利益冲突需要披露。
我们感谢意大利米兰的索林集团(Sorin Group)、瑞典哥德堡的XVIVO Perfusion公司(XVIVO Perfusion Inc.)以及德国美尔松根的贝朗公司(Braun AG)提供的支持。我们非常感谢约翰·戴维与辛妮·伊顿基金会(John David and Signy Eaton Foundation)的支持。
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