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方法文章

一种简化的大鼠原代海马神经元超低密度长期培养方法

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DOI：

10.3791/53797

⸱

2016年3月5日

 ,  , 
1Department of Basic Medical Sciences, University of Arizona College of Medicine-Phoenix, 2Jiangsu Provincial Center for Disease Control and Prevention

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

原代海马神经元的低密度培养通常需要胶质细胞饲养层来提供神经营养因子并维持其长期存活。本文介绍一种简化的方法，可在存在高密度神经元饲养层的情况下，在玻璃盖玻片上培养超低密度神经元，从而有利于研究特定的神经元自主机制。

摘要

原代海马神经元的培养 体外 有助于深入探究神经元发育的多种机制。在无血清条件下，解离的胚胎海马神经元通常能够在玻璃盖玻片上以高密度成功生长，但低密度培养通常需要通过与胶质细胞饲养层共培养来提供营养因子，而胶质饲养层的制备过程耗时且繁琐。此外，胶质细胞的存在可能干扰实验结果的解读，并阻碍对神经元特异性机制的研究。本文介绍一种简化的超低密度（约2,000个神经元/cm²）海马神经元培养方法，该方法无需胶质细胞饲养层，仅依赖于多聚-L-赖氨酸和层粘连蛋白对基底的双重包被，结合化学限定培养基的使用，可有效支持神经元的贴附、存活和轴突发育。此方法适用于需要明确排除胶质细胞影响的神经元发育、突触形成及轴突导向等研究。 关键词：神经元培养，海马神经元，超低密度，无胶质细胞，轴突发育，体外模型，神经发育，原代神经元2），长期（>3个月）的原代海马神经元培养，该培养在无血清条件且无胶质细胞支持下进行。低密度神经元培养于聚-D-赖氨酸包被的盖玻片上，随后翻转并置于24孔板中高密度神经元上。实验者无需使用石蜡点来在两层神经元之间制造间隙，而只需在高密度神经元所生长的孔底塑料表面进行刻蚀，以形成利于低密度神经元生长的微小空间。该共培养体系可轻松维持 >3个月内低密度神经元无明显丢失，从而有利于对这些神经元进行形态学和生理学研究。为说明该培养条件的成功，本文提供了数据，显示低密度细胞在长期培养后形成大量突触。该共培养系统也有助于在聚-D-赖氨酸基质小岛上生长的稀疏单个神经元的存活，从而促进自突触连接的形成。

引言

在培养皿中培养海马体神经元 体外 条件使得这些原本无法观察和实验操控的神经元得以被观测和实验干预 体内该实验方法被广泛用于揭示神经元的生长、极性、神经突起特化、蛋白质运输与亚细胞定位、突触形成以及功能成熟等神经机制。1。这些 体外 培养的海马神经元，若取自晚期胚胎阶段，则纯度相对较高（>90%）具有锥体形态的谷氨酸能细胞2由于神经元是在二维表面培养的 体外 在这些条件下，该方法可通过单一焦平面实现便捷的观察，例如活体成像或免疫细胞化学（ICC）染色3；或操作，如药物处理和转染3-6当在高密度下培养时，神经元存活率往往较高，这不仅由于培养基中分泌的生长因子浓度更高以及培养基提供的营养支持，还因为神经突触接触依赖性机制的作用。7然而，形态学研究需要低密度的海马神经元，以便对单个神经元进行完整成像或进行免疫细胞化学分析。由于缺乏旁分泌支持，低密度神经元在培养中难以维持，因此通常需要预先制备胶质细胞（通常是皮层星形胶质细胞）饲养层提供营养支持2当与胶质细胞饲养层共培养时，将低密度神经元接种于盖玻片上，随后将盖玻片翻转置于胶质细胞层上方，使低密度神经元与胶质细胞相对。通过在盖玻片的四角放置石蜡油滴，在神经元与胶质细胞之间形成一个狭小的封闭空间，从而构建出“三明治”结构。2,8,9低密度神经元将在胶质细胞与盖玻片之间的受限空间内生长，从而形成一种允许性微环境，其中富含神经元和胶质细胞分泌的高浓度因子。该方法可获得密度较低、发育完全且分布间距合理的神经元，有利于免疫细胞化学标记或活细胞成像研究。

