靶向显微注射技术用于发育中的 非洲爪蟾 肾脏

摘要

本文介绍了一种利用命运图和谱系示踪技术，将注射靶向至个体卵裂球的实验方案，这些卵裂球将发育为非洲爪蟾（Xenopus laevis）胚胎的肾脏。

摘要

Xenopus laevis（青蛙）的胚胎肾脏（前肾）仅包含一个肾单位，可作为肾脏疾病的研究模型。Xenopus 胚胎体积较大，体外发育，易于通过显微注射或手术操作进行处理。此外，早期Xenopus 胚胎的命运图谱已建立清楚。通过将显微注射靶向定位于最终将发育成特定器官或组织的单个卵裂球，可在该限定区域内选择性地过表达或敲低基因表达，从而减少对胚胎其他部位的继发性影响。在本实验方案中，我们描述了如何利用已建立的Xenopus 发育命运图谱，通过对4细胞期和8细胞期胚胎的特定卵裂球进行显微注射，靶向发育中的Xenopus 肾脏（前肾）。注射谱系示踪剂可用于验证注射定位的特异性。待胚胎发育至38–40期后，采用整体免疫染色法观察前肾的发育情况，并评估靶向细胞对前肾的贡献。该技术也可经调整后用于靶向除前肾以外的其他组织类型。

引言

Xenopus 胚胎肾脏（前肾）是研究肾脏发育与疾病的理想模型。该胚胎在体外发育，体型较大，可大量获得，并可通过显微注射或手术操作进行简便的实验处理。此外，调控哺乳动物和两栖类动物肾脏发育的基因具有高度保守性。哺乳动物的肾脏发育经历三个阶段：前肾、中肾和后肾¹，而两栖类胚胎具有前肾，成体则具有后肾。这些肾脏结构的基本滤过单位均为肾单位（nephron），且哺乳动物和两栖类动物在肾单位形成过程中均依赖相同的信号通路和诱导事件^{2, 3}。Xenopus 前肾包含一个单一的肾单位，由近端小管、中间小管、远端小管和连接小管组成，并 含有一个肾小球样结构——肾小球体（glomus，相当于哺乳动物的肾小球）^{1, 4-6}（图1）。由于Xenopus 前肾仅含有一个大型肾单位，因此非常适合作为研究参与肾脏发育及疾病过程相关基因的简化模型。

早期Xenopus胚胎的细胞命运图谱已经建立，并可在Xenbase网站上免费获取^7-11。本文介绍一种显微注射谱系示踪剂以靶向发育中Xenopus前肾的技术，尽管该技术也可调整用于靶向其他组织，如心脏或眼睛。谱系示踪剂是一类可注射至早期卵裂球中的标记物（包括活体染料、荧光标记的葡聚糖、组织化学可检测的酶以及编码荧光蛋白的mRNA），可用于在发育过程中追踪该细胞的后代。本实验方案采用编码膜定位红色荧光蛋白的MEM-RFP mRNA¹²作为谱系示踪剂。本文所述的在4细胞期和8细胞期胚胎中对单个卵裂球进行靶向显微注射的技术，可用于注射吗啉代寡核苷酸以敲低基因表达，或注射外源RNA以过表达目标基因。通过向腹侧植物极卵裂球注射，主要可靶向前肾，而对侧前肾则作为发育对照。共注射示踪剂可验证是否正确注射了目标卵裂球，并显示胚胎中哪些组织来源于该注射卵裂球，从而确认前肾的靶向性。对前肾进行免疫染色可观察前肾小管的靶向效果。随后可在胚胎对侧（作为发育对照）评估过表达或敲低效应，并用于计算前肾指数¹³。由于细胞命运图谱的可用性，该靶向显微注射技术也可用于靶向前肾以外的其他组织，而共注射荧光示踪剂可在分析前验证每种组织的靶向准确性。

