本文介绍了一种通过插管将博来霉素直接注入小鼠气管的快速简便方法。该方法的主要优点在于具有高度可重复性、易于掌握，且无需特殊设备或漫长的恢复时间。
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本文内容
摘要
摘要
尽管存在一些解剖学和生理学上的差异，小鼠模型仍然是研究人类肺部疾病的重要工具。博来霉素毒性是一种常用于研究急性肺损伤和肺纤维化的模型，目前已开发出多种将博来霉素（及其他毒性物质）递送至肺部的方法。然而，这些方法中的许多（例如经气管灌注）存在固有缺陷，包括需要使用强效麻醉剂以及进行可存活的外科手术。本文报道了一种快速、可重复的经气管插管方法，该方法采用轻度吸入麻醉，直接观察气管，并利用替代式呼吸计量装置确认给药暴露。作为概念验证，对8至12周龄的C57BL/6小鼠给予2.0 U/kg的博来霉素或等体积的PBS，并在暴露后检测了肺组织损伤和纤维化相关指标。该操作方法使研究人员能够在相对较短的时间内以较低成本处理大量小鼠，且术后护理需求极少。
引言
尽管存在一些解剖学和生理学上的差异1，小鼠模型在模拟人类生物学和疾病发生机制方面仍然具有不可估量的价值2。从饲养角度来看，小鼠易于操作，繁殖周期短，寿命较短，且饲养成本相对较低。随着多种遗传品系和策略（例如，条件性基因敲除、报告基因小鼠、谱系示踪方法等）的发展，以及大量可用试剂（例如，抗体、重组蛋白、抑制剂等）的出现，小鼠已成为揭示人类稳态及疾病过程不可或缺的模式脊椎动物3。
小鼠在研究肺部疾病（包括急性肺损伤（ALI）和肺纤维化）方面具有特别重要的价值。4 人类的ALI可由创伤、损伤或败血症引起，其特征是上皮和内皮渗漏（即水肿）、炎症以及早期纤维化。在许多患者中，ALI会发展为其严重形式——急性呼吸窘迫综合征（ARDS），常因呼吸衰竭导致纤维化和死亡。5,6 肺纤维化是一种进行性致死性疾病，其特征是细胞外基质过度沉积，尤其是I型胶原，从而导致肺功能受损。7,8 博来霉素（BLM）给药是目前在实验动物中诱导ALI和纤维化应用最广泛且研究最充分的模型。9 尽管啮齿类动物中BLM诱导的肺纤维化并不能完全模拟人类纤维化表型，10 但利用该模型开展的小鼠研究已帮助发现了许多影响疾病发生与进展的重要因素。11
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方案
华盛顿大学和西达斯-西奈医学中心的机构动物护理和使用委员会（IACUC）已批准开展这些研究所需的动物实验工作。
1. 准备
- 使用高压灭菌器对钝头镊子和压舌板进行灭菌。
- 在生物安全柜中，将博来霉素（BLM）冻干粉用磷酸盐缓冲液（PBS）配制成工作浓度溶液。 将溶液在35 kHz条件下超声处理10分钟，以确保充分混匀。
注意：建议总体积控制在30至45 µl之间，以避免低体积移液误差，同时防止体积过大导致窒息。 - 准备一个清洁的工作区域，其中操作区域面积约为1 m2，并设置术前和术后动物笼具的指定放置位置。
- 将操作板底座固定在研究人员正前方的实验台上，方法是用2至3条实验室胶带横跨板底和台面进行固定。有关制作操作板的详细规格，请参见图1。
- 在操作板的两个定位螺钉之间系上一段4.0号缝合线。
- 通过移除并丢弃三个1 ml注射器的活塞，并在每个注射器筒顶部加入60 µl PBS以形成气密密封，从而制作一个临时的呼吸测量装置。将导管接头松松地固定在一个注射器上，并将其放置在操作板的一侧。
- 用一个1 ml注射器吸取300 µl空气，并将其放置在操作板的一侧。
- 另剪一段长约6英寸的胶带，放置在操作板一侧备用，将在步骤2.4中用于固定动物。
- 设置异氟烷麻醉舱。将氧气（O
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结果
经插管的小鼠每日监测体重减轻和痛苦情况，并于4天、10天或17天后通过腹腔注射2.5% 2,2,2-三溴乙醇. 支气管肺泡 支气管肺泡灌洗液（BAL）按先前所述方法，用三份PBS洗涤收集 21，右肺由华盛顿大学组织学与影像学核心实验室用10%甲醛固定，石蜡包埋，并采用Masson三色染色法染色 22.
