下颌下腺逆行灌注与局部分次照射在唾液功能低下大鼠模型中的应用

摘要

唾液腺功能低下是头颈部放疗的主要不良反应，会降低患者的生活质量。在临床转化之前，必须先在动物模型中验证新疗法的有效性。本方案描述了大鼠下颌下腺的逆行导管给药和局部照射方法。

摘要

位于放射治疗照射范围内的正常组织会受到意外损伤。唾液腺在头颈部放射治疗过程中常常受损。细胞损伤不可修复，导致唾液分泌功能慢性丧失，影响基本的口腔功能，并增加口腔感染和龋齿的风险。唾液分泌功能低下及其并发症严重影响患者的舒适度。目前对该病症的对症治疗效果有限，亟需开发新的治疗方法以缓解这一状况。

唾液腺是外分泌腺，通过排泄管将分泌物排入口腔。插管这些导管可直接进入腺体。将造影剂逆行注入主要唾液腺是门诊诊断成像的常规操作。采用类似的方法，可实现对腺体的局部治疗。然而，在小动物的临床前研究中实施该技术面临独特的挑战。本研究描述了大鼠下颌下腺逆行给药的技术，该技术已在美国国立卫生研究院（NIH）布鲁斯·鲍姆（Bruce Baum）博士的实验室中得到优化¹，并详细阐述了局部腺体照射的操作步骤。

引言

健康组织的连带损伤导致了癌症治疗中多种有害副作用。位于放射治疗区域内的主要唾液腺部分或全部不可避免地遭到破坏。因此，大多数接受头颈部癌症、宫颈淋巴瘤或骨髓移植前全身放疗的患者都会出现放射治疗最常见且最持久的不良反应之一——唾液腺功能低下^2-6。

唾液腺中产生液体的腺泡细胞对辐射极为敏感。唾液腺受损会导致唾液分泌显著减少，这种情况被称为唾液腺功能低下。唾液分泌的长期减少会影响咀嚼、吞咽、言语和味觉等重要的口腔功能，而严重的并发症如剧烈疼痛、黏膜撕裂、吞咽困难、机会性感染以及龋齿，会进一步损害患者的健康状况和生理功能^2,3。

由于放射治疗相关的唾液腺细胞丢失是不可逆的，目前尚无针对口干症的根本治疗方法。当前以人工唾液替代物和促分泌药物缓解症状为主的治疗手段，无法实现长期缓解⁶。尽管改进后的放射治疗递送技术已有助于减轻病情严重程度，但正常组织的毒性反应及其并发症仍是癌症治疗中的限制因素^6,7。因此，预防放射治疗相关并发症的前瞻性措施正逐渐成为常规。研究人员正在探索能够清除自由基氧物种、促进细胞再增殖或增强DNA修复的放射防护剂，以预防唾液腺功能低下^8-11。

外分泌唾液腺的分泌物通过主要排泄管排入口腔。作为门诊常规操作，可通过口腔内插管进入排泄管以注射造影剂。采用类似方法，可直接靶向唾液腺进行局部治疗¹²。逆行导管腺体内灌注除可降低全身性副作用风险外，还具有其他优势。唾液腺细胞以单层形式排列于导管树周围，使得所有唾液腺上皮细胞均可被靶向；同时，腺体的纤维包膜可作为屏障，减少治疗物质的非预期扩散。因此，唾液腺非常适合作为靶向治疗腺体疾病（如放射治疗引起的唾液腺功能低下）的理想靶器官。

癌症治疗中的常规放疗以小剂量（1.8 - 2.5 Gy/次/天，每周五天）进行，持续数周。因此，在实验模型中对长期分次放疗方案具有保护效果的放射防护治疗更具临床意义。已有研究记录显示，分次放疗后小型动物的唾液腺功能会受到损害，但所使用的辐射源、剂量分割方式及实验方案各不相同^9,10,13。

本报告建立了使用与患者相关的辐射源和剂量分割方案对大鼠下颌下腺进行逆行导管递送和局部照射的方法。

方案

所有操作均经路易斯安那州立大学健康科学中心沙弗波特动物护理与使用委员会批准，并符合美国国立卫生研究院关于实验动物护理和使用的指南。

1. 大鼠下颌下唾液腺插管术

1. 注射器-管路组件的制备
   1. 用手术刀截取一段10 cm长的PE10聚乙烯导管。用拇指和食指捏住导管两端，将导管中段置于温和火焰上方加热，待其软化后，向两侧轻轻拉伸至原长度的两倍。
   2. 用手术刀以45度角在管路中间切断^o 获取两根套管，每根均具有一端为锥形。通过将套管的非锥形端套在0.5 cc胰岛素注射器的29 G针头上，以扩大其末端。
   3. 移除套管针，用注射器吸取220 μl生理盐水。轻弹注射器以排除气泡。将套管针套在针头上，推动注射器活塞，排出空气并确保液体能顺畅通过套管针。调整液体体积至200 μl。
2. 颌下腺导管口腔内插管
   注意：操作前需对器械进行高压灭菌，并在每次操作间隔使用高温玻璃珠灭菌器进行消毒。
   1. 称重Sprague Dawley大鼠，并在皮下注射器中加入按体重计算的氯胺酮（42 mg/kg）、赛拉嗪（8 mg/kg）和乙酰丙嗪（1.4 mg/kg）混合溶液。
   2. 用一只手的食指和拇指夹住动物尾部基部以固定，另一只手从动物体表滑过并抓握其身体。将食指和中指沿头部两侧放置，同时用拇指和其他手指握住躯干。
   3. 在后肢肌肉组织内注射麻醉剂。通过脚趾夹捏和眼睑反射确认麻醉深度。动物处于麻醉状态时，涂抹眼用润滑剂以防止角膜干燥。
   4. 将动物放置在特制的平台上（图1），并将上切牙咬合在横向杆上。用橡皮筋套住下切牙并固定在平台上，向下牵拉下颌。
   5. 用无菌缝线穿过舌头并向上提起，以抬高口腔底部。用止血钳夹住缝线，并将其绕过横向杆。
   6. 使用定制的拉钩扩张脸颊（图1），并在解剖显微镜下定位口腔底部的舌下乳头。
   7. 用精细镊子夹住预成型PE10导管的锥形末端。轻柔地将套管尖端插入舌下乳头上的导管开口。将套管插入导管内3–5 mm以确认其位置；确保插入过程中无任何阻力。
3. 下颌下腺灌注
   1. 在颈部背侧皮下注射阿托品（0.5 mg/kg），等待10分钟以减少唾液分泌。
   2. 用一滴氰基丙烯酸酯（胶水）将套管固定在导管开口处，并使其干燥。以约 50 μl/min 的速度缓慢推动注射器活塞，将溶液注入腺体（每腺体 200 μl）。
   3. 用止血钳夹闭导管，小心移除注射器。将导管保留在导管内 30 - 60 分钟，直至动物恢复意识。拆除固定舌头的缝线。
   4. 将动物转移至单独的笼子中，并使用加热灯在恢复期间保持其体温。在动物恢复意识并能够维持胸卧位之前，不得无人看管。
   5. 动物完全恢复行走能力后，将其饲养在动物房中，自由摄食和饮水。

