利用烟草瞬时表达系统成像MAPK信号通路的空间重排

摘要

在亚细胞水平上，信号事件受到发育和环境线索的动态调控。本文介绍了一种利用烟草瞬时表达系统监测蛋白质-蛋白质动态相互作用，并揭示植物细胞中信号转导空间组织的实验方案。

摘要

活细胞中动态信号事件的可视化一直是一项挑战。我们将已建立的瞬时表达系统——生物分子荧光互补（BiFC）检测法，在烟草表皮细胞中从检测蛋白质-蛋白质相互作用扩展至监测植物细胞中信号转导的空间分布。在本实验方案中，我们利用BiFC检测法展示了以下蛋白之间的相互作用及信号传导过程： 拟南芥 MAPKKK YODA 和 MAPK6 定位于细胞膜。当共表达支架蛋白 BASL 时，YODA 与 MAPK 的相互作用发生重分布，并在空间上与 CFP-BASL 共极性定位。该改良的烟草表达系统可快速检测信号分子的定位及动态变化（少于 4 天），并可兼容多种荧光蛋白颜色（至少三种）。我们还提供了详细的蛋白质分布定量方法（不对称空间定位，或 "极化"在烟草细胞中。这种先进的烟草表达系统有望被广泛用于活体植物细胞中动态信号事件的快速检测。

引言

蛋白质在复杂的层级网络中相互作用，形成复合物，在不可预测的细胞环境中几乎参与了所有重要的生物学过程。然而，从植物发育到生长响应，目前仍缺乏便捷的工具，能够快速且高效地在亚细胞水平上识别并监测这些动态的信号事件。

在烟草叶片表皮中进行瞬时蛋白表达的系统在活细胞中可视化荧光蛋白方面具有显著优势。该系统提供了一种半体内 允许翻译后蛋白质修饰并快速检测蛋白质定位的条件。通过检测互补的YFP信号，双分子荧光互补（BiFC）实验可揭示植物细胞中蛋白质相互作用的可能性。与其他方法相比， 例如， 酵母双杂交（Y2H）和免疫共沉淀（Co-IP）以及双分子荧光互补（BiFC）均为在亚细胞水平上可视化蛋白质-蛋白质相互作用发生区域的有力手段。

由于不对称细胞分裂（ACD）在产生新细胞类型以形成组织/器官的同时能够维持干细胞群体，因此它是促进真核生物多细胞化不可或缺的机制。拟南芥气孔发育被用作研究植物中ACD的模式系统。前体细胞——分生组织母细胞——进行不对称分裂，产生两个不同的子细胞：一个是分生组织细胞（在最终形成一对保卫细胞之前经历类似干细胞的分裂），另一个是气孔谱系基底细胞（SLGC）（可进一步分裂并分化为铺板细胞）（图1）。在气孔的ACD过程中，一种新蛋白——气孔谱系中不对称性破坏蛋白（Breaking of Asymmetry in the Sto....

方案

1. 质粒构建

1. 使用克隆技术按先前所述方法构建载体^1,6.
   1. 首先使用高保真DNA聚合酶和适当的引物扩增BASL、YDA和MPK6的编码序列，并将其亚克隆至入门载体中。详细实验步骤见 ⁷.
   2. 为了获得MPK6和YDA的显性负性版本（DNmpk6⁸ 和 DNyda⁴分别以MPK6和YDA的进入载体为模板，采用定点突变方法引入点突变⁹.
2. 为了构建用于烟草瞬时表达实验的载体，需进行标准的LR（attL × attR 重组）反应（详细步骤见 ⁷将BASL整合到pH35CG中¹⁰，将DNyda和DNmpk6插入pXNGW和pXCGW载体中¹¹分别。
   1. 通过酶切和测序验证所得质粒。确认无误后，将双元载体转化至 根癌农杆菌 GV3101菌株¹² 并在28 °C下于选择性平板上培养2至3天。

2. 准备 农杆菌 渗透溶液

1. 接种少量新近转化的 农杆菌 将菌落接种至10 ml含适当抗生素的Luria-Bertani（LB）培养基中（庆大霉素25 μg....

结果

为了防止由过度活跃的MAPK信号通路诱导的细胞死亡，在烟草细胞中共表达实验中使用了激酶失活形式的YDA（DNyda）和MPK6（DNmpk6）。BiFC检测显示DNyda与DNmpk6之间的相互作用，或CFP-BASL本身均未产生不均匀的分布模式（图3A-B）。然而，当将CFP-BASL引入DNyda-DNmpk6相互作用对时，CFP和YFP信号均被重新分布为高度极化的方式（图3C）。这种重新分布表明，BASL通过与YDA和MPK6相互作用，在植物细胞中对MAPK信号通路进行空间上的重排。BASL的磷酸化状态对MAPK信号通路的极性程度具有差异性影响：模拟磷酸化的BASL版本产生非常强的极性，而缺乏磷酸化的版本则表现出较弱的活性⁶。这些数据支持我们提出的BASL与YDA-MAPK通路之间通过正反馈调控机制建立细胞极性的工作模型⁶。

讨论

烟草瞬时表达系统在信号转导研究中的通用性及可能的改进：在烟草表皮细胞中过表达荧光蛋白（FP）标记的蛋白已被成功用于快速检测植物细胞中蛋白的亚细胞定位。然而，由于复杂的亚细胞环境、瞬时的蛋白质-蛋白质相互作用以及信号转导事件，在活体植物（planta）中研究蛋白复合物的动态信号分布仍是一项具有挑战性的课题。为应对这一挑战，我们利用双分子荧光互补（BiFC）系统来检测MAPK信号事件。通过共表达YDA-nYFP和MPK6-cYFP，恢复的YFP信号表明MAPK信号级联的激活可能发生在质膜上。

同时表达荧光标记的YDA和MPK6将是理想的选择 拟南芥 并检测动态的MAPK信号传导 体内然而，转基因植物的制备过程耗时较长，尤其当需要构建多个表达载体时更为明显。在烟草细胞中进行蛋白质瞬时表达可作为快速的初步检测方法 体内 表达于 拟南芥 或其他植物。烟草瞬时表达系统的另一优势在于，它能够同时共表达多达4至5种融合蛋白，并在组合可行的情况下通过共聚焦显微镜进行观察，而这一.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Phusion DNA 聚合酶	New England Biolabs	M0530S
pENTR/D/TOPO	Life Technologies	K2400-20
QuickChange II XL 定点突变试剂盒	Agilent Technology	200521
LB 肉汤	AMRESCO	J106-2KG
Bacto 琼脂	AMRESCO	J673-1KG
庆大霉素	Sigma-Aldrich	G3632-1G
利福平	Sigma-Aldrich	R3501-1G
卡那霉素	Sigma-Aldrich	K4000-25G
壮观霉素	Sigma-Aldrich	S4014-5G
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266-100G
25 × 75 mm 载玻片	VWR	16004-382
24 × 50 mm 盖玻片	VWR	48393-241
激光扫描共聚焦显微镜	Leica	TCS SP5 II	LAS AF Lite 软件
40X 物镜	Leica	HCX Plan APO	HCX Plan APO，数值孔径 1.30
离心机	Thermo Scientific	SORVALL 6+
打孔器	Staples
50 ml Falcon 管	Genesee Scientific	21-108
No. 5 镊子	Canemco & Marivac	205EQA-Spec