与已有数据一致，博来霉素（BLM）处理的小鼠在暴露后第7至10天出现体重下降的峰值23 （图2A）。此外，处死的BLM处理小鼠支气管肺泡灌洗液（BAL）中IgM水平升高，表明肺部通透性显著增加，且呈时间依赖性，提示存在上皮和/或内皮屏障功能障碍（图2B）。
采用马松三.......
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讨论
当由于试剂供应有限、安全性或成本原因导致气溶胶化给药不切实际时，直接气管给药是将外源性物质递送至肺部的更优方法。16 经气管灌注已被广泛用于实现这一目的；然而，与所有外科干预操作一样，该方法本身也可能引发并发症，而这些并发症并非一定由所灌注的物质引起。13 正因如此，通过插管将物质直接注入气管的方法近年来日益普遍。16,17,18,19,20 然而，这些方法同样存在局限性，包括因使用氯胺酮/赛拉嗪等强效镇静剂而导致的恢复时间延长、导管位置不确定（即，可能误入食管而非气管）、对口腔内组织造成不必要的操作，以及需要购置耳镜/喉镜等专用器械所带来的成本问题。
一旦建立，本文所述方法相较于其他插管方案具有多项显著优势。首先，使用异氟烷可减少每只小鼠操作所需的总时间。这主要归因于异氟烷麻醉后动物恢复意识所需时间明显缩短，相较于氯胺酮等管制药物（约5分钟，而后者有时超过3小时）具有显著优势14。此外，自制的呼吸测量装置可通过观察PBS液滴的振荡情况，使研究.......
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
作者感谢华盛顿大学组织学与影像核心实验室的 Brian Johnson 在三色染色及分析方面提供的帮助。本研究由美国国立卫生研究院（NIH）基金 HL098067 和 HL089455 资助。
....访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 注射用博来霉素，每瓶30单位 | APP Pharmaceuticals, LLC | 103720 | 为获得最佳效果，应将BLM悬浮于PBS中，分装后以单次使用量的冻干粉形式保存 |
| 钝头镊子 | |||
| 压舌板（例如弯曲的Valleylab刀片电极，2.4"） | Covidien | E1551G | 使用前，应在刀片尖端1.5 cm 处弯成45度角。也可使用任何尺寸相似的金属工具制作合适的压舌板。 |
| Exel Safelet导管 22G × 1" | Exel International | 26746 | |
| 1 ml滑动式针头一次性结核菌素注射器（每包200支，每箱1600支） | BD | 309659 | |
| 0.2 ml移液器及滤芯吸头 | |||
| Fiber-Lite照明系统。型号181-1：型号180主机配标准双蛇形管照明器 | Dolan Jenner Industries, Inc. | 181-1 | 不推荐使用输出较低的LED照明器，因其无法充分照亮气管。 |
| 插管板 | 参见图1。 | ||
| 彩色标签胶带：0.5 英寸宽 | Fisherbrand | 15-901-15A | |
| 氧气 | |||
| 磷酸盐缓冲液，1× | Corning | 21-040-CV | 产品应为无菌 |
| 非无菌黑色编织丝线缝合线卷，91.4 m，4-0规格 | Harvard Apparatus | 517698 | |
| 台式异氟烷麻醉机 | Highland Medical Equipment | http://www.highlandmedical.net/ | |
| 滑盖式小鼠异氟烷诱导麻醉舱 | MIP / Anesthesia Technologies | AS-01-0530-SM | |
| FORANE（异氟烷，USP）吸入用液体 100 mL | Baxter | 1001936040 | |
| Nanozoomer数字病理系统 | Hamamatsu | ||
| IgM ELISA定量检测试剂盒 | Bethyl Laboratories | E90-101 |
参考文献
- Hyde, D. M., Hamid, Q., Irvin, C. G. Anatomy, pathology, and physiology of the tracheobronchial tree: emphasis on the distal airways. J Allergy Clin Immunol. 124, S72-S77 (2009).
- Rosenthal, N., Brown, S. The mouse ascending: perspectives for hum....
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