在胚胎显微注射过程中，应严格调控发育温度，因为发育速率 非洲爪蟾 发育在很大程度上依赖于它¹⁴胚胎在进行4细胞期和8细胞期显微注射时，应于较低温度（14–16 °C）下培养，以减缓其发育速度。在22 °C条件下，胚胎从1细胞期（阶段1）发育至4细胞期（阶段3）约需2小时，而在16 °C时则需约4小时。在22 °C下，胚胎从4细胞期发育至8细胞期（阶段4）约需15分钟，而在16 °C时则需约30分钟。同样，在22 °C下，8细胞期胚胎发育至16细胞期（阶段5）仅需30分钟，而在16 °C时则延长至45分钟。因此，降低培养温度以减缓胚胎发育速度，有助于在胚胎进入16细胞期之前，为完成8细胞期的显微注射提供充足的操作时间。此外，可通过调节培养温度以加快或减缓胚胎发育进程，直至肾脏完全发育。

Xenopus 胚胎在蝌蚪阶段的表皮相对透明，无需解剖或组织透明化处理即可方便地对发育中的前肾进行成像¹⁵。由于 Xenopus 胚胎具有相对透明的特性，活细胞成像也是可行的^16,17。利用已建立的抗体对38至40期胚胎的近端小管、中间小管、远端小管和连接小管进行整体免疫染色，可实现前肾的可视化，从而在对 Xenopus 胚胎基因表达进行靶向调控后评估前肾的发育情况^18-20。

方案

以下方案已获得休斯顿德克萨斯大学健康科学中心实验室动物医学动物福利委员会（作为机构动物照护与使用委员会）的批准（方案编号：HSC-AWC-13-135）。

1. 用于肾脏靶向注射的卵裂球鉴定与筛选 

1. 在生成胚胎之前，使用正常发育表 非洲爪蟾 发育²¹ 以了解胚胎早期细胞分裂的方向。或者，获取胚胎早期发育阶段的示意图 非洲爪蟾 在 Xenbase 上¹¹.
2. 访问交互式内容 非洲爪蟾 Xenbase 上的细胞命运图谱¹¹ 选择将要进行显微注射的卵裂球。
3. 观察到单细胞胚胎具有深色素的动物极和白色、富含卵黄的植物极。注意，胚胎表面覆盖有一层保护性膜，称为卵黄膜。
4. 注意，第一次卵裂通常发生在胚胎的左侧与右侧之间。这些细胞对前肾谱系的贡献相等。
5. 请注意，第二次卵裂将胚胎的背侧和腹侧分开，形成4细胞胚胎。背侧细胞比腹侧细胞更小，色素也更少（图2A 和 图3A).
   1. 识别左右两侧的腹侧卵裂球（V；较大、较暗的细胞），其对发育中肾脏的贡献大于背侧（D；较小、较亮的细胞）卵裂球图2A).
   2. 若向四细胞期胚胎注射，应注射左侧腹侧卵裂球以靶向左侧肾脏图3A 以及第3节）。
6. 第三次卵裂将动物极和植物极两侧均分，形成一个八细胞胚胎。此时，有四个动物极卵裂球［腹侧左、右（V1）和背侧左、右（D1）］和四个植物极卵裂球［腹侧左、右（V2）和背侧左、右（D2）］（图2B 和 图3B).
   1. 定位腹侧植物极卵裂球（V2）。在此发育阶段，这些卵裂球对肾脏发育的贡献超过其他任何细胞。图2B）。为了靶向8细胞胚胎的左侧肾脏，需向左侧V2卵裂球注射（图 3B 以及第3节。
7. 注意，第四次和第五次卵裂将动物极和植物极的卵裂球均等分割。每个卵裂球产生两个子代细胞，形成16细胞期胚胎。细胞以其前体细胞命名。例如，8细胞期的V2卵裂球在16细胞期产生V2.1和V2.2子代细胞（图 2C在16细胞期，V2.2细胞提供了发育中肾脏的大部分细胞。
8. 注意，第六次和第七次卵裂产生32细胞期胚胎。此时，每个卵裂球再次分裂生成两个子代细胞，其命名沿用前体细胞的名称。例如，16细胞期的V2.2卵裂球在32细胞期产生V2.2.1和V2.2.2两个子细胞。在32细胞期还存在另一种命名系统，即细胞按四行（A、B、C、D，从动物极到植物极）和四列（1、2、3、4，从背侧到腹侧）进行标识。因此，贡献最大的V2.2.2卵裂球可相应地表示为 发育中的前肾，按此替代命名系统称为C3（图 2D).

