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方法文章

分析 体内 利用细胞移植和延时成像技术研究斑马鱼胚胎中的细胞迁移

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DOI：

10.3791/53792

⸱

2016年4月29日

 ,  , 
1CNRS UMR8197 – INSERM U1024, IBENS, Institut de Biologie de l'École Normale Supérieure, 2Department of Physiology Development and Neuroscience, University of Cambridge

本文内容

摘要

结合细胞移植、细胞骨架标记以及基因功能缺失/获得实验方法，本实验方案描述了如何利用迁移中的斑马鱼前脊索板前体细胞来分析候选基因的功能 体内 细胞迁移

摘要

细胞迁移在许多生理和病理过程中起着关键作用，包括癌症转移。细胞迁移的细胞与分子基础已被深入研究 体外。然而， 体内 细胞迁移在某种程度上不同于 体外 迁移过程更难以分析，因其不易被直接观察和操控。本实验方案以早期斑马鱼胚胎中前脊索板前体细胞的迁移为模型系统，用于研究候选基因在细胞迁移中的功能。前脊索板前体细胞是一群在原肠胚形成期间从胚胎组织中心定向迁移至胚胎动物极的细胞。本方案采用细胞移植技术构建嵌合胚胎，兼具标记单个细胞（有利于高质量成像）和限制功能获得/缺失效应于被观察细胞内的优点，从而确保所观察效应为细胞自主性。本文描述了我们如何评估 TORC2 组分 Sin1 在细胞迁移中的功能，但该方案也可用于分析任何候选基因在调控细胞迁移中的作用 体内.

引言

在多细胞生物中，细胞迁移对于胚胎发育至关重要，可确保细胞有序组织形成组织和器官；同时在成体生命活动中也必不可少，参与维持组织稳态（如伤口愈合）以及免疫反应。除了这些生理功能外，细胞迁移还参与多种病理过程，尤其是癌症的转移。

细胞迁移已被分析 体外 几十年来，人们对细胞在平坦表面上运动的分子机制有了整体性的理解。 在体 然而，细胞所面对的环境更为复杂。近年来的研究明确表明，细胞在生物体内的迁移可能受到细胞外基质、邻近细胞或分泌的趋化因子等外部信号的引导，这些因素会影响迁移过程，且驱动细胞迁移的机制可能与此前所描述的有所不同 体外1,2确保的机制 在体内 细胞迁移迄今为止受到的关注较少，主要原因是与之相比技术难度更高 体外 研究。 在体 分析细胞迁移尤其需要能够直接光学观察迁移中的细胞，采用技术手段标记特定细胞以观察其动态行为和形态，并结合基因功能的获得或缺失方法来验证候选基因的作用。迄今为止，仅有少数具备这些特性的模型系统被用于解析 体内 细胞迁移3.

我们最近利用早期斑马鱼胚胎中前脊索板前体细胞的迁移，建立了一个新的便捷模型系统，用于评估候选基因在调控体内细胞迁移中的功能4,5。前脊索板前体细胞（亦称前侧中内胚层）是一群在原肠胚形成初期出现在胚胎背侧的细胞。在原肠胚形成期间，这群细胞作为一个整体向胚胎的动物极方向集体迁移6-8，最终形成位于脊索前方、神经板下方的中内胚层增厚结构——前脊索板。前脊索板的前部将发育为孵化腺，而后部则可能贡献于头部中胚层9。由于斑马鱼胚胎具有体外发育和光学通透性的优势，该结构中的细胞迁移过程可被直接且便捷地观察。

细胞移植是一种非常有效的技术，可快速且简便地构建嵌合胚胎10。在移植的细胞中表达荧光细胞骨架标记物，可使孤立的细胞被标记，从而便于观察其形态和动态行为。将该技术与基因功能缺失或功能获得方法相结合，可实现对候选基因细胞自主性功能的分析。

本方案描述了我们如何评估TORC2组分Sin1在调控细胞迁移和肌动蛋白动态中的功能 体内5但如结果部分所述并进一步讨论的，该方法可用于分析任何候选基因在调控细胞迁移中的潜在作用 体内.

