的简化方法超低密度，长期主要海马神经元文化

摘要

原代海马神经元的低密度培养通常需要神经胶质饲养层来提供神经营养因子并维持长寿。我们在这里描述了一种在高密度神经元饲养层存在下在玻璃盖玻片上培养超低密度神经元的简化方法，这有助于研究特定的神经元自主机制。

摘要

在体外培养初级海马神经元促进了神经发育的许多方面机械审讯。解离的胚胎海马神经元通常可以成功地在玻璃盖玻片上以高密度生长在无血清条件下，但低密度培养物典型地需要通过营养因子的供给共培养它们与神经胶质饲养层，制备其中可费时又费力。此外，神经胶质细胞的存在可能混淆对神经元特异性的机制的结果和预先排除研究解释。在这里，一个简单的方法，提出了超低密度（〜2000元/厘米^2），长期（> 3个月）原海马神经元的文化，是无血清条件下，无胶质细胞的支持。低密度的神经元生长在聚-D-赖氨酸涂覆的盖玻片，并翻转在一个24孔板生长高密度的神经元。除了使用石蜡点来创造一个空间betwee的两个N神经细胞层，实验者可以简单地蚀刻井的底部塑料，对其中的高密度居住的神经元，创造一个有利于低密度神经生长微小空间。共培养可以很容易地维护> 3个月无低密度的神经元显著损失，从而促进这些神经元的形态和生理研究。为了说明这一点成功的培养条件下，提供的数据显示长期培养后满头突触形成的低密度细胞。此共培养体系还便于在聚-D-赖氨酸衬底并因此autaptic连接的形成的岛屿生长稀疏单个神经元的存活。

引言

在体外条件下生长的海马神经元能够观察和这些神经元是否则不可能在体内的实验操作。此实验方法被广泛地用于揭示增长，极性，轴突说明书中，贩卖和蛋白质的亚细胞定位，突触形成和功能成熟¹的神经元的机制。 这些体外培养海马神经元，从后期胚胎阶段时采收，是比较纯粹的金 ​​字塔形态²的（> 90％），谷氨酸能细胞。因为神经元中的2-D表面在体外条件下生长的，这种方法可以方便地观察，如实时成像或免疫细胞化学（ICC）通过单个焦平面³染色;或操作，比如药物治疗和转染^3-6。当高密度的增长，神经元往往因为较高的共同生存率高在除了消化道的支持从生长媒介和，也因为突起接触依赖性机制分泌⁷生长因子ncentrations。然而，低密度的海马神经元是可取的形态学研究，其中一个单独的神经元可在其全部被成像或染色的ICC分析。低密度的神经元是很难培养维持由于缺乏旁分泌的支持，因此往往需要从胶质（通常为皮质星形胶质细胞）饲养层，它具有神经元文化²之前做好准备营养支持。当共同培养与神经胶质细胞饲养层，低密度的神经元生长在盖玻片上，然后在神经胶质细胞层的顶部翻转，使得低密度的神经元和神经胶质彼此面对。是由放置在盖玻片的角落石蜡点，因此创造了"三明治"布局^2,8,9创建胶质细胞和神经元之间的一个小的密闭空间。低密度的神经元将增长W¯¯ithin胶....

方案

涉及小鼠所有的实验过程是由亚利桑那大学的机构动物护理和使用委员会批准，并符合美国国立卫生研究院的指导方针。

1，组织来源的海马神经元文化

1. 要生成海马神经元的文化产前的乳鼠，使用时间怀孕小鼠（C57BL6 / J）是在¹⁷家饲养。与阴道塞检测这一天被指定为E0.5。计划中的收获时间为文化E16.5-E17.5。
   注意:此协议描述了两个高密度的神经元与低密度神经元共培养两个24孔板的培养物（48盖玻片总数）。为多个板，原料和试剂可相应地缩放。

2. 24孔板制备高密度培养的神经元

注:胚胎的计划收获前执行以下步骤（2-3）的一天。

1. 把两个24以及板进入细胞培养罩，打开的单个包装。
2. 18G的注射器针头连接到1毫升的塑料单次使用的注射器。
3. 握住注射器，并瞄准左到井的底部的中心约1毫米的针尖。施加适度的力（〜250克），以蚀刻孔（约1毫米长）的底部。的槽将形成和塑料材料取代将形成升高的支撑平底孔表面的上方。蚀刻在约1毫米另一个〜1mm的长平行槽底部的以类似的方式的中心的右侧。
4. 重复此步骤的两个24孔板的所有孔中。用于高密度培养两个24孔板现在已准备好与聚D-赖氨酸（见下文步骤3.8）的涂层。

