分析 体内 利用细胞移植和延时成像技术研究斑马鱼胚胎中的细胞迁移

摘要

结合细胞移植、细胞骨架标记以及基因功能缺失/获得实验方法，本实验方案描述了如何利用迁移中的斑马鱼前脊索板前体细胞来分析候选基因的功能 体内 细胞迁移

摘要

细胞迁移在许多生理和病理过程中起着关键作用，包括癌症转移。细胞迁移的细胞与分子基础已被深入研究 体外。然而， 体内 细胞迁移在某种程度上不同于 体外 迁移过程更难以分析，因其不易被直接观察和操控。本实验方案以早期斑马鱼胚胎中前脊索板前体细胞的迁移为模型系统，用于研究候选基因在细胞迁移中的功能。前脊索板前体细胞是一群在原肠胚形成期间从胚胎组织中心定向迁移至胚胎动物极的细胞。本方案采用细胞移植技术构建嵌合胚胎，兼具标记单个细胞（有利于高质量成像）和限制功能获得/缺失效应于被观察细胞内的优点，从而确保所观察效应为细胞自主性。本文描述了我们如何评估 TORC2 组分 Sin1 在细胞迁移中的功能，但该方案也可用于分析任何候选基因在调控细胞迁移中的作用 体内.

引言

在多细胞生物中，细胞迁移对于胚胎发育至关重要，可确保细胞有序组织形成组织和器官；同时在成体生命活动中也必不可少，参与维持组织稳态（如伤口愈合）以及免疫反应。除了这些生理功能外，细胞迁移还参与多种病理过程，尤其是癌症的转移。

细胞迁移已被分析 体外 几十年来，人们对细胞在平坦表面上运动的分子机制有了整体性的理解。 在体 然而，细胞所面对的环境更为复杂。近年来的研究明确表明，细胞在生物体内的迁移可能受到细胞外基质、邻近细胞或分泌的趋化因子等外部信号的引导，这些因素会影响迁移过程，且驱动细胞迁移的机制可能与此前所描述的有所不同 体外^1,2确保的机制 在体内 细胞迁移迄今为止受到的关注较少，主要原因是与之相比技术难度更高 体外 研究。 在体 分析细胞迁移尤其需要能够直接光学观察迁移中的细胞，采用技术手段标记特定细胞以观察其动态行为和形态，并结合基因功能的获得或缺失方法来验证候选基因的作用。迄今为止，仅有少数具备这些特性的模型系统被用于解析 体内 细胞迁移³.

我们最近利用早期斑马鱼胚胎中前脊索板前体细胞的迁移，建立了一个新的便捷模型系统，用于评估候选基因在调控体内细胞迁移中的功能^4,5。前脊索板前体细胞（亦称前侧中内胚层）是一群在原肠胚形成初期出现在胚胎背侧的细胞。在原肠胚形成期间，这群细胞作为一个整体向胚胎的动物极方向集体迁移^6-8，最终形成位于脊索前方、神经板下方的中内胚层增厚结构——前脊索板。前脊索板的前部将发育为孵化腺，而后部则可能贡献于头部中胚层⁹。由于斑马鱼胚胎具有体外发育和光学通透性的优势，该结构中的细胞迁移过程可被直接且便捷地观察。

细胞移植是一种非常有效的技术，可快速且简便地构建嵌合胚胎¹⁰。在移植的细胞中表达荧光细胞骨架标记物，可使孤立的细胞被标记，从而便于观察其形态和动态行为。将该技术与基因功能缺失或功能获得方法相结合，可实现对候选基因细胞自主性功能的分析。

本方案描述了我们如何评估TORC2组分Sin1在调控细胞迁移和肌动蛋白动态中的功能 体内⁵但如结果部分所述并进一步讨论的，该方法可用于分析任何候选基因在调控细胞迁移中的潜在作用 体内.