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方案

注意：图1展示了本实验方案的流程图。

1. 注射和移植用针头的制备

注意：移液针可在任意时间制备并储存。将其放置在培养皿中，并固定在一条橡皮泥带上。用封口膜密封培养皿，以防灰尘污染。

  1. 对于注射针，使用显微拉针仪（参见材料列表）拉制玻璃毛细管（外径1.0 mm，内径0.58 mm，无纤维丝（参见材料列表））。建议使用较短且较细的针（锥形部分约5 mm），因其更易于穿透卵膜。
    注意：注射针为一次性使用。
  2. 细胞移植用针
    1. 使用显微拉针仪（参见材料列表）拉制玻璃毛细管（外径1.0 mm，内径0.78 mm，无纤维丝（参见材料列表））。
    2. 使用微加工仪（参见材料列表），在毛细管尖端内径为35 µm处（略大于待移植细胞的直径）将其切断。
    3. 使用微研磨仪（参见材料列表）以45°角对毛细管切端进行斜面打磨。
    4. 可选步骤：使用微加工仪在针尖末端拉制倒钩。操作时，将斜面尖端接触加热的钨丝后迅速拉离，形成有助于刺入胚胎的倒钩结构。
    5. 将针安装至连接注射器的针座上。通过注射器先用2%氢氟酸冲洗针内腔三次以去除玻璃残留物，再用丙酮冲洗三次。
      警告：氢氟酸具有毒性，操作时须在通风橱内佩戴手套进行。
      注意：细胞移植针可多次重复使用。

2. 注射与细胞移植用培养皿的准备

  1. 将含有0.5 g琼脂糖的50 ml胚胎培养基11放入微波炉中，以全功率加热1分钟，制成含1%琼脂糖的胚胎培养基。将琼脂糖凝胶冷却至约60 °C，然后将50 ml倒入90 mm的培养皿中。在凝胶表面放置特制模具（见材料清单），模具可带有用于注射皿的刻度线，或用于细胞移植皿的孔洞。
    1. 若琼脂糖温度不过高，可观察到模具漂浮于其表面。待琼脂糖凝固后，用镊子移除模具（图2A-B）。
      注意：培养皿可在4 °C下保存，最长可达数周。应将其置于密闭的湿盒中保存，以防干燥。
  2. 使用前将培养皿置于28 °C培养箱中预热30分钟。

3. 胚胎收集与注射

  1. 注射溶液的制备
    注意：使用酵母肌动蛋白结合蛋白140（ABP-140）的肌动蛋白结合结构域（如与mCherry融合的Lifeact，记为ABP140-mCherry）标记细胞内聚合肌动蛋白，以分析细胞突出活性。添加另一种化合物以检测候选基因的功能（例如 显性负性或组成型活性构建体的 mRNA，或吗啉代寡核苷酸）。为评估结果中所述 Sin1 的功能（图3），我们使用了吗啉寡核苷酸。作为对照，我们使用了一种与目标吗啉寡核苷酸序列相同的对照吗啉寡核苷酸 sin1 吗啉代寡核苷酸，但其中5个核苷酸沿序列分布，使得该对照吗啉代不与靶RNA序列匹配。
    1. 解冻 sin1 以及含 5 个错配的对照吗啉代寡核苷酸（2 mM 储备液）和 ABP140-mCherry mRNA，置于冰上。加入 375 ng mRNA（75 ng/μL）µl 最终）和 0.75 µl 或 sin1 或5-错配对照吗啉 oligo（终浓度0.3 mM）置于Danier缓冲液（58 mM NaCl，0.7 mM KCl，0.4 mM MgSO₄）中4，0.6 mM Ca(NO3)2，5.0 mM HEPES（pH 7.6），加至总体积5 µ1.
  2. 胚胎收集
    注意：本实验设置中，供体和受体胚胎均为转基因胚胎，其绿色荧光蛋白（GFP）的表达由 鹅头蛋白（goosecoid） (gsc）启动子以可视化前体脊索前板11.
    1. 收集 Tg(gsc:gfp) 卵。将约80枚卵置于盛有胚胎培养基的90 mm培养皿中，并在28 °C下孵育 °C.
  3. 注射供体胚胎
    1. 在体视显微镜下，用镊子轻轻将收集的胚胎挤入装有胚胎培养基的注射皿的凹槽中。用镊子将胚胎调整方向，使细胞朝上。将注射皿置于28 °C培养箱中培养。 °C，直到胚胎发育至4细胞期（受精后1小时）。
    2. 用注射针吸取 2 µ注射液的量。将针头插入显微操作器（见材料列表）上的针头夹持器（见材料列表）中，并通过聚四氟乙烯（PTFE）管路（见材料列表）连接 材料) 连接到一个空气注射器（参见材料列表）。
    3. 用精细镊子轻轻触碰毛细管尖端以打开。如有必要，可捏住毛细管末端将其剪开。
    4. 用针进入四个细胞中的一个，并将溶液注入细胞内，使其充满细胞体积的70%（2 nl）。注射30个胚胎。
      注意：由于细胞质膜较软，将针插入细胞可能较为困难。瞄准细胞与卵黄之间的连接处有助于针头穿透。
    5. 将胚胎置于 28 °C 培养箱中培养至细胞达到球形期（受精后 4 小时）。

