基于滤膜的表面增强拉曼光谱法快速检测化学污染物

摘要

一种基于滤膜的表面增强拉曼光谱（SERS）检测化学污染物的制备与检测方法即， 杀虫剂福美铁和抗生素氨苄青霉素

摘要

我们展示了一种利用滤膜注射器系统制备高灵敏度表面增强拉曼光谱（SERS）基底的方法，该方法可用于检测多种化学污染物。通过柠檬酸钠还原硝酸银来合成银纳米颗粒（Ag NPs）。随后，加入氯化钠使纳米颗粒聚集形成纳米团簇，并被截留在滤膜的孔隙中。将注射器连接至带有滤膜的滤器装置，把纳米团簇溶液注入注射器并使其通过滤膜，液体可穿过膜，而纳米团簇则被截留，从而形成具有SERS活性的膜基底。在检测目标分析物时，将液体样品注入注射器，并使其流经涂覆有Ag NPs的滤膜，分析物便会结合并富集在Ag NPs修饰的膜上。随后将膜从滤器装置上取下，自然风干，并用拉曼仪器进行检测。本文报道了Ag NPs溶液体积和样品体积对检测灵敏度的影响，并利用所建立的方法实现了对10 ppb浓度的福美铁和1 ppm浓度的氨苄青霉素的检测。

引言

表面增强拉曼光谱（SERS）是一种将拉曼光谱技术与纳米技术相结合的分析方法。在贵金属纳米表面，由于局域表面等离子体共振效应，分析物的拉曼散射信号显著增强。¹ 银纳米粒子（Ag NPs）因其极强的增强能力，迄今为止是最广泛使用的SERS基底。² 目前已开发出多种Ag NPs的合成方法。^3-6 Ag NPs既可单独用作高效的SERS基底，也可与其他材料和结构结合使用，以提高其灵敏度和/或功能性。^7-11

表面增强拉曼光谱技术已展现出在食品和环境样品中检测多种痕量污染物的卓越能力。¹² 传统上，制备表面增强拉曼散射（SERS）样品有两种常用方法：基于溶液的方法和基于基底的方法。¹³ 该 基于溶液的方法利用纳米颗粒胶体与样品混合，随后通过离心收集纳米颗粒-分析物复合物，干燥后将其沉积到固体载体上进行拉曼测量。基于基底的方法通常是将数微升液体样品直接滴加到预制的固体基底上。¹⁴ 然而，这两种方法均无法有效且适用于大体积样品。一些对表面增强拉曼散射（SERS）检测的改进克服了样品体积的限制，例如整合滤膜系统^15-21 或微流控装置的整合。^21-24 改进后的表面增强拉曼散射检测方法在监测大体积水样中化学污染物的灵敏度和可行性方面表现出显著提升。

本文展示了基于注射器滤膜的表面增强拉曼散射（SERS）方法制备与应用的详细实验方案，用于检测痕量农药代森锌（ferbam）和抗生素氨苄青霉素（ampicillin）。

方案

1. 银纳米颗粒的合成¹⁵

1. 将18 mg硝酸银溶解于100 ml超纯水（18.2 ΩU）中，涡旋振荡5秒。
2. 将27 mg二水合柠檬酸钠溶解于1 ml水中，涡旋振荡5秒。
3. 将配制好的硝酸银溶液全部转移至含有搅拌子的锥形瓶中，并将锥形瓶置于磁力加热板上。在剧烈搅拌（搅拌速度为700 rpm）条件下加热，加热板设定温度约为350 °C。
4. 当溶液开始沸腾时，立即将配制好的柠檬酸钠溶液全部加入锥形瓶中，并继续煮沸25分钟，直至溶液变为黄绿色至棕褐色，表明已生成银纳米颗粒（Ag NPs）。
5. 将锥形瓶从加热板上取下，转移至另一磁力搅拌板（不加热）上，在室温下以相同搅拌速度持续搅拌过夜 ，直至混合物颜色和透明度保持恒定，达到稳定状态。如有需要，可使用紫外-可见分光光度计测定所制备Ag NPs的吸光度。
6. 用超纯水将最终混合液定容至100 ml。
7. 如有需要，按照仪器制造商的操作说明，使用Zetasizer测定Ag NPs的粒径。
8. 将银溶胶转移至密封容器中，并用铝箔包裹避光保存。如需长期保存，可置于4–7 °C冰箱中，最长可稳定保存2个月。