方案

注意：图1展示了本实验方案的流程图。

1. 注射和移植用针头的准备

注意：针头可随时制备并储存。将它们放置在培养皿中，并置于一条橡皮泥带上。用Parafilm密封培养皿，以防灰尘污染。

1. 对于注射针，使用微量移液器拉制仪（见材料列表）拉制玻璃毛细管（外径1.0 mm，内径0.58 mm，无纤维丝（见材料列表））。建议使用较短且较细的针头（锥形部分约5 mm），因其更易于刺穿卵膜。
   注意：注射针为一次性使用。
2. 细胞移植用针
   1. 使用微量移液器拉制仪（见材料列表）拉制玻璃毛细管（外径1.0 mm，内径0.78 mm，无纤维丝（见材料列表））。
   2. 使用微加工仪（见材料列表），在毛细管尖端内径为35 µm处（略大于待移植细胞的直径）将其切断。
   3. 使用微研磨仪（见材料列表），以45°角对毛细管切端进行斜面打磨。
   4. 可选步骤：使用微加工仪在针尖末端拉制倒钩。操作时，将斜面尖端接触加热的灯丝后迅速拉离，形成有助于刺入胚胎的倒钩结构。
   5. 将针头安装至连接注射器的针座上。通过注射器先用2%氢氟酸冲洗针内腔三次以去除玻璃残留物，再用丙酮冲洗三次。
      警告：氢氟酸具有毒性，操作时须在通风橱内佩戴手套进行。
      注意：细胞移植针可多次使用。

2. 注射和细胞移植用培养皿的制备

1. 将含有 0.5 g 琼脂糖的 50 ml 胚胎培养基¹¹置于微波炉中，全功率加热 1 分钟，制成含 1% 琼脂糖的胚胎培养基。将琼脂糖凝胶冷却至约 60 °C，倒入 90 mm 的培养皿中。在凝胶表面放置特制模具（见材料清单），模具可带有用于注射的凹槽线，或用于细胞移植的孔穴。
   1. 若琼脂糖温度不过高，可观察到模具漂浮于琼脂糖表面。待琼脂糖凝固后，用镊子移除模具（图 2A-B）。
      注意：培养皿可在 4 °C 保存数周。应将其置于密闭的湿盒中，以防干燥。
2. 使用前将培养皿置于 28 °C 培养箱中预热 30 分钟。

3. 胚胎收集与显微注射

1. 注射溶液的制备
   注意：使用酵母肌动蛋白结合蛋白140（ABP-140）的肌动蛋白结合结构域（如与mCherry融合的Lifeact，称为ABP140-mCherry）来可视化细胞内聚合的肌动蛋白，以分析细胞突出活性。加入另一种化合物以检测候选基因的功能例如 显性负性或组成型活性构建体的mRNA，或吗啉代寡核苷酸）。为评估Sin1的功能，如结果部分所述（图3），我们使用了吗啉代寡核苷酸。作为对照，我们使用了一种与目标序列相同的吗啉代寡核苷酸 sin1 对照morpholino在序列上每隔5个核苷酸设计，使其不与靶RNA序列匹配。
   1. 解冻 sin1 以及5个错配对照morpholino（2 mM储存液）和ABP140-mCherry mRNA，置于冰上。加入375 ng mRNA（每75 ng/μL）µl 终浓度）和 0.75 µ或 l sin1 或5-错配对照吗啉代寡核苷酸（终浓度0.3 mM）溶于Danienau缓冲液（58 mM NaCl，0.7 mM KCl，0.4 mM MgSO₄）₄，0.6 mM Ca(NO₃)₂，5.0 mM HEPES（pH 7.6），加至总体积5 µl.
2. 胚胎收集
   注意：本实验设置中，供体和受体胚胎均为转基因胚胎，均在GFP启动子的调控下表达GFP goosecoid (gsc) 启动子以可视化预期的前脊索板¹¹.
   1. 收集 Tg(gsc:gfp）卵。将约80枚卵放入盛有胚胎培养基的90 mm培养皿中，于28℃孵育 °C.
3. 注射供体胚胎
   1. 在体视显微镜下，用镊子将收集的胚胎轻轻挤入装有胚胎培养基的注射板凹槽中。使用镊子调整胚胎方向，使细胞朝上。将注射板置于28℃培养箱中 °C，直至胚胎发育至4细胞期（受精后1小时）。
   2. 用注射针吸取 2 µ注射溶液的量。将针头插入显微操作器（见材料列表）上的针头夹持器（见材料列表）中，并通过聚四氟乙烯（PTFE）管路（见材料列表）连接 材料）连接至空气注射器（参见材料清单）。
   3. 用精细镊子轻轻触碰毛细管尖端将其打开。如有必要，可捏住毛细管末端将其剪开。
   4. 用针进入四个细胞中的一个，将溶液注入细胞内，使注入量达到细胞体积的70%（2 nl）。共注射30个胚胎。
      注意：由于细胞质膜较软，将针插入细胞可能较为困难。瞄准细胞与卵黄之间的连接处有助于针头穿透。
   5. 将胚胎置于28 °C 培养箱中培养至卵裂球阶段（受精后 4 小时）。