2. 胚胎的制备

1. 配制50 ml去胶溶液（2%半胱氨酸，用NaOH调至pH 8.0）。
2. 根据标准方案，从一只雄性青蛙中分离出两侧睾丸¹⁴将睾丸置于一个盛有10 ml睾丸储存液（1×Marc's改良林格液[MMR；0.1 M NaCl，2 mM KCl，1 mM MgSO₄₄，2 mM CaCl₂，5 mM HEPES（pH 8），0.1 mM EDTA¹²，1% 牛血清白蛋白，50 µg/ml 庆大霉素）。将睾丸组织在 4 °C 下保存。
   注意：睾丸可在 4 °C 下保存约 7–10 天，但保存时间越长，受精效率越低。
3. 根据标准方案挤压雌性青蛙以获取卵子¹⁴在100 mm培养皿中收集卵，倒去多余的水分。
4. 使用镊子和剃须刀片在睾丸保存液中切下睾丸的¼部分。将睾丸组织碎片转移至含有卵子的培养皿中。根据睾丸大小、保存时间以及待受精卵子的数量调整所用睾丸组织的量。通常情况下，使用新鲜解剖获得的睾丸的¼至1/3部分来受精一批卵子。
5. 用镊子和剃刀将睾丸组织切成小块。加入足量的0.3x 在培养皿中加入 MMR 和 30 mg/ml 庆大霉素，以覆盖卵块。轻轻晃动培养皿，使 MMR 混匀。
6. 等待约30分钟，使受精在室温下完成。注意，有效受精后，胚胎的动物极（即胚胎的有色一侧）将位于胚胎顶端。随后，使用移液管从培养皿中移除MMR。向培养皿中加入足量的脱胶液，以完全覆盖胚胎。
7. 在接下来的几分钟内，间歇性地轻轻晃动培养皿。此时剧烈震荡可能导致轴发育缺陷。 胚胎外的胶状包膜将溶解，胚胎在轻轻晃动培养皿时会聚集到皿的中央。当胚胎紧密聚集在培养皿中央并相互接触时，用移液器吸除脱胶液。胚胎在脱胶液中停留时间不得超过5分钟，否则可能导致胚胎损伤。
8. 用0.3x MMR + 30 mg/ml庆大霉素将去胶膜胚胎清洗3至5次，操作时小心倾倒或用移液器吸除MMR，并向培养皿中加入新的MMR。切勿将培养皿中的MMR完全移除，以免损伤胚胎。
9. 使用移液管从培养皿中移除未受精的卵子或睾丸组织碎片。
10. 在14至22°C条件下孵育胚胎。
    注意：在较低温度下培养的胚胎比在较高温度下培养的胚胎发育更慢。发育阶段的时间信息可在Xenbase上获取。²².
    1. 为使胚胎发育时间错开，将同一次受精产生的半数胚胎置于保持在 14 °C 的培养皿中，另一半胚胎置于保持在 18 °C 的培养皿中。这样可从同一次受精获得两批可在 4 细胞期或 8 细胞期进行显微注射的胚胎。