2. SERS 活性滤膜的制备

1. 将2.92 g氯化钠（NaCl）溶于100 ml水中，配制成50 mM NaCl溶液。
2. 将1 ml 5 mM NaCl溶液加入1 ml已制备的Ag NPs中，在20 rpm条件下于旋转混合仪上混合10分钟。此步骤旨在使Ag NPs聚集形成Ag纳米簇。
3. 将滤膜（PVDF，0.1 µm 孔径）放入可连接注射器的滤器中。较小孔径的滤膜比大孔径滤膜更有效即， 0.22 µm）在捕获银纳米簇并产生稳定信号方面的作用。
4. 将2 ml制备好的银纳米簇加入注射器中用于过滤。将滤膜 holder 连接到注射器上，手动以每秒1滴的流速将银纳米簇溶液全部通过膜过滤。膜会截留银纳米簇，形成具有SERS活性的滤膜。
5. 从滤膜架上取下滤膜。使用镊子夹持滤膜外缘时需格外小心，避免损坏滤膜。室温下晾干约3分钟，然后将滤膜置于玻片上。
6. SERS基底的拉曼检测
   1. 将拉曼仪器设置为780 nm波长激光，激光功率为5 mW，曝光时间为1秒，曝光次数为2次。将显微镜物镜设为10倍。确保软件中的物镜设置也相应调整为10倍。
   2. 将带有膜的玻璃载玻片放置在拉曼仪器的平台上，使用显微镜对膜表面进行聚焦。
   3. 从膜表面随机选取8-10个位点，仪器将按顺序自动采集。在厂商提供的软件中打开光谱数据进行分析。

3. 应用表面增强拉曼散射活性滤膜系统检测化学污染物

1. 配制 10 ppb 的福美铁溶液。
   注意：福美铁具有高挥发性。称量固体时需采取防护措施（佩戴呼吸器和护目镜）。
   1. 称取 2 mg 福美铁粉末，溶于 20 ml 50% 乙腈溶液（10 ml 乙腈和 10 ml 水）中，配制成储备液（100 ppm）。将烧瓶涡旋振荡 30 秒。
   2. 取 1 ml 100 ppm 的福美铁溶液置于试管中，加入 9 ml 50% 乙腈溶液，配制成 10 ppm 溶液。涡旋振荡试管 5 秒。
   3. 取 1 ml 10 ppm 溶液置于试管中，加入 9 ml 50% 乙腈溶液，配制成 1 ppm 溶液。涡旋振荡试管 5 秒。
   4. 取 1 ml 1 ppm 溶液置于试管中，加入 9 ml 50% 乙腈溶液，配制成 100 ppb 溶液。涡旋振荡试管 5 秒。
   5. 取 1 ml 100 ppb 溶液置于试管中，加入 9 ml 50% 乙腈溶液，配制成 10 ppb 溶液。涡旋振荡试管 5 秒。
2. 配制 1 ppm 的氨苄青霉素溶液。
   1. 称取 10 mg 氨苄青霉素粉末，溶于 100 ml 水中，配制成 100 ppm 的氨苄青霉素溶液。将烧瓶涡旋振荡 30 秒。
   2. 取 1 ml 100 ppm 溶液置于试管中，加入 9 ml 水，配制成 10 ppm 氨苄青霉素溶液。涡旋振荡试管 5 秒。
   3. 取 1 ml 10 ppm 溶液置于试管中，加入 9 ml 水，配制成 1 ppm 氨苄青霉素溶液。涡旋振荡试管 5 秒。
3. 将滤膜放回滤器中，使纳米颗粒（NP）涂层一侧朝上。
4. 取 5 ml 样品加入新的注射器中，然后将其连接至装有银（Ag）涂层膜的滤器。
5. 手动以每秒 1 滴的流速将全部样品体积缓慢通过滤膜。目标分子可被吸附并富集在滤膜表面的纳米颗粒涂层上。
6. 将滤膜从滤器中取出，室温下晾干约 3 分钟，然后采用与步骤 2.6 相同的方法使用拉曼仪器检测信号。
7. 重复步骤 2.2 至 2.6，制备另一张银涂层膜，并从步骤 3.3 开始进行另一个样品的检测。