4. 细胞移植用胚胎的制备

1. 准备 20 ml 胚胎培养基，加入 200 µl 青霉素/链霉素（见材料列表）（Pen/Strep EM）。
2. 在球形期（受精后 4 小时）对胚胎进行去壳处理
   注意：去壳后的胚胎非常脆弱，若接触空气或塑料表面会破裂。因此，必须将它们置于琼脂糖包被的培养皿中，并使用火焰抛光的玻璃巴斯德吸管进行转移。
   1. 使用塑料巴斯德吸管，将步骤 3.2 中收集的宿主胚胎和步骤 3.3 中注射过的供体胚胎分别转移至两个预先用含胚胎培养基的 1% 琼脂糖包被的 35 mm 培养皿中，并加入 Pen/Strep EM。宿主胚胎和供体胚胎应分开放置在不同的培养皿中。
   2. 使用精细镊子（见材料列表）手动将胚胎从其卵膜中取出。
   3. 将胚胎置于 28 °C 培养箱中，直至发育至盾牌期（受精后 6 小时）。

5. 细胞移植

1. 准备用于细胞移植的胚胎。
   1. 在荧光体视显微镜下，挑选在盾板（绿色）内表达 ABP140-mCherry（红色）的供体胚胎。
   2. 使用火焰抛光的巴斯德吸管，将胚胎转移至含有青霉素/链霉素胚胎培养基（Pen/Strep EM）的细胞移植培养皿的孔中。将受体胚胎排成一行，供体胚胎排在相邻的一行。
   3. 利用睫毛小心调整胚胎方向，使盾板朝上。
      注意：盾板的位置可通过 GFP 表达或解剖结构来判断。
2. 移植系统设置。
   注意：移植系统由一个针头夹持器（见材料列表）通过聚四氟乙烯（PTFE）管（见材料列表）和管路连接器（见材料列表）连接至配备微驱动装置的汉密尔顿注射器（见材料列表）组成。针头夹持器安装在一个三轴显微操作器上（见材料列表）。
   1. 将连接注射器的针头夹持器用于实验，先用70%乙醇冲洗细胞移植用针头，然后吸入空气将针头干燥。切勿通过吹气干燥，以免灰尘卡在针头的锥形部分。
   2. 将针头插入与汉密尔顿注射器相连的针头夹持器中，确保斜面朝上。
3. 盾板对盾板的细胞移植
   1. 将移植针插入供体胚胎的盾板区域，吸取约10–20个标记有 ABP140-mCherry 的细胞。注意避免吸入卵黄。
   2. 将细胞移植到受体胚胎的盾板区域。重复此步骤，直至所有受体胚胎均完成移植。
   3. 使用火焰抛光的巴斯德吸管移除任何受损的胚胎。将已移植的胚胎置于28 °C培养箱中，使其恢复约30分钟。
   4. 将连接注射器的针头夹持器用于实验，用水冲洗细胞移植针，然后将其放回盛放在塑性黏土条上的培养皿中，并用封口膜密封培养皿。

6. （可选）单细胞移植

注意：在胚胎中，细胞彼此黏附，因此很难仅用移植针吸取一个细胞。我们开发了一种改良方案，可轻松移植单个前脊索板前体细胞。其思路是在移植前将细胞解离。由于分离的前脊索板前体细胞容易失去其细胞特性，我们通过在缺乏 Sox32 转录因子的条件下激活 Nodal 信号通路，从基因层面赋予这些细胞前定的前脊索板特性。我们已验证，这些诱导产生的细胞行为与内源性前脊索板前体细胞一致⁸。以下是进行单细胞移植的具体步骤。通过将胚胎置于无钙林格液¹¹中，切取外植体并进行机械搅拌，即可实现细胞解离。

1. 在步骤 2.1 中，使用无钙林格液（Calcium-free Ringer）配制含 1% 琼脂糖的移植培养皿，而非胚胎培养基（Embryo Medium）。
2. 在步骤 3.1 中，除 ABP140-mCherry RNA 和 sin1 morpholino 外，还需加入编码 Nodal 受体 Taram-A 活性形式的 RNA 3 ng（终浓度 0.6 ng/µl），以及针对 sox32 的 morpholino 1.25 µl（储存液浓度为 2 mM，终浓度为 0.5 mM）。
3. 在步骤 4 之后，用火焰抛光的巴斯德移液管将三个选定的供体胚胎转移至含有青霉素/链霉素无钙林格液（Pen/Strep Calcium-free Ringer）的细胞移植培养皿中。用精细镊子切取包含注射细胞（ABP140-mCherry 标记细胞）的外植块，并迅速弃去胚胎其余部分。
4. 用一根眼睫毛轻轻搅动外植块，直至细胞解离。
5. 用移植针吸取单个分离的细胞，并将其移植到宿主胚胎的盾板（shield）区域。
6. 使用火焰抛光的巴斯德移液管将胚胎转移至涂有琼脂糖、并加入青霉素/链霉素胚胎培养基（Pen/Strep EM）的培养皿中，将胚胎置于 28 °C 培养箱中孵育 30 分钟。