结果

这里所描述的协议使成功超低密度，纯谷氨酸能神经元的长期培养，而不需要作为饲养层胶质细胞。该协议可图示在图1中，其涉及制备高密度的（在聚D-赖氨酸包被的24孔）和低密度的神经元（在聚D-赖氨酸包被的玻璃盖玻片）分开，和随后的共培养，可以维持长达三个月。

图2A和2B是在铺板之后5天的高密度和低密度的神经元的插图。低密度文化约为30倍，密度较小。通过Kaech和银行家（2006年）所列出两个神经元发生的典型发展阶段。在第14天，无论是高密度和低密度的神经元显示精细树枝状结构，由DIC图像（ 图2C所揭示，D，注意两个面板从与不同的焦平面相同的字段，如由刻蚀的位置示出）。当这些神经元与MAP2抗体染色以显示树突，树突（ 叔 ₁₃ = 1.27.......

讨论

我们提出了无血清条件下的超低密度的海马谷氨酸能神经元的长期培养一个详细的协议。在〜2000个神经元/厘米^2，密度比具有或不具有通过现有的文献^2,3,11,13,14报道胶质支持最"低密度"培养制剂至少低两倍。除了作为超低密度，该协议是新颖的和在两个方式显著。第一，不需要胶质饲养层作为低密度的神经元得到从高密度的神经元是物理非常接近的范围内的营养因子的支持，即使没有突触连接，或在不同的密度培养的神经元之间的直接接触。这个协议消除了对未来的计划培养实验的制备胶质单层的需要，并且同时允许高密度和低密度培养物同时生长。神经胶质单层的制备可以是费时和​​Laborious，大部分文献使用的乳鼠小狗皮质^2。因此，对于只小鼠工作的实验室中，这需要显著作出更多努力。更重要的是，在神经元的特定的机制进行了研究实验中，在共培养的神经胶质细胞的存在可能是不希望的，因为它可以防止归咎于观察到的效果具体地神经元，神经胶质细胞或两种细胞类型¹⁰之间的相互作用。此外，对于胶质细胞培养，血清补充是强制性的^2,15，这可能污染胶质神经元共培养和引入额外的干扰因素.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Neurobasal培养基	Life Technologies	21103-049	避光
B27补充剂	Life Technologies	17504-044	等分试样，以0.6ml大小的
GlutaMAX-I	Life Technologies	35050-061	100X储存
抗生素-抗真菌剂 （AA）	Life Technologies	15240-096	稀释 100X
完全培养基			含 1X B27、1X AA、1X GlutaMAX-I
洗涤培养基			，与"Neurobasal 培养基"
补料			1X B27 添加剂
DNA 酶 I	Sigma-Aldrich	D5025	0.6 mg/ml
聚-D-赖氨酸	Sigma-Aldrich	P6407	M.W. 的 100X 储备液。70000-150000
硼酸盐缓冲液	Sigma-Aldrich	B6768（硼酸）;71997（硼砂）	1.24g 硼酸和 1.9g 硼砂溶于 400 ml H2O 中，pH 值为 8.5 使用 HCl
12 mm 圆形玻璃盖玻片	Glasswarenfabrik Karl Hecht GmbH	1001/12	No. 1 玻璃，购自 Carolina Biological Supply
proFection 转染试剂盒	Promega	E1200	有关详细信息
，请参阅  实验方案2X HEPES 缓冲盐水 （HBS）	Promega	E1200	有关详细信息，请参阅  实验方案
式过滤器	颇尔公司	4192	0.2 微米孔径
内切质粒制备试剂盒	Qiagen	12362	用于制备转染级质粒 DNA
抗 MAP2 抗体	Millipore	MAB3418	小鼠抗体，克隆 AP20
抗 p-Tau 抗体	Millipore	AB10417	兔多克隆抗体
抗 NR1 抗体	Millipore	MAB1586	小鼠抗体、克隆 R1JHL
抗 GluR1 抗体	Millipore	AB1504	兔多克隆抗体
Hank's 平衡盐溶液	ThermoFisher	14025092	500ml 大小