靶向显微注射技术用于发育中的 非洲爪蟾 肾脏

摘要

本文介绍了一种利用命运图和谱系示踪技术，将注射靶向至个体卵裂球的实验方案，这些卵裂球将发育为非洲爪蟾（Xenopus laevis）胚胎的肾脏。

摘要

Xenopus laevis（青蛙）的胚胎肾脏（前肾）仅包含一个肾单位，可作为肾脏疾病的研究模型。Xenopus 胚胎体积较大，体外发育，易于通过显微注射或手术操作进行处理。此外，早期Xenopus 胚胎的命运图谱已建立清楚。通过将显微注射靶向定位于最终将发育成特定器官或组织的单个卵裂球，可在该限定区域内选择性地过表达或敲低基因表达，从而减少对胚胎其他部位的继发性影响。在本实验方案中，我们描述了如何利用已建立的Xenopus 发育命运图谱，通过对4细胞期和8细胞期胚胎的特定卵裂球进行显微注射，靶向发育中的Xenopus 肾脏（前肾）。注射谱系示踪剂可用于验证注射定位的特异性。待胚胎发育至38–40期后，采用整体免疫染色法观察前肾的发育情况，并评估靶向细胞对前肾的贡献。该技术也可经调整后用于靶向除前肾以外的其他组织类型。

引言

Xenopus 胚胎肾脏（前肾）是研究肾脏发育与疾病的理想模型。该胚胎在体外发育，体型较大，可大量获得，并可通过显微注射或手术操作进行简便的实验处理。此外，调控哺乳动物和两栖类动物肾脏发育的基因具有高度保守性。哺乳动物的肾脏发育经历三个阶段：前肾、中肾和后肾¹，而两栖类胚胎具有前肾，成体则具有后肾。这些肾脏结构的基本滤过单位均为肾单位（nephron），且哺乳动物和两栖类动物在肾单位形成过程中均依赖相同的信号通路和诱导事件^{2, 3}。Xenopus 前肾包含一个单一的肾单位，由近端小管、中间小管、远端小管和连接小管组成，并 含有一个肾小球样结构——肾小球体（glomus，相当于哺乳动物的肾小球）^{1, 4-6}（图1）。由于Xenopus 前肾仅含有一个大型肾单位，因此非常适合作为研究参与肾脏发育及疾病过程相关基因的简化模型。

早期Xenopus胚胎的细胞命运图谱已经建立，并可在Xenbase网站上免费获取^7-11。本文介绍一种显微注射谱系示踪剂以靶向发育中Xenopus前肾的技术，尽管该技术也可调整用于靶向其他组织，如心脏或眼睛。谱系示踪剂是一类可注射至早期卵裂球中的标记物（包括活体染料、荧光标记的葡聚糖、组织化学可检测的酶以及编码荧光蛋白的mRNA），可用于在....

方案

以下方案已获得休斯顿德克萨斯大学健康科学中心实验室动物医学动物福利委员会（作为机构动物照护与使用委员会）的批准（方案编号：HSC-AWC-13-135）。

1. 用于肾脏靶向注射的卵裂球鉴定与筛选 

1. 在生成胚胎之前，使用正常发育表 非洲爪蟾 发育²¹ 以了解胚胎早期细胞分裂的方向。或者，获取胚胎早期发育阶段的示意图 非洲爪蟾 在 Xenbase 上¹¹.
2. 访问交互式内容 非洲爪蟾 Xenbase 上的细胞命运图谱¹¹ 选择将要进行显微注射的卵裂球。
3. 观察到单细胞胚胎具有深色素的动物极和白色、富含卵黄的植物极。注意，胚胎表面覆盖有一层保护性膜，称为卵黄膜。
4. 注意，第一次卵裂通常发生在胚胎的左侧与右侧之间。这些细胞对前肾谱系的贡献相等。
5. 请注意，第二次卵裂将胚胎的背侧和腹侧分开，形成4细胞胚胎。背侧细胞比腹侧细胞更小，色素也更少（图2A 和 图3A).
   1. 识别左右两侧的腹侧卵裂球（V；较大、较暗的细胞），其对发育中肾脏的贡献大于背侧（D；较小、较亮的细胞）卵裂球图2A).
   2. 若向四细胞期胚胎注射，应注射左侧腹侧卵裂球以靶向左侧肾脏图3A 以及第3节）....

结果

对4细胞期和8细胞期的Xenopus胚胎显微注射MEM-RFP mRNA，可观察到其在前肾中的靶向程度存在差异。图4展示了在发育至40期时具有正确MEM-RFP mRNA表达模式的胚胎。胚胎在左侧腹侧卵裂球处进行注射（图4A），并根据MEM-RFP mRNA的正确表达模式进行筛选。除在肾脏的近端小管、中间小管、远端小管和连接小管中表达MEM-RFP外，注射正确的胚胎还应在头部、躯干和尾部的表皮中观察到荧光。此外，还应观察到听囊、黏液腺、后肠和体节中的荧光信号（图4C）。使用荧光体视显微镜检测了8个注射正确胚胎肾脏中MEM-RFP荧光的分布情况（图4B）。若胚胎表皮中MEM-RFP表达水平过高，导致肾脏区域无法识别，则记为“遮蔽”（occluded）。在所有未被记为“遮蔽”的胚胎中，均检测到MEM-RFP在近端小管、中间小管、远端小管和连接小管中的表达。通过体视显微镜（图4D-F）和共聚焦.......