除了耗时且费力之外，神经元-胶质细胞共培养的一个明显缺点是无法研究神经元特异性或细胞自主性机制。尽管该系统远比 体内 神经组织中，胶质细胞通过分泌尚未完全明确的因子影响神经元发育，可能干扰实验结果10因此，在需要研究神经元特异性机制的实验中，必须采用无血清且无胶质细胞支持层的明确培养条件。先前一项研究已成功实现了低浓度神经元（约9,000个细胞/cm²）的培养2) 使用三维水凝胶基质11由于在无血清且无胶质细胞支持的条件下，能够以较高密度培养出相对纯化的神经元群体，我们推测，通过将极低密度的海马神经元与高密度神经元共培养，类似于常规的神经元-胶质细胞共培养方式，可在无血清定义培养基中成功培养极低密度的海马神经元。事实上，近期已有研究采用“三明治”式高密度海马神经元培养体系，用于支持少量特化的 magnocellular 内分泌神经元的生长。12.

因此，高密度神经元的共培养可能使低密度神经元获得足够的神经营养因子支持，从而实现长期存活。基于此，本研究建立并验证了一种超低密度神经元培养方案。该方案可在单次实验中完成：首先制备高密度（约250,000个细胞/mL）的离体海马神经元，随后进行稀释，获得约10,000个神经元/mL的密度（即每张盖玻片约3,000个神经元，或约2,000个神经元/cm2），远低于大多数文献报道的低密度培养条件2,3,9,11,13。此类培养条件通常被称为“超低密度”培养，且与“低密度”培养可互换使用。高密度神经元接种于多聚-D-赖氨酸包被的24孔板中，而低密度神经元则接种于多聚-D-赖氨酸包被的12 mm玻璃盖玻片上，再将盖玻片置于另一块24孔板内。待神经元沉降并贴附于盖玻片约2小时后，将附有低密度神经元的盖玻片翻转，放置于高密度神经元上方。此外，不同于使用石蜡微点将盖玻片抬高以避免接触高密度神经元层，本方法采用18号注射器针头在24孔板底部刻出两条平行划痕，利用由此产生的相邻塑料隆起结构支撑玻璃盖玻片。该间隙高度稳定，测量值为150–200 μm，既能保证充足的氧气和培养基交换，又可形成富含神经营养因子的微环境。在此条件下，低密度神经元可广泛生长，并在体外存活超过三个月。当这些神经元在培养三周后转染GFP质粒时，其树突上可观察到大量树突棘。作为原理验证，本文展示了相关数据，表明该共培养系统支持接种于多聚-D-赖氨酸“微岛”上的海马神经元进行超低密度培养，神经元可在微岛上形成自突触连接，从而有助于研究细胞自主性、独立于神经网络的分子机制。

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方案

所有涉及小鼠的实验程序均经亚利桑那大学机构动物护理和使用委员会批准，并符合美国国立卫生研究院（NIH）指南。

1. 海马神经元培养的组织来源

  1. 为获得用于海马神经元培养的产前小鼠幼崽，使用本实验室饲养的孕鼠（C57Bl6/J）17。以检测到阴道栓的当天定为E0.5。计划用于培养的取材时间为E16.5–E17.5。
    注意：本方案描述的是两块24孔板的培养，每块板包含高密度神经元与低密度神经元共培养（共48个盖玻片）。如需增加培养板数，可相应扩大材料与试剂用量。

2. 高密度神经元培养用24孔板的制备

注意：在计划收获胚胎的前一天执行以下步骤（2-3）。

  1. 将两个24孔板带入细胞培养超净台中，打开各自的包装。
  2. 将一支18 G的注射针头连接到1 ml塑料一次性注射器上。
  3. 握住注射器，将针尖对准孔底中心左侧约1 mm处。施加适度的力（约250 g），在孔底划出一条长约1 mm的刻痕。刻痕处会形成凹槽，被移位的塑料材料将在平坦的孔底表面形成一个隆起的支撑结构。以类似方式，在孔底中心右侧约1 mm处再刻一条长约1 mm的平行凹槽。
  4. 对两个24孔板的所有孔重复此步骤。用于高密度培养的这两个24孔板现已准备好进行聚-D-赖氨酸包被（见下文步骤3.8）。