2. 下颌下腺的局部分次照射

1. 按前述方法固定动物，并在后肢肌肉注射氯胺酮（33 mg/kg）、赛拉嗪（6 mg/kg）和乙酰丙嗪（1 mg/kg）混合液进行麻醉。确认麻醉深度后，向眼睛涂抹润滑剂。
2. 将动物仰卧位放置于直线加速器治疗床上，通过倾斜头部使其颈部伸展。准直辐射野（3 cm狭缝宽度），使其覆盖从下颌下缘至胸骨顶端的区域。
3. 在该区域上方放置1 cm组织等效模体，并调整辐射源与模体表面之间的距离至100 cm。
4. 使用直线加速器的6 MV光子束对动物进行照射（2.5 Gy）。照射时间由剂量率、照射野大小以及辐射源到模体表面的距离决定。在当前实验设置中，照射剂量率约为1 Gy/min。
5. 重复照射，每日2.5 Gy，连续8天，每周4天，中间间隔2天。在恢复期间保持动物体温。待动物完全恢复自主活动后，转移至动物饲养室。
6. 照射后8周采集刺激下的下颌下腺唾液，以评估腺体功能¹⁴。在麻醉状态下通过心脏灌注冰冷的4%多聚甲醛/磷酸盐缓冲液（pH 7.2）处死动物。摘取下颌下腺组织，用于组织学和免疫组织化学分析¹⁴。

结果

通过改进微创唾液腺造影技术，可实现对大唾液腺的局部治疗。在大鼠下颌下唾液腺中尝试经口内插管 Wharton 管进行逆行导管给药（图 2）。Wharton 管的唾液导管开口于口腔底部的舌下乳头，但其开口并不明显可见。因此，导管插入需通过轻柔探查完成。为避免不必要的出血或导管穿孔，在放置导管时不得施加任何力量。通过轻柔地前后移动导管，确认其在导管内顺畅无阻地通过。

在初始实验中，通过向腺体灌注苏木精或台盼蓝溶液，并在处死动物后评估腺体染色情况来确认插管是否成功（图3）。腺体填充体积通过观察离体腺体中导管树的染色情况来确定。对于体重为150–250 g的动物，使用200–250 μl溶液即可实现腺体完全填充。快速灌注会增加腺体压力，提高损伤和生物扩散的风险。为避免组织破坏，溶液以约50 μl/min的速度缓慢注入

讨论

唾液腺在头颈部癌症、颈部淋巴结的预防性消融或区域性血液系统恶性肿瘤的放射治疗过程中，常常受到超过组织修复阈值的辐射剂量。尽管腺体中负责分泌液体的腺泡细胞属于终末分化细胞，但它们对辐射却异常敏感。在放疗开始后的数周内，唾液分泌功能即显著下降，不可逆的腺体损伤将导致长期唾液分泌减少。为应对由此引发的腺体功能低下和口腔干燥，保护或恢复唾液分泌功能至关重要。目前，针对防护或修复辐射损伤的新型疗法正在被研究^{1, 8-11, 16-20}。

全身给药治疗存在对非靶向组织产生不良反应的固有风险。靶向递送至唾液腺可降低此类风险。逆行导管基因治疗在预防或改善辐射相关唾液腺损伤方面具有显著效果^{1, 9–11, 16,17,20}。然而，利用相同技术，唾液腺也可被重新改造以异位表达并分泌蛋白质。通过利用唾液腺细胞的基底外侧内分泌分泌途径，可实现外源基因的表达及其编码激素向血液中的分泌²¹。因此，唾液腺基因转移可有效拓展用于某些内分泌系统疾病的矫正治疗。

尽管在小型动物中进行唾液腺导管插管...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Intramedic 聚乙烯导管（PE10）	Becton Dickinson	427401
1/2 cc 胰岛素注射器 U-100	Becton Dickinson	309306
人工泪液	Miller Vet Supply	5098-9840-64
热珠灭菌器	Fine Science Tools	18000-45
Perma-Hand 蚕丝缝合线	Ethicon	K833H
格拉夫镊	Fine Science Tools	11051-10
奥林巴斯 SZX16 体视显微镜	亨特光学与成像
6 MV 直线加速器	Elekta
团注 - 去皮	Civco	MTCB410
加热灯	Braintree Scientific	HL-1 110V