我们提供了一种可重复的基本方法，用于裂殖酵母有性生命周期的长期显微观察。通过文中所述的少量调整，该方案可使研究聚焦于生殖过程的不同阶段。
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本文内容
摘要
摘要
裂殖酵母 Schizosaccharomyces pombe 是研究有丝分裂细胞周期调控、细胞分裂机制以及细胞极性的重要模式系统。此外，关于其有性生殖的经典实验为当前对DNA重组和减数分裂的理解提供了关键性成果。近年来对裂殖酵母交配过程的研究，进一步提出了有关外界刺激响应机制、极性细胞生长以及细胞-细胞融合的有趣问题。为了深入研究这些课题，我们开发了一种简便的显微镜观察整个有性生命周期的实验方案。本文所述方法可轻松调整以研究特定的交配阶段。简言之，将细胞在富氮培养基中培养至对数生长期后，转移至无氮培养基中，饥饿处理一定时间，以诱导进入所需研究的有性生命周期阶段。随后将细胞置于自行制备、易于构建的琼脂糖垫片腔室上进行成像观察。该方法可实现从交配起始直至孢子最终形成全过程的持续监测。
引言
尽管细胞间的基因交换是生殖过程中的核心事件，但它依赖于一系列促进细胞分化、实现伴侣选择、完成细胞间融合并维持基因组稳定性的事件。因此，有性生命周期为研究诸多生物学问题提供了一个理想的模型系统，这些问题包括发育转换、对外源刺激的响应、质膜融合以及染色体分离等。 等等。 利用裂殖酵母的有性周期研究这些现象，可借助该模式系统强大的遗传学工具、成熟的高通量研究方法以及先进的显微镜技术。裂殖酵母的有性生殖是一种异型事件，发生在具有不同交配类型的P细胞和M细胞之间。这两种细胞类型差异性地表达多种基因。1,2 包括分泌型P因子和M因子的合成相关基因、信息素受体Map3和Mam2，以及信息素蛋白酶Sxa1和Sxa2。同宗配合菌株，例如常用的 h90 菌株，在单个基因组中携带两种交配型的遗传信息，细胞在有丝分裂生命周期中经历复杂的交配型转换模式（详见参考文献）。3). 也常使用多种几乎从不或完全不发生交配型转换的异宗分裂酵母分离株4，最显著的是 h+ N （P型）和 h- （M型）菌株。
在裂殖酵母中，进入有性生命周期受到严格的营养调控。只有在缺乏氮源的条件下，裂殖酵母细胞才会停止有丝分裂繁殖，并产生可扩散的信息素，以信号传递方式感知交配伴侣的存在，并促进有性周期的后续步骤（参见....
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方案
裂殖酵母有性生殖的显微镜分析
1. 培养基制备
- 通过混合以下组分制备最低孢子形成培养基（MSL-N）15：葡萄糖：10 g/L，KH2PO4：1 g/L，NaCl：0.1 g/L，MgSO4·7H2O：0.2 g/L。添加微量元素（10,000倍浓缩液）：100 µl/L，维生素（1,000倍浓缩液）：1 ml/L，以及 0.1 M CaCl2 ml/L。使用孔径为 0.22 μm 的滤器过滤灭菌，并在室温（RT）下保存。
- 使用以下维生素（1,000倍浓缩液）储备液：泛酸：1 g/L，烟酸：10 g/L，肌醇：10 g/L，生物素：10 mg/L。使用孔径为 0.22 μm 的滤器过滤灭菌，并在 4 °C 下保存。
- 使用以下微量元素（10,000倍浓缩液）储备液：硼酸：5 g/L，MnSO4：4 g/L，ZnSO4·7H2O：4 g/L，FeCl2·6H2O：2 g/L，MoO3：0.4 g/L，KI：1 g/L，CuSO4·5H2O：0.4 g/L，柠檬酸：10 g/L。使用孔径为 0.22 μm 的滤器过滤灭菌，并在 4....