3. 低密度神经元培养用盖玻片的制备

  1. 使用直径为 12 mm 的 #1 圆形玻璃盖玻片。
  2. 将 50 个盖玻片放入一个直径为 100 mm 的无菌塑料培养皿中，加入 20 ml 70% 乙醇溶液完全浸没盖玻片。将该培养皿置于旋转平台上，以中等速度（70 rpm）旋转 1 小时。弃去 70% 乙醇，更换为新鲜的 70% 乙醇，再继续旋转清洗 1 小时。
  3. 弃去 70% 乙醇清洗液，加入经 0.2 µm 滤器过滤的无菌水。用手轻轻旋转培养皿，充分冲洗盖玻片。重复冲洗三次，每次均更换新鲜的无菌水。
  4. 将装有盖玻片的培养皿放入具有层流的无菌细胞培养操作台中。通过真空管线吸除冲洗用水，然后加入 10 ml 过滤后的无菌水以浸没盖玻片。此时盖玻片应达到无菌状态，且表面清洁，适合进行多聚赖氨酸（poly-D-lysine）包被。
  5. 打开两个 24 孔板的独立包装，将其放入操作台内。
  6. 开启操作台内的真空管线。将一个 200 µl 移液枪头连接至真空管线，并用剪刀剪去枪头尖端以形成较大的开口。
  7. 使用细尖 #5 镊子从培养皿中逐个夹取盖玻片，利用真空管线将盖玻片彻底吹干，然后将每个盖玻片放入 24 孔板的各个孔中。50 个清洗后的盖玻片应足以填满两个 24 孔板的所有孔。
  8. 用硼酸盐缓冲液（pH 8.5）将多聚赖氨酸原液（1 mg/ml）稀释成工作液（0.1 mg/ml）。针对四个 24 孔板（包括两个带刻蚀底部的高密度孔板），共需配制 30 ml 工作液。
  9. 向每个含有玻璃盖玻片的孔中加入 300 µl 0.1 mg/ml 的多聚赖氨酸工作液。确保盖玻片完全浸没在溶液中。若未完全浸没，可用 #5 镊子轻压盖玻片使其贴紧孔底，并用枪头引导多聚赖氨酸溶液覆盖盖玻片的整个表面。逐个目视检查所有孔，确保盖玻片与孔底之间无气泡残留。
  10. 向带刻蚀底部的高密度培养板的每个孔中加入 300 µl 0.1 mg/ml 多聚赖氨酸工作液。用手轻轻旋转孔板，使溶液均匀铺展，覆盖孔底的整个表面。
  11. 将四个含多聚赖氨酸的孔板全部放回细胞培养孵箱中，过夜孵育（O/N）。

4. 培养用板的洗涤与预处理

注意：以下步骤（4-9）在组织收获当天进行。

  1. 在盖玻片和24孔板过夜孵育/包被后，将全部四个板（两个含供体盖玻片，两个为带有蚀刻塑料底的受体高密度板）移入细胞培养操作台。使用真空管线吸除聚-D-赖氨酸溶液。
  2. 在去除聚-D-赖氨酸溶液后，立即使用塑料移液管向每孔加入约1 ml无菌水。待所有孔均加满水后，静置10分钟。通过真空吸除水分，然后向每孔加入300 µl洗涤培养基，以覆盖孔底（无论是否含有玻璃盖玻片）。注意避免聚-D-赖氨酸包被层干燥。
  3. 将全部四个板放回细胞培养箱。待分散的海马神经元制备完成后，即可使用这些板。

5. 完全培养基和用于酶消化的胰蛋白酶溶液的制备

  1. 通过混合各组分（见材料）配制60 ml完全培养基。使用连接有0.2 µm孔径滤器的50 ml注射器，将完全培养基过滤至两个50 ml锥形管中，每管含30 ml完全培养基。
  2. 在另一个50 ml锥形管中加入约30 ml洗涤液（见材料），并预热至37 °C，用于酶消化后组织的洗涤。
  3. 配制酶消化液。在15 ml锥形管中加入4.5 ml洗涤液、0.5 ml 2.5%胰蛋白酶溶液和50 µl 100倍浓度的DNase I。
  4. 将完全培养基、洗涤液和酶消化液置于37 °C水浴中预热。