7. 胚胎封片

1. 成像室
   1. 方法1：使用由塑料载片（75*25*0.5 mm）制成的成像室，载片上打有4个孔（直径5.5 mm），一侧带有3 mm高的边缘图2C-D用氰基丙烯酸酯胶水（万能胶）将玻璃盖玻片粘在背面。
      注意：实验结束后，将培养 chamber 浸入水中过夜，以取下盖玻片，并用砂纸去除胶水残留。
   2. 方法2：使用35 mm MatTek玻璃底培养皿（参见列表中的 材料）带有一个10 mm的孔。
2. 胚胎固定
   1. 用1 ml 42°C的胚胎培养基中的0.2%热琼脂糖填充一个玻璃小瓶。保持在42°C °在加热块中于 C 温度下进行。
   2. 在荧光体视显微镜下，选择一个红色移植细胞位于绿色标记的预定前脊索板区域内的胚胎（即 红色移植细胞位于绿色的前脊索板区域内部，并已开始向动物极迁移。
   3. 使用火焰抛光的巴斯德移液管将选定的胚胎转移至琼脂糖溶液中。弃去移液管中多余的胚胎培养液。用移液管吸取含有胚胎的琼脂糖，将其转移至成像腔室中，并滴加一滴琼脂糖。在琼脂糖凝固前，用睫毛工具调整胚胎方向。若使用正置显微镜成像，则将预定脊索前板朝上放置；若使用倒置显微镜成像，则将其置于玻璃底面朝下。待琼脂糖完全凝固（约1分钟，具体时间取决于室温）后，再于腔室的下一个孔中安装另一枚胚胎。
      注意：一个含有4个孔的成像腔室可同时装载最多4个胚胎。
   4. 琼脂糖凝固后，用青霉素-链霉素培养基（Pen/Strep EM）填充腔室，以防止干燥。

8. 活体成像

1. 使用40倍水浸长工作距离物镜。采用适当的滤光片组分别对GFP和mCherry进行成像（GFP：激发滤光片BP 470/40，二向色镜FT 510，发射滤光片BP 540/50；mCherry：激发滤光片BP 578/21，二向色镜FT 596，发射滤光片LP 641/75）。调整曝光时间以优化图像动态范围。
2. 为成像培养板中的所有细胞，获取z轴层扫图像，起始位置略低于细胞层 µm 位于预定脊索前板上方（在外胚层中），并终止于其前方几处 µm，位于预定脊索前板下方（卵黄内）。使用2的z步长 µm. 为优化采集速度，应在 z 层间切换颜色，而非在帧间切换。
   注意：这可能导致绿色和红色图像之间存在轻微差异，但由于绿色与红色信号之间无需精确共定位，因此不会造成问题。为了进一步减少成像时间和光照暴露，可每隔5个时间点采集一次绿色信号，这已足以识别脊索前板前体细胞。
3. 使用上述设置，在两分钟的时间间隔内对最多4个胚胎进行成像，以分析突起的频率和方向。若需分析突起的持续时间，则将时间间隔缩短至30秒，以获得更高的时间分辨率。成像时期从原肠胚50%上胚层延伸（60% epiboly）至80%上胚层延伸（80% epiboly）。