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结果
移除氮源后裂殖酵母的生长与交配动态
由于氮源饥饿是裂殖酵母启动有性生殖的前提条件，因此按照图1所述方案，监测野生型同宗配合h90菌株从含氮丰富的培养基转移至无氮培养基后的变化（图2）。简言之，细胞在MSL+N培养基中过夜培养至对数生长期（O.D.600 = 0.5），收集后洗涤，并重悬于MSL-N液体培养基中，使终浓度O.D.600 = 1.5。每隔2小时取样，用calcofluor染色并进行成像（图2A-D）。
Calcofluor 染色（图 2A）显示，在富氮培养基中，约有 21% 的细胞正在进行分裂（n >300，图 2B），分裂时的平均细胞长度为 15.2 ± 1.4 .......
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讨论
环境条件，尤其是营养物质的可利用性，会显著影响裂殖酵母的生理状态。氮源饥饿是启动有性生殖所必需的条件，最初会导致有丝分裂细胞周期进程发生显著变化（参考文献21和图2）。当从指数生长期的细胞群体中去除氮源后，细胞分裂时的大小迅速减小（图2C），大多数细胞在有丝分裂进程中的停滞长度短于新出生的指数生长期细胞（参考文献21和图2D）。当交配型相反的细胞停滞于有丝分裂阶段时，它们会寻找交配伙伴并进一步形成合子并进行孢子形成（图2B、2E、2F）。在野生型细胞形成的二维单层培养中，超过百分之六十的h90细胞会成功配对，几乎全部细胞都会发生细胞融合（图2G）。在异宗配合菌株混合培养中，交配效率略低，并依赖于细胞密度及其相对位置（图2G）。为获得高交配效率，本实验方案中最关键的环节之一是确保细胞在整个过程中维持在指定的密度范围内。如图2所示，通过监测细胞大.......
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披露
作者声明不存在任何竞争性经济利益。
致谢
AV 获得了欧洲分子生物学组织（EMBO）长期博士后奖学金的支持。Martin 实验室的研究工作由 SGM 获得的欧洲研究委员会（ERC）启动基金（GeometryCellCycle）和瑞士国家科学基金会基金（31003A_155944）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 葡萄糖 | Sigma-Aldrich | G8270-10KG | |
| KH2PO4 | Sigma-Aldrich | 1.05108.0050 | |
| NaCl | Sigma-Aldrich | 71381 | |
| MgSO4•7H2O | Sigma-Aldrich | 63140 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | 12095 | |
| 泛酸盐 | AppliChem | A2088,0025 | |
| 烟酸 | AppliChem | A0963,0100 | |
| 肌醇 | AppliChem | A1716,0100 | |
| 生物素 | AppliChem | A0967,0250 | |
| 硼酸 | Sigma-Aldrich | B6768-1KG | |
| MnSO4 | AppliChem | A1038,0250 | |
| ZnSO4•7H2O | Sigma-Aldrich | Z4750 | |
| FeCl2•6H2O | AppliChem | A3514,0250 | |
| 三氧化钼(VI) (MoO3) | Sigma-Aldrich | 69850 | |
| KI | AppliChem | A3872,0100 | |
| CuSO4•5H2O | AppliChem | A1034,0500 | |
| 柠檬酸 | AppliChem | A2344,0500 | |
| 琼脂糖 | Promega | V3125 | |
| (NH4)2SO4 | Merck | 1.01217.1000 | |
| L-亮氨酸 | Sigma-Aldrich | L8000-100G | |
| 腺嘌呤半硫酸盐，微量 99% | Sigma-Aldrich | A9126-100G | |
| 尿嘧啶 | Sigma-Aldrich | U0750 | |
| 羊毛脂 | Sigma-Aldrich | L7387 | |
| 凡士林 | Reactolab | 92045-74-4 | |
| 石蜡 | Reactolab | 7005600 |
参考文献
- Mata, J., Bahler, J. Global roles of Ste11p, cell type, and pheromone in the control of gene expression during early sexual differentiation in fission yeast. Proc Natl Acad Sci U S A. 103 (42), 15517-15522 (2006).
- Xue-Franzen, Y., Kjaerulff, S., Holmberg, C., Wright, A., Nielsen, O.
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重印与许可