4. 细胞移植用胚胎的制备

  1. 准备 20 ml 胚胎培养基，加入 200 µl 青霉素/链霉素（见材料列表）（Pen/Strep EM）。
  2. 在胚球期（受精后 4 小时）进行胚胎去壳处理
    注意：去壳后的胚胎非常脆弱，若接触空气或塑料表面会破裂。因此，需将其置于琼脂糖包被的培养皿中，并使用火焰抛光的玻璃巴斯德吸管进行转移。
    1. 使用塑料巴斯德吸管，将步骤 3.2 收集的宿主胚胎和步骤 3.3 注射后的供体胚胎分别转移至两个直径为 35 mm、已用含胚胎培养基的 1% 琼脂糖包被并加入 Pen/Strep EM 的培养皿中。宿主胚胎与供体胚胎应分开放置在不同的培养皿中。
    2. 使用精细镊子（见材料列表）手动将胚胎从其卵膜中取出。
    3. 将胚胎置于 28 °C 培养箱中，直至发育至盾牌期（受精后 6 小时）。

5. 细胞移植

  1. 准备用于细胞移植的胚胎。
    1. 在荧光体视显微镜下，挑选在盾片（绿色）内表达 ABP140-mCherry（红色）的供体胚胎。
    2. 使用火焰抛光的巴斯德移液管，将胚胎转移至含有青霉素/链霉素 EM 的细胞移植培养皿的孔中。将受体胚胎排成一行，供体胚胎排在相邻的一行。
    3. 利用睫毛小心地将胚胎调整为盾片朝上的方向。
      注意：盾片的位置可通过 GFP 表达或解剖学特征进行判断。
  2. 移植系统的组装。
    注意：移植系统由一个针持（参见材料列表），通过聚四氟乙烯（PTFE）管（参见材料列表）和管接头（参见材料列表）连接至装有微调驱动装置的 Hamilton 注射器（参见材料列表）。针持安装在一个三轴微操作器上（参见材料列表）。
    1. 将连接注射器的针持用于以70%乙醇冲洗细胞移植用针。通过抽吸空气将针内干燥。切勿通过吹气干燥，以免灰尘滞留在针的锥形部分。
    2. 将移植针插入与 Hamilton 注射器相连的针持中，使针尖斜面朝上。
  3. 盾片至盾片的细胞移植
    1. 将移植针插入供体胚胎的盾片，吸取约10–20个标记有 ABP140-mCherry 的细胞。注意避免吸入卵黄。
    2. 将细胞移植到受体胚胎的盾片中。重复此步骤，直至所有受体胚胎均完成移植。
    3. 使用火焰抛光的巴斯德移液管移除任何受损的胚胎。将移植后的胚胎置于28 °C培养箱中，使其恢复约30分钟。
    4. 使用连接注射器的针持，用水冲洗细胞移植针，并将其放回置于培植土条上的培养皿中。用封口膜密封培养皿。

6. （可选）单细胞移植

注意：在胚胎中，细胞彼此黏附，因此很难仅用移植针吸取单个细胞。我们开发了一种改良方案，以方便移植单个前脊索板前体细胞。其思路是在移植前将细胞解离。由于分离的前脊索板前体细胞容易失去其原有特性，我们在缺乏Sox32转录因子的情况下，通过激活Nodal信号通路，从遗传上赋予这些细胞前脊索板的发育潜能。我们已验证，这些诱导产生的细胞行为与内源性前脊索板前体细胞相似8。以下是进行单细胞移植的具体步骤。细胞解离通过将胚胎置于无钙林格液11中，切取外植体并进行机械搅动来实现。

  1. 在步骤 2.1 中，使用无钙 Ringer 溶液配制含 1% 琼脂糖的移植培养皿，而非胚胎培养基。
  2. 在步骤 3.1 中，除 ABP140-mCherry RNA 和 sin1 morpholino 外，还需加入编码 Nodal 受体 Taram-A 活性形式的 RNA 3 ng（终浓度 0.6 ng/µl）以及抗 sox32 的 morpholino 1.25 µl（储存液浓度为 2 mM，终浓度为 0.5 mM）。
  3. 在步骤 4 之后，用火焰抛光的巴斯德移液管将三个选定的供体胚胎转移至含有青霉素/链霉素无钙 Ringer 溶液的细胞移植培养皿中。用精细镊子切取包含已注射细胞（ABP140-mCherry 标记细胞）的外植块，并迅速丢弃胚胎其余部分。
  4. 用睫毛针轻轻搅动外植块，直至细胞解离。
  5. 用移植针吸取单个分离的细胞，并将其移植至宿主胚胎的胚盾部位。
  6. 用火焰抛光的巴斯德移液管将胚胎转移至涂有琼脂糖、并加有青霉素/链霉素胚胎培养基的培养皿中，于 28 °C 培养箱中孵育 30 分钟。