9. 细胞动力学分析

1. 在 ImageJ 中加载 4D 图像
   注意：根据所使用的采集软件，图像会以不同的格式存储（每个图像一个文件、每个z-stack一个文件、或整个实验一个文件）。一些ImageJ插件可在线获取，用于打开4D图像堆栈。我们的数据以每个z-stack一个文件的形式存储。由于数据集可能较大，可选择仅打开其中一部分（某些时间点、z-stack的子区域，或转换为8位的图像）。…我们使用一款自制的 ImageJ 插件来完成此操作，如有需要，我们很乐意提供该插件。
2. 细胞突起方向性与频率的分析
   1. 利用GFP图像确定前脊索板迁移的主要方向，并以此作为细胞突起角度测量的参考。旋转图像序列，使该参考方向与图像的一侧边缘平行。
   2. 追踪单个细胞。选择角度工具。针对每一帧图像中的每个突起，使用角度工具测量该突起与参考方向之间的夹角（图3A）。使用“分析/测量”命令存储该数值（或按键盘上的 M 键）。将结果保存为 txt 文件。对下一个细胞重复上述操作。
   3. 将数据导入 R 并以直方图形式绘制角度分布。使用 Kolmogorov-Smirnov 检验（R 中的 ks.test）比较不同条件。
      注意：角度工具提供的数值范围在 0 之间° 和 180°，从而允许使用经典统计检验而非循环检验。
   4. 根据该数据集，计算发射频率，即每个细胞每分钟的突起数量。使用学生t检验（R语言中的t.test）比较不同条件之间的差异。
3. 细胞突起寿命分析
   1. 对于每个细胞和每个突起，测量突起持续时间（突起存在的帧数 × 帧间时间间隔）。
   2. 将数据导入 R。使用学生 t 检验（R 中的 t.test）比较不同条件。
      注意：为了表征细胞迁移，还可分析其他迁移特征，例如用于速度、方向和持续性测量的细胞轨迹，或细胞形态。目前已有若干商业软件可用于测量这些特征，但也有大量开源软件和 ImageJ 插件可供使用，例如 ADAPT 可用于分析形态动力学。¹²，使用 DiPer 分析细胞轨迹和方向持续性¹³，使用 CellTrack 在细胞迁移过程中追踪细胞边界¹⁴.

结果

所采用的技术用于分析Sin1（TORC2复合物的核心组分之一）在调控中的作用 体内 细胞迁移。细胞移植技术可用于标记分离的细胞，并分析细胞自主性效应。视频S1展示了移植的前脊索板前体细胞的迁移过程。使用ABP140标记肌动蛋白，可清晰显示富含肌动蛋白的细胞质突起。我们对其频率和方向进行了测量。野生型细胞会产生频繁且较大的细胞质突起，其方向朝向动物极。 即 迁移方向图3B）。Sin1功能的丧失会导致突起数量急剧减少，并使剩余突起的排列随机化，表明Sin1在该过程中具有重要作用 sin1 在调控富含肌动蛋白的突起形成方面。有趣的是，该表型可通过表达一种组成型活性形式的Rac1得以挽救¹⁵，强烈表明TorC2通过Rac1调控肌动蛋白动态和细胞突起形成（图3B).

该技术还被用于表征Arpin（一种新近发现的Arp2/...

讨论

本方案提供了一种简便的方法，用于研究候选基因在细胞迁移中的作用 体内通过结合细胞移植技术构建嵌合胚胎与活体成像方法。

嵌合胚胎的制备

研究细胞的动态过程需要对其轮廓进行可视化，以分析细胞质突起。这可以通过在未标记或不同标记的环境中对分离的细胞进行标记来实现，从而提供良好的视觉对比度。

一种在胚胎中随机标记部分细胞的简便方法是在1细胞期注射质粒DNA¹⁶。注射后的质粒会形成聚集体，在细胞分裂过程中随机且不均等地分配到子细胞中。这导致质粒仅在部分随机分布的细胞中表达，因此该方法是一种快速、简便且非侵入性的嵌合胚胎制备手段。然而，表达注射质粒的细胞往往形成簇状聚集，在预定的前脊索板区域中找到仅含少数孤立表达细胞的胚胎概率较低。此外，使用质粒DNA对所注射载体的表达水平调控能力非常有限。相比之下，通过细胞移植构建嵌合胚胎的方法虽然技术难度高于质粒DNA注射，但具有多项优势：可控制移植细胞的数量、可通过RNA注射调控载体的表达水平，最重要的是...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
玻璃毛细管（外径 1.0 mm，内径 0.58 mm）	Harvard Apparatus	300085	标准壁厚
玻璃毛细管（外径 1.0 mm，内径 0.78 mm）	Harvard Apparatus	300085	薄壁型
青霉素-链霉素	Sigma-Aldrich	P4333	每毫升含 10 000 单位青霉素和 10 mg 链霉素
精细镊子	Dumont Fine Science Tools	11254-20	5F
玻璃底培养皿	MatTek	P35G-0-10-C
空气注射仪	Eppendorf	5246
微电极拉制仪	Narishige	MF-900
微电极研磨仪	Narishige	EG-44
显微操作器（用于注射）	Narishige	MN-151
显微操作器（用于细胞移植）	Leica	Leica Micromanipulator
哈密尔顿注射器	Narishige	IM-9B
微电极拉制仪	David Kopf Instruments	Model 720
移植模具	Adapative Science Tools	PT-1
持针器	Narishige	HI-7
管路连接器	Narishige	CI-1
聚四氟乙烯管	Narishige	CT-1