6. 外科手术器械的准备

  1. 将所有手术器械（两把小剪刀、一把镊子和两把#5镊子）放入灭菌袋中进行灭菌。

7. E16.5-E17.5 小鼠胚胎脑组织的取出及海马体解剖

  1. 准备两个10 cm的培养皿，内装冰冷的无菌Hank's平衡盐溶液（HBSS）。
  2. 通过腹腔注射戊巴比妥钠（剂量为100 mg/kg，体积约为0.5 ml）处死母鼠。注射后，待母鼠对脚趾夹捏无反应时，采用颈椎脱位法处死。
  3. 用70%乙醇喷洒母鼠腹部区域，并沿腹部中线做一条长约2 cm的切口，暴露子宫。
  4. 取出胚胎，将每个胚胎单独放入一个直径为10 cm的培养皿中，置于冰冷的解剖用HBSS缓冲液中。
  5. 用镊子夹住胚胎颈部，使用小型剪刀在小脑水平以下的中线处进行第一次切割，并横切脑组织。注意不要将胚胎头部完全剪下。
    1. 将小型剪刀的右侧尖端从尾侧已切开的区域插入，一直穿过胚胎脑的头侧部分（不要越过中线），然后在颅底水平的左侧进行切割。
    2. 再次将剪刀的左侧尖端插入，在右侧进行切割。在头端保留一条狭窄的未切割颅骨和皮肤组织，以便将整个脑组织翻转至一侧，便于取出。
    3. 使用剪刀尖端将胚胎脑舀出并放入HBSS溶液中。在解剖显微镜下检查脑组织，应保持完整，无明显缺损区域。
    4. 重复上述步骤，收集所有胚胎的脑组织。
  6. 将所有完整的脑组织收集到一个新的含有20 ml冰冷HBSS缓冲液的培养皿中，并将培养皿置于解剖显微镜下。
  7. 从腹侧观察脑组织。用镊子固定脑组织的尾端，将一把尖头#5镊子斜向插入头侧中点与尾侧颞区之间进行切割。另一侧半球重复此操作。切割后，将两个含有完整海马体的半球与其余脑干组织分离。
    1. 对每一份脑组织重复此操作。
  8. 合并所有分离出的脑半球，使用两对#5镊子去除脑膜。
  9. 识别发育中的海马体，其为位于颞叶内部折叠的弯曲结构。交替使用两对镊子将海马体从邻近的皮层组织中分离。收集并合并所有海马体组织（见图1）。

8. 酶消化法分离为单个神经元

  1. 使用塑料移液管将所有分离的海马体转移至含有5 ml洗涤液（含0.25%胰蛋白酶和1×DNA酶I）的15 ml锥形管中。
  2. 将锥形管置于水浴中，在37 °C孵育25分钟，每隔5分钟轻轻翻转管子一次。
  3. 25分钟后，用手持塑料移液管小心吸除酶溶液。加入温热的洗涤液至10 ml，缓慢翻转管子5次以轻轻洗涤组织。吸除洗涤液后，再次加入10 ml洗涤液进行第二次洗涤。
  4. 吸除洗涤液，再加入3 ml新鲜温热的洗涤液。用手剧烈振荡管子15次，使消化后的神经元从组织中解离。当细胞从组织中分离进入洗涤液时，液体应变得浑浊。将细胞悬液收集至新的15 ml锥形管中，留下未解离的组织在原管内。
  5. 向残留组织中再加入2 ml洗涤液，用塑料移液管反复吹打约15次以进一步分离组织。静置5分钟。将所得细胞悬液合并至已收集“振落”细胞的新15 ml锥形管中。
  6. 使用血细胞计数板测定神经元密度。通常每微升可获得3,000–5,000个细胞，具体数量取决于所分离胚胎的数目。若以分离6个胚胎计算，预计可获得约2.5 × 107个神经元。
  7. 计算所需细胞悬液体积，使其加入30 ml完全培养基后达到250,000个神经元/ml的密度。将该体积的细胞悬液加入含有30 ml完全培养基的两个锥形管之一，制备高密度神经元接种培养基。
  8. 取1.2 ml上述高密度神经元溶液，转移至另一份30 ml完全培养基中，使终浓度约为10,000个神经元/ml。使用此稀释液接种低密度盖玻片。

