利用烟草瞬时表达系统成像MAPK信号通路的空间重排

摘要

在亚细胞水平上，信号事件受到发育和环境线索的动态调控。本文介绍了一种利用烟草瞬时表达系统监测蛋白质-蛋白质动态相互作用，并揭示植物细胞中信号转导空间组织的实验方案。

摘要

活细胞中动态信号事件的可视化一直是一项挑战。我们将已建立的瞬时表达系统——生物分子荧光互补（BiFC）检测法，在烟草表皮细胞中从检测蛋白质-蛋白质相互作用扩展至监测植物细胞中信号转导的空间分布。在本实验方案中，我们利用BiFC检测法展示了以下蛋白之间的相互作用及信号传导过程： 拟南芥 MAPKKK YODA 和 MAPK6 定位于细胞膜。当共表达支架蛋白 BASL 时，YODA 与 MAPK 的相互作用发生重分布，并在空间上与 CFP-BASL 共极性定位。该改良的烟草表达系统可快速检测信号分子的定位及动态变化（少于 4 天），并可兼容多种荧光蛋白颜色（至少三种）。我们还提供了详细的蛋白质分布定量方法（不对称空间定位，或 "极化"在烟草细胞中。这种先进的烟草表达系统有望被广泛用于活体植物细胞中动态信号事件的快速检测。

引言

蛋白质在复杂的层级网络中相互作用，形成复合物，在不可预测的细胞环境中几乎参与了所有重要的生物学过程。然而，从植物发育到生长响应，目前仍缺乏便捷的工具，能够快速且高效地在亚细胞水平上识别并监测这些动态的信号事件。

在烟草叶片表皮中进行瞬时蛋白表达的系统在活细胞中可视化荧光蛋白方面具有显著优势。该系统提供了一种半体内 允许翻译后蛋白质修饰并快速检测蛋白质定位的条件。通过检测互补的YFP信号，双分子荧光互补（BiFC）实验可揭示植物细胞中蛋白质相互作用的可能性。与其他方法相比， 例如， 酵母双杂交（Y2H）和免疫共沉淀（Co-IP）以及双分子荧光互补（BiFC）均为在亚细胞水平上可视化蛋白质-蛋白质相互作用发生区域的有力手段。

由于不对称细胞分裂（ACD）在产生新细胞类型以形成组织/器官的同时能够维持干细胞群体，因此它是促进真核生物多细胞化不可或缺的机制。拟南芥气孔发育被用作研究植物中ACD的模式系统。前体细胞——分生组织母细胞——进行不对称分裂，产生两个不同的子细胞：一个是分生组织细胞（在最终形成一对保卫细胞之前经历类似干细胞的分裂），另一个是气孔谱系基底细胞（SLGC）（可进一步分裂并分化为铺板细胞）（图1）。在气孔的ACD过程中，一种新蛋白——气孔谱系中不对称性破坏蛋白（Breaking of Asymmetry in the Stomatal Lineage, BASL）——在有丝分裂前发生极性定位，从而驱动分裂过程中的不对称性，包括物理不对称性和细胞命运不对称性¹。由MAPKKK YODA和MAPK MPK3与MPK6组成的MAPK级联信号通路在气孔分裂模式建立和细胞命运决定中起核心作用^2,3,4,5。

最近，Zhang 等将极性蛋白 BASL 与 YDA-MAPK 信号通路联系起来 拟南芥 气孔不对称细胞分裂 ⁶经典的YODA-MAPK通路通过MPK3/6磷酸化BASL并激活其极性定位。磷酸化的BASL发挥支架作用，招募YODA（YDA）和MPK3/6形成蛋白复合物，从而将信号富集于细胞皮层⁶MAPK组分的极性化以及BASL与YDA-MAPK通路之间的正反馈环路，代表了植物细胞中蛋白质极性分布的一种新机制。局部富集的MAPK信号被认为与气孔不对称细胞分裂中的细胞命运分化密切相关。⁶ (图1）。支持该模型的关键实验数据之一来自烟草检测实验，该实验证明了BASL表达可诱导MAPKs的空间重分布⁶.

