利用口服溶解膜进行药理学与毒理学研究：一种简单且更人道的动物经口灌胃替代方法

摘要

以下方案描述了一种使用口服溶解膜（ODS）进行慢性口服给药的新方法，以替代常用的口服灌胃法。我们证明，在临床前研究中，采用ODS方法进行口服给药是一种安全、便捷且更符合动物福利的口服灌胃替代方案。

摘要

在将新型治疗药物用于人体试验之前，必须进行短期和长期的临床前（即动物）重复药理学和毒理学测试。在大多数情况下，首选给药途径为口服给药。目前，口服给药主要通过口服灌胃法实现，部分原因是该方法可在动物模型中实现稳定且精确的剂量控制。尽管该方法已较为成熟，但仍存在一些并发症，可能导致动物损耗率较高。为此，本文介绍了一种替代口服灌胃法的新方法，即将目标药物掺入一种具有味道、可口服溶解的薄膜（ODS）中，直接提供给实验动物，药物可迅速被摄取，且对实验对象的干预操作极少。本文证明，采用ODS方法进行临床前口服给药是一种安全、便捷且更符合动物福利的口服灌胃替代方案。

引言

为了成功地将药物从临床前（动物试验）阶段推进到临床开发阶段，需要在动物模型中采用预期的临床给药途径（通常为口服途径）进行一系列明确定义的急性和慢性药理学及毒理学研究。为实现这一目标，目前大多数临床前研究采用经口灌胃法，因为该方法能够向动物稳定且精确地递送测试化合物。然而，在许多情况下，动物对经口灌胃耐受性较差，且越来越多的证据表明该方法会引发显著的应激反应¹。

对于需要长期临床前研究的慢性终身性疾病（例如几乎所有的神经精神障碍，但不限于此类疾病）的治疗开发而言，这一点尤为突出。例如，在阿尔茨海默病的转基因小鼠模型中，最近有研究提出，灌胃操作本身可能因给药引起的应激而干扰实验结果²。类似地，在酒精摄入的小鼠模型中，我们实验室的未发表研究发现，反复插入灌胃管这一操作本身即可显著降低酒精摄入水平，严重时甚至危及实验范式的完整性（见图1）。

鉴于上述与口服灌胃操作相关的局限性，研究人员已投入大量努力，致力于开发新型的临床前口服给药方法。目前的替代方案包括将待测化合物掺入花生酱混合物³、凝胶模具^4-5、巧克力颗粒⁶、饮用水⁷以及薄脆饼干⁸中。然而，这些方法均存在不同程度的问题，包括在动物模型中无法可靠使用、受试对象对化合物摄取缺乏接受性，或因个体对口味的偏好导致药物难以被充分摄入⁹。

本文介绍了一种将目标药物掺入带有风味的口服速溶条（ODS）中的方法，该速溶条可方便、快速地用于向实验动物经口给予待测化合物。本研究重点是通过小鼠实验展示ODS方法的有效性。然而，没有理由认为该方法不适用于其他啮齿类动物以及更大的哺乳动物。在临床应用中，ODS已开始被用于儿科和老年患者，以克服吞咽困难¹⁰。我们提出，ODS也可在临床前药物发现项目中成功应用，作为一种安全、便捷且更符合动物福利的口服灌胃替代方案。

方案

所有所述操作步骤均已获得南加州大学机构动物护理和使用委员会（IACUC）的批准。

1. 动物操作与适应

1. 引言
   1. 让小鼠适应实验的饲养条件和操作技术，以减少后续给药过程中的应激反应。在此期间，记录每只小鼠的体重和食物摄入量；如有需要，这些数据之后可作为非侵入性指标用于评估药物毒性（可选）。前者还可用于确定基于体重的药物剂量。
      注意：根据经验，适应期的长短应根据与动物接触的实验人员数量来决定。据我们观察，在通常为期一周的适应期内，C57BL/6J品系的小鼠在被超过约5名人员操作时，往往难以完成适应。如条件允许，建议实验人员在接触动物前避免使用有香味的乳液、肥皂和香水，因为已有文献报道，新的刺激物（例如气味）可能会干扰适应过程¹¹。
2. 步骤
   1. 在研究开始前至少5天，将动物转移至后续实验将要进行的房间。
   2. 牢固抓住小鼠尾部中段，轻轻将其从笼中提起并放入称重舟中，记录小鼠体重。
      1. 将小鼠从笼中提起后应尽快放置到天平上，注意正确抓握尾部中段/近端部位，避免抓握尾部远端，以防发生脱套伤（degloving injuries）¹²。
      2. 待小鼠安全放入称重舟后，记录体重数值。
   3. 建议连续2天记录食物重量，以建立基础摄食水平，有助于在实验过程中捕捉潜在的毒性反应¹³。