9. 神经元的铺板与长期共培养

  1. 将两块带刻蚀底部的24孔板（用于高密度神经元培养）放入细胞培养操作台。用真空泵吸除每孔300 µl预培养培养基。每孔接种0.6 ml浓度为250,000个神经元/ml的高密度细胞悬液。
  2. 将另外两个含有盖玻片的24孔板移入培养罩内，用真空泵吸除每孔中的300 µl预处理培养基。在两个24孔板的盖玻片上，分别接种0.6 ml密度为10,000个神经元/ml的低密度细胞悬液。
  3. 将全部四个24孔板放回培养箱，静置2小时。
  4. 将贴附有神经元的低密度盖玻片翻转至高密度培养物上，确保神经元相对生长（即，未被玻璃盖玻片隔开）。然后将共培养的两块培养板放回培养箱中。

10. 共培养维持

  1. 通过在第天加入 300 µl 新鲜培养基（参见材料）喂养共培养物 体外 （DIV）5。与其他许多研究报道不同，无需移除50%的原始完全培养基。换液用培养基中还含有15 µM 阿糖胞苷（Ara-C，终浓度为5 µM），以尽量减少胶质细胞污染和增殖的可能性。
  2. 初次喂养后，每周向孔中加入 300 µl 新鲜 Feed 培养基，无需添加 Ara-C。若培养时间超过一个月，则从一个月时间点起每周更换一半培养基为新鲜 Feed 培养基（首次半量换液时间为 DIV33）。形态学上，高密度和低密度神经元在三个月内均保持健康状态（此为实验人员观察到的最长时间）。

11. 实验操作示例——低密度神经元转染

注意：当需要转染低密度神经元时，可采用简单的磷酸钙法。我们发现，在DIV12之前，低密度培养物使用磷酸钙法的转染效率较高；但在DIV21或更晚阶段（此时树突棘已明显形成），转染效率显著降低。通过使用pEGFP-C3质粒转染神经元（见下文），可证明培养的低密度神经元进行转染的可行性。

  1. 在 DIV21 时，从共培养的每个孔中移除 600 µl 条件培养基，并将其转移至新的 24 孔板中。然后向共培养孔中加入 600 µl 新鲜的 Feed 培养基，使其恢复至原始体积。
    1. 将盖玻片转移至含有 600 µl 条件培养基的新 24 孔板中，确保低密度神经元朝上。将高密度培养板以及含有盖玻片的新板放回培养箱中。
  2. 准备两个 1.5 ml 无菌离心管。在一个管中加入 600 µl 2X HEPES 缓冲盐溶液（HBS）。根据质粒浓度计算 12 µg pEGFP-C3 DNA 所需体积。在另一管中加入 74 µl CaCl2（2 M 储液），并加入适量去离子水，使加入质粒后总体积达到 600 µl。用移液器充分混匀，然后加入质粒 DNA，缓慢混匀。将两管室温静置 5 分钟。
  3. 手持 2X HBS 管并在振荡器上适度振荡的同时，将全部 600 µl DNA-CaCl2 溶液逐滴加入 600 µl 2X HBS 管中。形成的沉淀必须呈“细沙”状颗粒。避免剧烈或过快混合，否则容易产生较大的“雪花”状沉淀，据我们观察，这会显著降低转染效率。
  4. 将沉淀在室温避光条件下继续形成 30 分钟。
  5. 将 100 µl 沉淀液逐滴且均匀地加入每孔含有盖玻片上低密度神经元的孔中。将培养板放回培养箱，孵育 2 小时。假设大部分 CaCl2 处于游离状态，此时 Ca2+ 浓度约为 17.6 mM，长时间孵育可能对神经元具有毒性。
  6. 准备一个 50 mL 锥形管，加入约 50 ml Wash 培养基，并将其预热至 37 °C。
  7. 2 小时结束后，将含有 DNA-磷酸钙沉淀的低密度神经元盖玻片移入超净台。用尖头 #5 镊子夹起每一片盖玻片，在 50 ml Wash 培养基中轻轻浸洗三次。然后将其放回原始共培养板中的高密度神经元上，确保低密度神经元朝下。
  8. 继续培养，直至盖玻片上的低密度神经元可用于后续实验取材。