3. 注射溶液的制备与胚胎显微注射

1. 在胚胎发育至4细胞或8细胞阶段时，配制含有0.01 ng/nl膜结合型红色荧光蛋白（MEM-RFP）mRNA⁹ 的注射溶液。将注射溶液置于冰上保存，直至准备进行注射。
2. 将一根7"替换用玻璃毛细管装入拉针仪中，使替换管顶部与拉针仪外壳顶部对齐。将加热参数#2设为800，拉力参数设为650。按下"拉针"按钮进行拉针。一次可从单根7"玻璃毛细管拉制出两根针尖。
3. 使用Dumont镊子剪断拉制好的针尖末端。
   注意：拉针完成后，针尖处于封闭状态，必须剪开。剪切位置越接近针尖，针尖开口直径越小。尽管在此所用显微注射系统中针尖直径不会影响注射体积，但直径较大的针尖更易损伤胚胎。
4. 将微量移液器卡套套入针的后部。接着，将大孔O型圈套在卡套后方的针体上。
5. 使用27号皮下注射针头将矿物油注入针内，注意避免产生气泡。
6. 将针插入显微注射仪推杆上，使针嵌入安装在推杆上的白色塑料垫片的大孔中。推杆上从靠近注射仪本体开始依次应为：小O型圈、白色垫片、大孔O型圈和卡套。通过拧紧卡套固定针头。轻轻拉扯针头，确认其已牢固固定。
7. 按住显微注射仪控制盒上的"排空"按钮，直至听到两声蜂鸣。
8. 用移液器将3 µl 注射溶液滴加到一片Parafilm上。将针尖插入Parafilm上的液滴中。按住显微注射仪控制盒上的"填充"按钮，将注射溶液吸入针内。
9. 准备一个60 mm培养皿，底部铺有500微米聚酯网膜，并加入含5% Ficoll的0.3x MMR溶液 + 30 mg/ml庆大霉素。小心地将20–30个4细胞或8细胞期胚胎移入该培养皿中。
10. 使用毛发环¹⁴调整胚胎位置，使待注射的卵裂球朝向针尖。若需靶向左侧肾脏，应将4细胞期胚胎的左腹侧卵裂球或8细胞期胚胎的左V2卵裂球对准针尖。
11. 向培养皿中每个胚胎的选定卵裂球内注射10 nl注射溶液。
    注意：培养皿底部的网膜可稳定胚胎，防止其滚动，因此无需使用毛发环进行固定即可完成注射。
12. 将已注射的胚胎转移至已加入含5% Ficoll的0.3x MMR溶液 + 30 mg/ml庆大霉素的培养板孔中。于16 °C孵育至少一小时，使注射后的卵裂球得以修复。
13. 在发育至第9期（原肠胚形成前），将已修复的胚胎转移至新培养板的孔中，新孔内应预先加入0.3x MMR溶液 + 30 mg/ml庆大霉素。
14. 于14–22 °C孵育胚胎，直至其发育至第38–40期²¹。

4. 胚胎的固定与免疫染色

1. 配制 50 ml MOPS/EGTA/硫酸镁/甲醛缓冲液（MEMFA：100 mM MOPS（pH 7.4）、2 mM EGTA、1 mM MgSO₄、3.7%（v/v）甲醛）。
2. 使用移液管将 10–20 个 38–40 期的胚胎转移至玻璃小瓶中。向小瓶中加入 10 µl 5% 苯佐卡因溶于 100% 乙醇的溶液，倒置小瓶以混匀。静置 10 分钟以麻醉胚胎。
3. 用玻璃移液管吸除小瓶中的 MMR 溶液。若同时处理多个小瓶，可将小瓶垂直放置于 24 孔细胞培养板中固定。
4. 用玻璃移液管向小瓶中加入 MEMFA 缓冲液。将小瓶置于三维摇床上，室温孵育 1 小时。
5. 用玻璃移液管吸除小瓶中的 MEMFA 缓冲液，加入 100% 甲醇。将小瓶置于三维摇床上，室温孵育 10 分钟。重复此洗涤步骤一次，随后将胚胎在 -20 °C 条件下于 100% 甲醇中过夜保存。
6. 配制 1× 磷酸盐缓冲液-牛血清白蛋白-吐温（PBT）：1× PBS、2 mg/ml 牛血清白蛋白、0.1% Triton X-100。
7. 配制一抗溶液：在 1× PBT 中加入 10% 山羊血清，并分别按 1:5 稀释小鼠单克隆抗体 4A6（用于标记中间小管、远端小管和连接小管的细胞膜²⁰）、1:30 稀释小鼠单克隆抗体 3G8（用于标记近端小管管腔²⁰），以及 1:250 稀释兔多克隆 RFP 抗体（用于标记 MEM-RFP 示踪剂）。4 °C 保存。
8. 配制二抗溶液：在 1× PBT 中加入 10% 山羊血清、1:500 稀释 Alexa 488 标记的山羊抗小鼠 IgG（储存浓度 2 mg/ml；用于标记 4A6 和 3G8 抗体）以及 1:500 稀释 Alexa 555 标记的山羊抗兔 IgG（储存浓度 2 mg/ml；用于标记 MEM-RFP 示踪剂）。4 °C 保存，并用铝箔包裹管子以避光。
9. 可选：在染色后回收一抗和二抗溶液，加入 0.01% 叠氮化钠，4 °C 保存以供后续实验重复使用。
10. 按照既定实验方案对胚胎进行免疫染色¹⁸。