讨论

靶向发育中的前肾 非洲爪蟾 胚胎操作的关键在于识别并注射正确的卵裂球。在8细胞期胚胎中，对V2卵裂球进行注射可靶向左侧前肾¹⁸这使得对侧的右侧前肾作为内部对照。如果使用吗啉代敲低或RNA过表达来改变肾脏发育，可利用对侧右侧前肾与左侧前肾在基因敲低或过表达下的效应进行比较。在此情况下，除对侧内部对照外，还应使用适当的对照，如错配对照吗啉代或显性负性RNA构建体，以分析基因表达改变的结果。由于胚胎相对透明的特性 非洲爪蟾 胚胎中肾脏缺陷可通过多种技术轻松量化。例如，通过计算经3G8抗体免疫染色胚胎的前肾指数，可简便地对基因敲低或过表达进行定量分析。¹³，通过比较胚胎注射侧与对照侧近端小管的发育情况进行分析。除了研究前肾的发育外，该技术还可通过参考已建立的命运图谱，选择适当的卵裂球进行显微注射，从而便捷地调整用于其他组织的研究。^7-10除了靶向其他组织类型外，该方案还可用于研究不同发育阶段的肾脏发育。本方案针对的是经 3G8 和 4A6 抗体染色的 40 期胚胎，这两种抗体可识别已分化的肾组织。较早期的胚胎可用不同的肾组织抗体进行免疫染色，或.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
氯化钠	Fisher	S271-3
氯化钾	Fisher	P217-500
硫酸镁	Fisher	M63-500
氯化钙	Fisher	C79-500
HEPES	Fisher	BP310-500
EDTA	Fisher	S311-500
庆大霉素溶液，50 mg/ml	Amresco	E737-20ML
L-半胱氨酸，99%以上	Acros Organics	52-90-4
Ficoll	Fisher	BP525-100
100 mm × 15 mm 培养皿	Fisher	FB0875712
Mini Fridge II	Boekel	260009	用于胚胎的台式培养箱。
Gap43-RFP 质粒			用于制备示踪RNA。参考文献：Davidson et al., 2006。
罗丹明葡聚糖，分子量10,000	Invitrogen	D1817	示踪剂。
分子生物学级，USP无菌纯化水	Corning	46-000-CI
7" Drummond 替换管	Drummond	3-000-203-G/XL	显微注射针头。
拉针仪	Sutter Instruments	P-30
精细镊子	Dumont	11252-30	用于打断显微注射针尖。
Nanoject II	Drummond	3-000-204	显微注射仪。
矿物油，重质	Fisher	CAS 8042-47-5	用于针头的油。
27 G Monoject 皮下注射针头	Covidien	8881200508	用于将矿物油装入显微注射针头。
5 ml 鲁尔锁注射器	BD	309646	用于将矿物油装入显微注射针头。
60 mm × 15 mm 培养皿	Fisher	FB0875713A
800 微米聚酯网	Small Parts	CMY-0800-C
移液管	Fisher	13-711-7M	用于转移胚胎。剪去管尖，以便胚胎更容易被吸入移液管。
6孔细胞培养板	Nest Biotechnology
MOPS	Fisher	BP308-500
EGTA	Acros Organics	67-42-5
甲醛	Fisher	BP531-500
15 mm × 45 mm 螺纹小瓶	Fisher	03-339-25B	用于胚胎的固定、染色和储存。
24孔细胞培养板	Nest Biotechnology
苯佐卡因	Spectrum	BE130
乙醇	Fisher	BP2818-4
甲醇	Fisher	A412-4
磷酸盐缓冲液（PBS）1×粉末	Fisher	BP661-50
牛血清白蛋白	Fisher	BP1600-100
吐温X-100	Fisher	BP151-500
3D迷你摇床，型号135	Denville Scientific	57281
山羊血清，新西兰来源	Invitrogen	16210064
叠氮化钠	Fisher	S227I-25
单克隆3G8抗体	欧洲爪蟾资源中心		用于标记近端小管的一抗。
单克隆4A6抗体	欧洲爪蟾资源中心		用于标记中间段、远端和连接小管的一抗。
抗RFP多克隆抗体，纯化IgG/兔源	MBL	PM005	用于标记Gap43-RFP示踪剂的一抗。
Alexa Fluor 488 山羊抗小鼠IgG	Life Technologies	A11001	用于标记肾小管的二抗。
Alexa Fluor 555 山羊抗兔IgG	Life Technologies	A21428	用于标记Gap43-RFP示踪剂的二抗。
9孔点样板	Corning	7220-85
苯甲酸苄酯	Fisher	105862500	可选——用于透明化胚胎
苯甲醇	Fisher	A396-500	可选——用于透明化胚胎