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结果

本方案可实现纯谷氨酸能神经元的超低密度、长期培养，无需胶质细胞作为饲养层。该方案如图1所示，包括分别制备高密度神经元（接种于多聚-D-赖氨酸包被的24孔板）和低密度神经元（接种于多聚-D-赖氨酸包被的玻璃盖玻片），随后进行共培养，培养时间可维持长达三个月。

图2A和2B展示了铺板后5天的高密度和低密度神经元的示意图。低密度培养的密度约为高密度的三十分之一。两种神经元均经历了Kaech和Banker（2006）所描述的典型发育阶段。在第14天，高密度和低密度神经元均表现出复杂的树突结构，微分干涉差（DIC）图像显示了这一点（图2C、D，注意两个图来自同一视野但焦平面不同，蚀刻位置可证明）。当这些神经元用MAP2抗体染色以显示树突时，高密度与低密度神经元之间在每神经元的树突数量（t13

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讨论

本文介绍了一种在无血清条件下长期培养超低密度海马谷氨酸能神经元的详细方案。培养密度约为2000个神经元/cm2，至少比现有文献中报道的大多数有或无胶质细胞支持的“低密度”培养体系低两倍以上2,3,11,13,14。除了超低密度外，本方案还在另外两个方面具有新颖性和重要意义。首先，无需使用胶质细胞饲养层，因为低密度神经元可通过邻近的高密度神经元获得营养因子支持，尽管在不同密度下培养的神经元之间并无突触连接或直接接触。该方案消除了在计划培养实验前预先制备胶质细胞单层的需要，使高密度和低密度培养可同时进行。制备胶质细胞单层既耗时又费力，且大多数文献使用新生大鼠脑皮层组织2，因此对于仅使用小鼠的研究实验室而言，这需要额外的大量工作。更重要的是，在研究神经元特异性机制的实验中，共培养体系中存在胶质细胞可能是不利的，因为它阻碍了将观察到的效应明确归因于神经元、胶质细胞或两者之间的相互作用10。此外，胶质细胞培养必须添加血清补充物2,15，这可能污染胶质细胞-神经元共培养体系并引入额外的混杂因素。本方案的一个重要特点是共培养体系处于成分明确的...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本研究得到了美国国立卫生研究院/国家精神卫生研究所向 S.Q. 提供的资助（R00MH087628）。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
Neurobasal 培养基Life Technologies21103-049避光保存
B27添加剂Life Technologies17504-044分装，以0.6 ml规格保存
GlutaMAX-ILife Technologies35050-061稀释100倍 
抗生素-抗真菌剂（AA）Life Technologies15240-096稀释100倍 
完全培养基含1X B27、1X AA、1X GlutaMAX-I的Neurobasal培养基
洗涤液与“Neurobasal培养基”相同
培养基Neurobasal 培养基添加 1X B27 补充剂
DNA酶ISigma-AldrichD5025配制 0.6 mg/ml 的 100 倍浓缩储备液
poly-D-lysineSigma-AldrichP6407分子量 70000-150000
硼酸盐缓冲液Sigma-AldrichB6768（硼酸）；71997（硼砂）1.24 g 硼酸 & 1.9 g 硼砂溶于 400 ml H2O 中，用 HCl 调 pH 至 8.5
12毫米圆形玻璃盖玻片Glasswarenfabrik Karl Hecht GmbH1001/12No. 1 玻片，购自 Carolina Biological Supply
proFection 转染试剂盒PromegaE1200见  详见实验方案
2X HEPES 缓冲盐水（HBS）PromegaE1200见  详见实验方案
注射器滤器Pall Corporation41920.2微米孔径
内毒素去除质粒提取试剂盒Qiagen12362用于制备转染级质粒DNA
抗MAP2抗体MilliporeMAB3418小鼠抗体，克隆 AP20
抗p-Tau抗体MilliporeAB10417兔多克隆抗体
抗NR1抗体MilliporeMAB1586小鼠抗体，克隆 R1JHL
抗GluR1抗体MilliporeAB1504兔多克隆抗体
Hank's 平衡盐溶液ThermoFisher14025092500 ml 规格

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一种简化的大鼠原代海马神经元超低密度长期培养方法
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