7. 胚胎安装

  1. 成像腔室
    1. 方法1：使用由塑料载玻片（75*25*0.5 mm）制成的成像腔室，该载玻片上打有4个孔（直径5.5 mm），一侧边缘高3 mm（图2C-D）。用氰基丙烯酸酯胶（瞬间胶）将盖玻片粘在背面。
      注意：实验结束后，将腔室置于水中过夜，以便取下盖玻片，并用砂纸去除残留的胶。
    2. 方法2：使用35 mm MatTek玻璃底培养皿（见材料列表），带10 mm孔。
  2. 胚胎固定
    1. 用1 ml热的0.2%琼脂糖胚胎培养基填充一个玻璃小瓶。将其置于42 °C的加热块中保温。
    2. 在荧光体视显微镜下，挑选一个红色移植细胞位于绿色标记的预定前脊索板内的胚胎（即红色移植细胞位于绿色标记的预定前脊索板内部，并已开始向动物极迁移）。
    3. 用火焰抛光的巴斯德移液管将选定的胚胎转移至琼脂糖溶液中。弃去移液管中多余的胚胎培养基。吸取含有胚胎的琼脂糖溶液，将胚胎转移至成像腔室中，并滴加一滴琼脂糖。在琼脂糖凝固前，用睫毛工具调整胚胎方向。若使用正置显微镜成像，则使预定前脊索板朝上；若使用倒置显微镜，则使其朝向玻璃底面。待琼脂糖凝固（约1分钟，时间取决于室温）后，再在腔室的下一个孔中固定另一个胚胎。
      注意：一个含4个孔的成像腔室最多可固定4个胚胎。
    4. 琼脂糖凝固后，向腔室内加入含青霉素/链霉素的胚胎培养基（Pen/Strep EM），以防止干燥。

8. 活体成像

  1. 使用40倍水浸长工作距离物镜。选用合适的滤光片组分别对GFP和mCherry进行成像（GFP：激发滤光片带通470/40，分光镜510FT，发射滤光片带通540/50；mCherry：激发滤光片带通578/21，分光镜596FT，发射滤光片长通641/75）。调整曝光时间以优化图像动态范围。
  2. 为成像前板中的所有细胞，获取z轴层扫图像，起始位置略低于 µm 位于预定前脊索板上方（在外胚层中），并终止于几处 µ位于预定前脊索板下方（在卵黄中）m处。使用2的z步长 µm. 为优化采集速度，应在 z 层扫描之间切换颜色，而非在帧之间切换。
    注意：这可能导致绿色和红色图像之间存在轻微差异，但由于无需绿色与红色信号之间的精确共定位，因此不会造成问题。为了进一步减少成像时间及光照暴露，可每隔5个时间点采集一次绿色信号，这已足以识别前脊索板前体细胞。
  3. 使用上述设置，在分析突起频率和方向性所需的两分钟时间间隔内，对最多4个胚胎进行成像。对于突起寿命的分析，将时间间隔缩短至30秒，以获得更高的时间分辨率。成像时期从60%上胚层形成期至80%上胚层形成期。