通常情况下，监测MAPK信号通路发生的位置较为困难，因为MAPK分子在细胞内往往广泛分布。在本研究中，我们利用分裂型YFP系统来可视化上游激酶与下游激酶之间的相互作用，从而推断信号传递发生的位点。我们进一步拓展了双分子荧光互补（BiFC）系统的应用，通过在分裂YFP配对（提示蛋白质-蛋白质相互作用）的基础上共表达第三种CFP标记的蛋白，来观察互补形成的YFP荧光是否以及如何受到共表达CFP蛋白在空间上的调控。通过该方法，我们证明了CFP-BASL的共表达可诱导YDA与MPK6之间相互作用在烟草表皮细胞质膜上的空间重排，从均匀分布转变为极性定位模式。因此，该系统有望被开发用于监测植物细胞在受到内部或外部刺激时动态的信号转导事件例如， 其他蛋白质的共表达、化学物质处理、病原体侵染或环境变化 等等.).

方案

1. 质粒构建

1. 使用克隆技术按先前所述方法构建载体^1,6.
   1. 首先使用高保真DNA聚合酶和适当的引物扩增BASL、YDA和MPK6的编码序列，并将其亚克隆至入门载体中。详细实验步骤见 ⁷.
   2. 为了获得MPK6和YDA的显性负性版本（DNmpk6⁸ 和 DNyda⁴分别以MPK6和YDA的进入载体为模板，采用定点突变方法引入点突变⁹.
2. 为了构建用于烟草瞬时表达实验的载体，需进行标准的LR（attL × attR 重组）反应（详细步骤见 ⁷将BASL整合到pH35CG中¹⁰，将DNyda和DNmpk6插入pXNGW和pXCGW载体中¹¹分别。
   1. 通过酶切和测序验证所得质粒。确认无误后，将双元载体转化至 根癌农杆菌 GV3101菌株¹² 并在28 °C下于选择性平板上培养2至3天。

2. 准备 农杆菌 渗透溶液

1. 接种少量新近转化的 农杆菌 将菌落接种至10 ml含适当抗生素的Luria-Bertani（LB）培养基中（庆大霉素25 μg/ml，利福霉素25 μg/ml），  pH35CG、pXNGW 和 pXCGW 载体使用 100 μg/ml 比较霉素；P19（表达抑制转基因沉默的蛋白）使用相同浓度的庆大霉素和利福霉素，以及 50 μg/ml 卡那霉素¹³.
2. 培养 农杆菌 在28 °C、200 rpm条件下于摇床中培养约16小时，然后测定OD₆₀₀ （预计达到 1.5 - 1.8）图2A-B). 在 2,500 × g 离心 10 分钟，沉淀菌体。用 10 mM MgCl₂ 重悬并洗涤细胞沉淀₂ （浸润溶液）
3. 再次离心培养物，并用适量的侵染溶液重悬沉淀，以达到最终的OD值₆₀₀ = 0.5 (图 2C-D在侵染植物之前，将细胞混合物于室温下静置1 - 3小时。此步骤有助于维持细胞稳态。

3. 烟草植株与叶片注射

1. 使用烟草植物（烟草本氏（Nicotiana benthamiana）在标准植物生长培养箱中（23 °C，16小时光照/8小时黑暗循环）培养4至5周¹⁴ 用于叶片注射。
   注意：此阶段的烟草植株通常具有6片叶子（2片大的、2片中的和2片小的）。其中两片中等大小的叶子最适合进行叶片注射（两片大的叶片通常过老，而两片小的又往往过嫩）。
2. 在接种前一天，给烟草植株浇水以浸透土壤。 
3. 在渗透当天，将植株置于黑暗环境中预孵育1–3小时。该步骤可使表皮上的气孔充分开放，从而极大促进后续渗透过程 农杆菌 当穿透进入叶片表皮细胞时。
4. 使用标有日期的颜色胶带标记需要进行浸润的叶片。用黑色粗头记号笔标记出需要浸润的区域（可选；浸润区域在感染后可见）。
5. 取等体积的 农杆菌 重悬并轻轻晃动100 × 15 mm培养皿中的混合物（图2E）。注意：在本实验中，我们将1 ml p19、1 ml CFP-BASL、1 ml DNyda-nYFP 和 1 ml DNmpk-cYFP 混合。
6. 在渗透过程中，用3 ml无针注射器吸取1–2 ml渗透混合液，并将其注入烟草叶片的下表面（远轴面）。图 2F在渗透过程中，用一只手推动，另一只手轻轻支撑上方（近轴面，与推力相对）会有所帮助。
   注意：一旦成功注入浸润混合液，表皮中被感染的区域将变得易于识别。然而，浸润可能因注射力度过大（造成组织损伤）或推注不足（液体未渗透）而失败。每次实验，我们建议在两片独立的叶片（来自不同植株）上至少进行两次注射。
7. 将感染的植株放回生长室。通常在侵染后48小时可检测到蛋白表达。