5. 胚胎的可视化及靶向前肾组织的分析 

1. 在荧光体视显微镜下以1倍放大倍数（用于观察整个胚胎）和5倍放大倍数（用于观察肾脏）观察示踪剂的荧光，筛选免疫染色的胚胎，以确认正确的目标卵裂球已被注射。使用剪去尖端的移液管将胚胎转移至多孔玻璃培养板中，各孔内预先加入1× PBT。用毛发环操作胚胎。仅选用左侧胚胎前肾中存在共注射示踪剂的胚胎（图3C、F 和 图4C、F），用于基因过表达或敲降分析。
2. 或者，可将胚胎置于Murray透明液（2份苯甲酸苄酯∶1份苯甲醇）中进行透明处理：将胚胎放入玻璃小瓶，并用Murray透明液充满小瓶。使用玻璃凹板观察胚胎。
   注意：Murray透明液为有机溶剂，操作时应小心。需佩戴手套，且仅可使用玻璃小瓶和移液管接触Murray透明液。
3. 将胚胎在1× PBT中于4 °C保存2至3周。如需长期保存胚胎，可在室温下用100%甲醇洗涤两次，每次10分钟，进行脱水处理，随后将胚胎在-20 °C下保存于100%甲醇中。

结果

对4细胞期和8细胞期的Xenopus胚胎进行MEM-RFP mRNA显微注射，结果显示其在前肾中的靶向程度存在差异。图4展示了发育至40期、具有正确MEM-RFP mRNA表达模式的胚胎。胚胎在左侧腹侧卵裂球处注射（图4A），并根据MEM-RFP mRNA的正确表达模式进行筛选。除了在肾脏的近端小管、中间小管、远端小管和连接小管中表达MEM-RFP外，注射正确的胚胎还应在头部、躯干和尾部的表皮中观察到荧光。此外，还应在听囊、胶腺、肛孔和体节中观察到荧光（图4C）。使用荧光体视显微镜检测了8个正确注射胚胎肾脏中MEM-RFP荧光的分布情况（图4B）。若胚胎表皮中MEM-RFP表达水平过高，导致肾脏区域无法观察，则记为“遮蔽”（occluded）。在所有未被记为“遮蔽”的胚胎中，均检测到MEM-RFP在近端小管、中间小管、远端小管和连接小管中的表达。通过体视显微镜（图4D-F）和共聚焦显微镜...