9. 细胞动态分析

  1. 在 ImageJ 中加载 4D 图像
    注意：根据所使用的采集软件，图像会以不同的格式存储（每个图像一个文件、每个z轴层栈一个文件、或整个实验一个文件）。一些ImageJ插件可在线获取，用于打开4D图像栈。我们的数据以每个z轴层栈一个文件的形式存储。由于数据集可能较大，可选择仅打开其中一部分（某些时间点、z轴层栈的子区域，或转换为8位的图像）。…我们使用一款自主开发的 ImageJ 插件来实现此目的，如有需要，可提供该插件。
  2. 细胞突起方向性与频率的分析
    1. 使用GFP图像确定前索板前体细胞迁移的主要方向，并以此作为细胞突起角度测量的参考。旋转图像序列，使该参考方向与图像的一侧平行。
    2. 追踪单个细胞。选择角度工具。对于每一帧和每个突起，使用角度工具测量突起与参考方向之间的角度（图3A）。使用“分析/测量”命令存储该值（或按键盘上的 M 键）。将结果保存为 txt 文件。对下一个细胞重复上述操作。
    3. 将数据导入 R 并以直方图形式绘制角度分布。使用 Kolmogorov-Smirnov 检验（R 中的 ks.test）比较不同条件。
      注：角度工具提供的数值范围在 0 之间° 和 180°，从而允许使用经典统计检验而非循环检验。
    4. 使用该数据集，计算发射频率，即每个细胞每分钟的突起数量。使用学生t检验（R语言中的t.test）比较不同条件之间的差异。
  3. 细胞突起寿命分析
    1. 针对每个细胞及每个突起，测量突起持续时间（突起存在的帧数 × 帧间时间间隔）。
    2. 将数据导入 R。使用学生 t 检验（R 中的 t.test）比较不同条件。
      注意：为了表征细胞迁移，分析其他迁移特征也可能具有重要意义，例如细胞轨迹（用于速度、方向和持续性测量）或细胞形态。虽然已有多种商业软件可用于测量这些特征，但也存在大量开源软件和 ImageJ 插件，例如可用于分析形态动力学的 ADAPT。12，使用 DiPer 分析细胞轨迹和方向性持续性13，使用 CellTrack 追踪细胞迁移过程中的细胞边界14.

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结果

所采用的技术用于分析Sin1（TORC2复合物的核心组分之一）在调控中的作用 体内 细胞迁移。细胞移植技术可用于标记分离的细胞，并分析细胞自主效应。视频S1展示了移植的前脊索板前体细胞的迁移过程。通过ABP140标记肌动蛋白，可清晰显示富含肌动蛋白的细胞质突起。我们对其频率和方向进行了测量。野生型细胞会产生频繁且较大的细胞质突起，其方向朝向动物极。 即 迁移方向图3B）。Sin1功能的丧失会导致突起数量急剧减少，且剩余突起的排列呈现随机化，表明Sin1在该过程中的重要性 sin1 在调控富含肌动蛋白的突起形成方面。有趣的是，该表型可通过表达一种组成型活性形式的Rac1得以挽救15，强烈表明TorC2通过Rac1调控肌动蛋白动态和细胞突起形成图3B).

该技术还被用于表征Arpin（一种新近发现的Arp2/3复合...

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讨论

本方案提供了一种简便的方法，用于研究候选基因在细胞迁移中的作用 在体内通过细胞移植构建嵌合胚胎并结合活体成像。

嵌合胚胎的制备

研究细胞动态需要可视化其轮廓以分析细胞质突起。通过在未标记或不同标记的环境中标记单个细胞，可获得良好的视觉对比度。

一种对胚胎中部分细胞进行随机标记的简便方法是在1细胞期注射质粒DNA16。注射后的质粒会形成聚集体，在细胞分裂过程中被随机且不均等地分配到子细胞中。这导致质粒仅在部分随机的细胞中表达，因此是一种快速、简便且非侵入性的嵌合胚胎制备方法。然而，表达注射质粒的细胞往往形成簇状结构，在预定前脊索板区域找到仅含少量孤立表达细胞的胚胎概率较低。此外，使用质粒DNA对所注射载体的表达水平调控能力非常有限。尽管细胞移植构建嵌合胚胎的技术难度高于质粒DNA注射，但其具有多项优势：可控制移植细胞的数量、可调控载体表达水平（通过RNA注射），最重要的是，通过构建嵌合胚胎使移植细胞携带功能缺失或功能获得型载体，可检测...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢 F. Bouallague 和 IBENS 动物设施对斑马鱼的精心养护。本出版物所报道的研究由癌症研究 ARC 基金会资助，项目编号 N° SFI20111203770 和 N° PJA 20131200143

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
玻璃毛细管（外径 1.0 mm，内径 0.58 mm）Harvard Apparatus300085标准壁厚
玻璃毛细管（外径 1.0 mm，内径 0.78 mm）Harvard Apparatus300085薄壁型
青霉素-链霉素Sigma-AldrichP4333每毫升含 10 000 单位青霉素和 10 mg 链霉素
精细镊子Dumont Fine Science Tools11254-205F
玻璃底培养皿MatTekP35G-0-10-C
空气注射仪Eppendorf5246
微电极拉制仪NarishigeMF-900
微电极研磨仪NarishigeEG-44
显微操作器（用于注射）NarishigeMN-151
显微操作器（用于细胞移植）LeicaLeica Micromanipulator
哈密尔顿注射器NarishigeIM-9B
微电极拉制仪David Kopf InstrumentsModel 720
移植模具Adapative Science ToolsPT-1
持针器NarishigeHI-7
管路连接器NarishigeCI-1
聚四氟乙烯管NarishigeCT-1

参考文献

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