2. 进食针头、蔗糖溶液和单个ODS的制备

1. 使用高压灭菌器对不锈钢灌胃针进行灭菌，以备实验使用。每组准备2根针，另加1根作为备用针（如有需要）。
   注意：本研究使用的是1.5英寸长、弯曲、18 G的不锈钢喂养针，针尖端带有直径为2.25 mm的球状结构。
2. 将0.85 g蔗糖加入20 ml水中，配制4.25%（w/v）的蔗糖溶液。
   注意：根据所评估的参数不同，也可使用其他低剂量蔗糖溶液¹⁴。
3. 通过市售的¼英寸单孔打孔器，将标准矩形口服溶解条（ODS）裁剪成直径为0.5 cm的圆形片剂，为每只动物准备一片。本演示中使用的矩形测试条每片含有6 mg伊维菌素（IVM），裁剪成该尺寸后，每个圆形片剂约含0.21 mg剂量，相当于每只动物10 mg/kg（我们期望的给药剂量）。可通过调整矩形条上制剂的浓度或稀释度，和/或裁剪成不同尺寸来调节每片的剂量。

3. 药物递送

1. 按照步骤1.1–1.2中所述记录重量值。
2. 记录体重后，将小鼠移至金属网格笼盖上。到达位置后，用惯用手的拇指、食指和第三指^rd 用手指轻轻向后拉尾巴，这会使小鼠不自觉地抓住金属笼顶并伸展背部，使身体远离实验操作者。
3. 用非惯用手的拇指、食指和中指抓住颈部后方的皮肤^rd 用手指舒适地固定动物，确保抓握稳固。
   注意：手较小的实验人员也可以使用 4^th 同一只手的中指可用于向后拉住小鼠背部的颈背部皮肤，以更牢固地固定小鼠。此外，根据个人习惯，无名指和/或小指也可用于固定尾巴，但此操作并非必需。¹².
4. 将小鼠保持直立姿势。
5. 注意：观察小鼠黏膜的颜色。若呈现紫色或蓝色，表明操作者抓握颈背部皮肤过紧，导致小鼠呼吸困难。
   1. 若发生此情况，立即将小鼠放回金属笼盖上，使其休息约2-3分钟，然后再尝试固定动物。
6. 将灌胃针的球形针头浸入4.25%蔗糖溶液中，以作为ODS的味觉粘附剂。
7. 用灌胃针的球形针头按压预先切好的口腔溶解膜，以将其固定。
8. 将口服递送系统（ODS）置于小鼠鼻孔和/或口腔附近，使其摄入薄膜。或者，可将薄条直接贴于小鼠舌头上，通过局部给药方式使其吞咽。
9. 在给药过程中，中途更换针头以防止感染传播。

结果

在以下代表性研究中，采用24小时双瓶选择（TBC）范式模拟社交饮酒行为，方法如前所述¹⁵。简言之，小鼠可自由选择饮用两瓶溶液中的一瓶，其中一瓶为水，另一瓶为10%（v/v）乙醇溶液。随后根据各组间10E（10%乙醇/90%水，v/v）摄入量相近的原则，将实验对象分配至不同的药物处理组。

图1展示了伊维菌素（IVM）通过灌胃载体口服给药后对偏好性饮酒行为的影响。本项初步研究共分为3组：N/A组、安慰剂组和IVM组，分别代表无灌胃、玉米油（载体）灌胃以及伊维菌素（10 mg/kg，溶于玉米油中）灌胃。小鼠接受为期两周、每周连续5天、共10天的处理。如下图所示，与安慰剂组相比，IVM在整个实验过程中显著降低了10E的摄入量。与N/A组相比，安慰剂组的乙醇摄入量（约5 g/kg）过低（比未进行灌胃的N/A组低48%），因此可能无法准确反映或模拟社交饮酒行为（约为10–15 g/kg）。这表明，与灌胃操作相...

讨论

口服灌胃与多种并发症相关，可能导致数据收集受到潜在影响以及动物损耗率升高¹。本文介绍一种简单的口服给药方法，使小鼠（以及其他潜在动物）能够通过口服溶解膜（ODS）轻松且可靠地摄入目标药物。值得注意的是，该方法是口服灌胃的一种安全、便捷且更符合动物福利的替代方案。

尽管目前其他替代口服灌胃的方法在一定程度上具有前景，但它们均存在各种局限性，无法满足药物给药研究的全部需求，例如无法用于小鼠，或因个体对味道的偏好导致药物摄入不充分⁹。相比之下，口服给药软食（ODS）可配制成多种不同口味，这一点尤为重要，因为个体对口味的偏好会随时间变化，且不同品系和物种之间的口味偏好可能存在差异。

正确的动物操作是本技术的重要组成部分。需要强调适应期的重要性：如果小鼠年龄较小或不习惯被操作，可能更难对其进行固定。随着动物逐渐适应操作，对实验人员的恐惧感会降低，抓握小鼠时遇到的困难也应随时间逐渐减少。在代表性结果中所展示的C57小鼠品系被观察到能相对较快地适应操作程序（通常在大约1至3次操作后）。尽管不同物种...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
口服溶解膜	Cure Pharmaceutical		可根据特殊要求提供。或者，也可在实验室内自行制备口服溶解膜（ODS）。
灌胃喂养针头	VWR	7912	本研究中的啮齿类动物实验采用18号规格的喂养针头。在其他哺乳动物物种中使用时，可能需要调整针头尺寸。
蔗糖	Sigma Aldrich	S0389-500G