结果

本实验的主要步骤如示意图（图1）所示。图2表明，在膜包被过程中使用优化体积的AgNPs对于实现最高灵敏度至关重要。使用1 ml Ag NPs时，与0.5 ml（包被不足）或2 ml（包被过量）相比，采用ferbam可获得最强信号。

通过所开发的基于滤膜的表面增强拉曼散射（SERS）检测方法，我们能够以很强的信号强度检测到10 ppb浓度的福美铁和1 ppm浓度的氨苄青霉素（图1）。在10 ppb浓度下，福美铁的SERS光谱显示出明显的特征峰。1,386 cm^-1处的峰来源于CN和C=S伸缩振动以及对称CH₃变形振动的混合模式；1,516 cm^-1处的峰与CH₃和CN的伸缩振动相关；561 cm^-1处的峰由SS伸缩振动产生^25-27

讨论

本方案中的一个关键步骤是银纳米颗粒（Ag NPs）的合成，其中均匀的银纳米颗粒是获得一致结果的关键。加热时间与前驱体的浓度必须精确控制。该批银纳米颗粒的平均粒径为80 nm，由Zetasizer测定（数据未显示）。另一个关键步骤是盐诱导聚集过程，其中盐浓度和聚集时间必须精确控制。此外，膜的选择也至关重要，因为孔径较小的膜被发现更有效地截留银纳米簇。对于本研究中使用的特定膜，具有正反两面，其中正面必须朝上放置于夹持器中以连接注射器。若反向放置，则涂层效果显著降低。在溶液通过膜时避免产生气泡，是实现成功涂层的另一个关键因素。

针对本实验的故障排查，建议采取以下步骤。若未检测到信号或信号较弱，请检查以下可能原因：主要原因可能是银纳米颗粒（Ag NPs）未充分聚集，导致无法被滤膜孔隙截留。可通过提高盐浓度和/或延长孵育时间以增强聚集效果。此外，请确认滤膜的背面是否朝上，以及加样至膜上的样品体积或浓度是否过低。若目标分子的信号不稳定，请检查以下原因：银纳米颗粒的粒径分布可能过宽，或纳米颗粒在膜上的分布不均匀，这可能是由于纳米颗粒过度聚集或通过膜的速度过快所致。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氨苄青霉素	Fisher Scientific	BP1760-5	N/A
福美铁	Chem Service	N-11970-250MG	98+%
硝酸银	Sigma Aldrich	209139	99.0+%
柠檬酸钠二水合物	Sigma Aldrich	W302600	99+%
氯化钠	Sigma Aldrich	S7653	99.5+%
EMD Millipore Durapore PVDF 膜滤器	Fisher Scientific	VVLP01300	0.10 µm 孔径，亲水性
聚碳酸酯滤器支架	Cole-Parmer	EW-29550-40	13 mm 直径
模拟旋涡混合器	Fisher Scientific	02-215-365	N/A
旋转摇床混合器	Fisher Scientific	05-450-213	N/A
DXR 拉曼光谱仪	Thermo Scientific	IQLAADGABFFAHCMAPB	激光功率：1 mW 曝光时间：5 秒