4. 共聚焦成像 

1. 在侵染后48小时，使用打孔器从注射区域切取叶盘（通常每个区域可获得3-4个叶盘）图2G）。用镊子将叶圆片轻轻转移至载玻片上（背面朝上），并用数滴水封片。盖玻片上切勿用力按压，以免细胞受挤压或损伤，影响共聚焦显微镜下的观察效果。图2H).
2. 在共聚焦成像前，先在落射荧光复合显微镜上扫描已封片的样品，以检查表达水平。注意：根据我们的经验，表达水平中等的细胞在共聚焦显微镜下成像效果最佳。
3. 使用共聚焦显微镜上的40倍物镜（数值孔径1.3）。调整载玻片至目标位置，使表达中等水平荧光蛋白的细胞位于视野中央。CFP和YFP的激发/发射波长分别为458 nm / 480–500 nm和514 nm / 520–540 nm。
4. 激活 "活体" 按钮以预览图像，然后调节激光强度和智能增益，以获得最平衡的荧光强度与噪声比。为提高成像质量，可增加扫描像素数和/或帧/线平均次数。最后，调节聚焦旋钮至中位焦平面，然后单击 "捕获" 拍摄图像。
   注意：通过勾选或取消勾选相应选项，可依次或同时采集CFP和YFP图像 "连续的" 扫描模式，分别。
5. 当需要对细胞进行深度观察的Z轴投影时，选择 "xyz" 成像模式下，设定扫描范围的深度（10 - 15 µm），并从目标细胞的顶部到底部进行图像采集。通过右键点击图像文件，在 Leica 软件中编译所获得的图像 "重命名" 并以 .tiff 格式导出图像。
6. 对30至40个细胞进行成像，用于定量分析。

5. 图像处理与定量分析

1. 使用 Fiji 软件（http://fiji.sc/Fiji）进行图像处理与定量分析。
   1. 绘制荧光强度图。
      1. 为了更清楚地观察CFP/YFP的表达是否均匀分布，使用Fiji展示CFP和YFP在细胞周边的信号强度。为此，首先启动Fiji，然后选择 "文件" 和 "开放" 开始图像。点击 "线" 在工具菜单上单击并选择 "分段线" 通过右键点击确定感兴趣区域，沿细胞周边画线以追踪 CFP 或 YFP 信号（图3A-C).
         注：Fiji 沿分割的线段测量绝对荧光强度值。
      2. 选择下拉菜单 "分析" 和 "绘图轮廓" 生成一张包含位置和强度值的图表，以表示沿选定线段的CFP/YFP水平。如有需要，可通过选择菜单复制强度值 "复制") 导入 EXCEL 或其他图形软件以生成可比较的强度图。
   2. 量化极性程度。
      1. 从3次重复实验中收集约20个代表性烟草细胞，以评估CFP和YFP的极性程度。根据高荧光强度（定义为H）与低荧光 intensity（定义为L）的比值计算极性程度。注意：定量方法详见 图3.
         1. 为测量 H 和 L 值，沿细胞周边感兴趣区域（如上所述）绘制分段线，然后单击 "分析" 从下拉菜单中，然后选择 "测量"当一个 "结果" 窗口弹出，使用 "平均值" 用于定量分析的数值。
         2. 从表现出相对均匀的CFP和YFP表达的细胞中 例如，CFP-BASL（图3A）或由共表达 DNyda-nYFP 和 DNmpk6-cYFP 所互补产生的 YFP（图3B），通过测量两条随机选择的等长外周节段，获得H值和L值。
         3. 从表现出荧光蛋白明显极性积累的细胞中，在本例中为共表达 CFP-BASL、DNyda-nYFP 和 DNmpk6-cYFP 的细胞（图3C从荧光信号富集的周边区域收集 H 值，从荧光积累较低或无荧光积累的区域收集 L 值。
         4. 将20个细胞的H/L比值结果合并，检验其是否符合正态分布。计算 p t检验的值 t 正态分布检验（正态性检验）或 Kolmogorov-Smirnov（K-S）检验（用于非正态分布）。