讨论

靶向发育中的前肾 非洲爪蟾 胚胎操作的关键在于识别并注射正确的卵裂球。在8细胞期胚胎中，对V2卵裂球进行注射可靶向左侧前肾¹⁸这使得对侧的右侧前肾作为内部对照。如果使用吗啉代敲低或RNA过表达来改变肾脏发育，可利用对侧右侧前肾与左侧前肾在基因敲低或过表达下的效应进行比较。在此情况下，除对侧内部对照外，还应使用适当的对照，如错配对照吗啉代或显性负性RNA构建体，以分析基因表达改变的结果。由于胚胎相对透明的特性 非洲爪蟾 胚胎中肾脏缺陷可通过多种技术轻松量化。例如，通过计算经3G8抗体免疫染色胚胎的前肾指数，可简便地对基因敲低或过表达进行定量分析。¹³，通过比较胚胎注射侧与对照侧近端小管的发育情况进行分析。除了研究前肾的发育外，该技术还可通过参考已建立的命运图谱，选择适当的卵裂球进行显微注射，从而便捷地调整用于其他组织的研究。^7-10除了靶向其他组织类型外，该方案还可用于研究不同发育阶段的肾脏发育。本方案针对的是经 3G8 和 4A6 抗体染色的 40 期胚胎，这两种抗体可识别已分化的肾组织。较早期的胚胎可用不同的肾组织抗体进行免疫染色，或...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氯化钠	Fisher	S271-3
氯化钾	Fisher	P217-500
硫酸镁	Fisher	M63-500
氯化钙	Fisher	C79-500
HEPES	Fisher	BP310-500
EDTA	Fisher	S311-500
庆大霉素溶液，50 mg/ml	Amresco	E737-20ML
L-半胱氨酸，99%以上	Acros Organics	52-90-4
Ficoll	Fisher	BP525-100
100 mm × 15 mm 培养皿	Fisher	FB0875712
Mini Fridge II	Boekel	260009	用于胚胎的台式培养箱。
Gap43-RFP 质粒			用于制备示踪RNA。参考文献：Davidson et al., 2006。
罗丹明葡聚糖，分子量10,000	Invitrogen	D1817	示踪剂。
分子生物学级，USP无菌纯化水	Corning	46-000-CI
7" Drummond 替换管	Drummond	3-000-203-G/XL	显微注射针头。
拉针仪	Sutter Instruments	P-30
精细镊子	Dumont	11252-30	用于打断显微注射针尖。
Nanoject II	Drummond	3-000-204	显微注射仪。
矿物油，重质	Fisher	CAS 8042-47-5	用于针头的油。
27 G Monoject 皮下注射针头	Covidien	8881200508	用于将矿物油装入显微注射针头。
5 ml 鲁尔锁注射器	BD	309646	用于将矿物油装入显微注射针头。
60 mm × 15 mm 培养皿	Fisher	FB0875713A
800 微米聚酯网	Small Parts	CMY-0800-C
移液管	Fisher	13-711-7M	用于转移胚胎。剪去管尖，以便胚胎更容易被吸入移液管。
6孔细胞培养板	Nest Biotechnology
MOPS	Fisher	BP308-500
EGTA	Acros Organics	67-42-5
甲醛	Fisher	BP531-500
15 mm × 45 mm 螺纹小瓶	Fisher	03-339-25B	用于胚胎的固定、染色和储存。
24孔细胞培养板	Nest Biotechnology
苯佐卡因	Spectrum	BE130
乙醇	Fisher	BP2818-4
甲醇	Fisher	A412-4
磷酸盐缓冲液（PBS）1×粉末	Fisher	BP661-50
牛血清白蛋白	Fisher	BP1600-100
吐温X-100	Fisher	BP151-500
3D迷你摇床，型号135	Denville Scientific	57281
山羊血清，新西兰来源	Invitrogen	16210064
叠氮化钠	Fisher	S227I-25
单克隆3G8抗体	欧洲爪蟾资源中心		用于标记近端小管的一抗。
单克隆4A6抗体	欧洲爪蟾资源中心		用于标记中间段、远端和连接小管的一抗。
抗RFP多克隆抗体，纯化IgG/兔源	MBL	PM005	用于标记Gap43-RFP示踪剂的一抗。
Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠IgG	Life Technologies	A11001	用于标记肾小管的二抗。
Alexa Fluor 555 山羊抗兔IgG	Life Technologies	A21428	用于标记Gap43-RFP示踪剂的二抗。
9孔点样板	Corning	7220-85
苯甲酸苄酯	Fisher	105862500	可选——用于透明化胚胎
苯甲醇	Fisher	A396-500	可选——用于透明化胚胎