结果

为了防止由过度激活的MAPK信号通路引起的细胞死亡，在烟草细胞中共表达实验中使用了激酶失活形式的YDA（DNyda）和MPK6（DNmpk6）。BiFC检测显示DNyda与DNmpk6之间的相互作用，或CFP-BASL本身均未产生不均匀的分布模式（图3A-B）。然而，当将CFP-BASL引入DNyda-DNmpk6相互作用体系时，CFP和YFP信号均被重新分布，呈现出高度极性化的模式（图3C）。这种重新分布表明，BASL通过与YDA和MPK6相互作用，在植物细胞中对MAPK信号通路进行空间上的重排。BASL的磷酸化状态对MAPK信号通路的极性程度具有不同影响：模拟磷酸化的BASL版本产生非常强的极性，而缺乏磷酸化的版本则表现出较弱的活性⁶。这些数据支持我们提出的BASL与YDA-MAPK通路之间通过正反馈调控机制共同建立细胞极性的模型⁶。

<...

讨论

烟草瞬时表达系统在信号转导研究中的通用性及可能的改进：在烟草表皮细胞中过表达荧光蛋白（FP）标记的蛋白已被成功用于快速检测植物细胞中蛋白的亚细胞定位。然而，由于复杂的亚细胞环境、瞬时的蛋白质-蛋白质相互作用以及信号转导事件，在活体植物（planta）中研究蛋白复合物的动态信号分布仍是一项具有挑战性的课题。为应对这一挑战，我们利用双分子荧光互补（BiFC）系统来检测MAPK信号事件。通过共表达YDA-nYFP和MPK6-cYFP，恢复的YFP信号表明MAPK信号级联的激活可能发生在质膜上。

同时表达荧光标记的YDA和MPK6将是理想的选择 拟南芥 并检测动态的MAPK信号传导 体内然而，转基因植物的制备过程耗时较长，尤其当需要构建多个表达载体时更为明显。在烟草细胞中进行蛋白质瞬时表达可作为快速的初步检测方法 体内 表达于 拟南芥 或其他植物。烟草瞬时表达系统的另一优势在于，它能够同时共表达多达4至5种融合蛋白，并在组合可行的情况下通过共聚焦显微镜进行观察，而这一...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Phusion DNA 聚合酶	New England Biolabs	M0530S
pENTR/D/TOPO	Life Technologies	K2400-20
QuickChange II XL 定点突变试剂盒	Agilent Technology	200521
LB 肉汤	AMRESCO	J106-2KG
Bacto 琼脂	AMRESCO	J673-1KG
庆大霉素	Sigma-Aldrich	G3632-1G
利福平	Sigma-Aldrich	R3501-1G
卡那霉素	Sigma-Aldrich	K4000-25G
壮观霉素	Sigma-Aldrich	S4014-5G
MgCl2	Sigma-Aldrich	M8266-100G
25 × 75 mm 载玻片	VWR	16004-382
24 × 50 mm 盖玻片	VWR	48393-241
激光扫描共聚焦显微镜	Leica	TCS SP5 II	LAS AF Lite 软件
40X 物镜	Leica	HCX Plan APO	HCX Plan APO，数值孔径 1.30
离心机	Thermo Scientific	SORVALL 6+
打孔器	Staples
50 ml Falcon 管	Genesee Scientific	21-108
No. 5 镊子	Canemco & Marivac	205EQA-Spec