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在不含金属纳米颗粒的情况下将细胞色素 c 封装于二氧化硅气凝胶纳米结构中并保持其气相生物活性

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DOI：

10.3791/53802

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2016年3月1日

 ,  , 
1Department of Chemistry & Biochemistry, Fairfield University

本文内容

摘要

本实验方法描述了如何将细胞色素c（cyt. c）包埋于二氧化硅（SiO2）溶胶-凝胶中，进一步将这些凝胶加工成生物气凝胶，并利用这些生物气凝胶通过气相反应快速识别一氧化氮（NO）。此类实验方案可能有助于未来生物传感器或其他生物分析装置的开发。

摘要

在传感器、电池和燃料电池等应用中，通过将功能化合物包封于高度多孔的气凝胶内，可显著提升其性能。然而，关于将蛋白质包封于经处理形成气凝胶的溶胶-凝胶体系中的研究报道较少。本文介绍了一种将细胞色素c（cyt. c）包封于二氧化硅（SiO2）溶胶-凝胶中，并通过超临界处理制备具有气相一氧化氮（NO）活性的生物气凝胶的方法。在控制蛋白质浓度和缓冲液强度的条件下，将cyt. c加入混合硅溶胶中。随后使溶胶发生凝胶化，并通过一系列与液态二氧化碳的溶剂置换，替换凝胶孔道中的液体。将二氧化碳升至临界点后排出，从而获得包封有cyt. c的干燥气凝胶。这些生物气凝胶通过紫外-可见光谱和圆二色光谱进行表征，可用于检测气相一氧化氮的存在。该方法的成功关键在于调控cyt. c的浓度和缓冲液浓度，无需引入金属纳米颗粒等其他组分。类似策略可能适用于包封其他蛋白质，因此该方法对未来生物分析器件的开发具有重要意义。

引言

细胞色素 c （细胞质） c细胞色素c是一种参与机体细胞呼吸反应的关键电子传递蛋白。研究表明，它还参与细胞凋亡这一受控的细胞死亡过程，并能够检测一氧化氮和一氧化碳等微量有毒分子。1-3一氧化氮（NO）在神经系统、心血管系统和免疫系统的多种生理过程中发挥重要作用。尽管细胞色素 c 通常需要在pH中性的缓冲水环境中才能保持其结构完整性和活性，研究表明，细胞色素。 c 在特定条件下，可在称为气凝胶的固体材料中保持其结构与功能4-9.

气凝胶是一类高度多孔的材料，通常通过溶胶-凝胶法合成金属氧化物（尽管金属氧化物气凝胶非常常见，但已有碳基及其他类型气凝胶的合成报道，例如InP气凝胶）10，并以特定方式干燥这些溶胶-凝胶，使多孔固态基质保持不变11-14。固态气凝胶中的所有孔隙均使其具有极大的比表面积，因此在涉及表面反应的应用中极为有用。当在气凝胶的纳米结构中引入化学或生物化学功能时，研究表明，气凝胶的物理孔隙率和增大的比表面积有助于提升传感器性能，以及用于电池、燃料电池和超级电容器应用的电极性能11,15-23。为了在干燥过程中保持多孔固态基质不变，通常采用超临界溶剂萃取法去除溶胶-凝胶合成后残留在孔隙中的溶剂。由于在超临界干燥过程中不会形成液-气界面，因此可最大限度地减少溶剂从凝胶中蒸发时表面张力所可能导致的孔结构塌陷。

已有许多关于细胞色素等血红素蛋白的报道。 c 被包埋在保持湿润或在常温下干燥的溶胶-凝胶中24-30将生物分子包埋于溶胶-凝胶中，随后通过超临界干燥形成气凝胶的报道较为罕见，原因是必要的加工过程可能对许多蛋白质的结构造成不利影响。以细胞色素c为例。 c，某些条件使得细胞色素c保持其功能成为可能。 c 在气凝胶中检测并响应气态一氧化氮。一旦在气凝胶中稳定存在，气凝胶的高质量孔隙结构即可促进细胞色素c与一氧化氮之间的反应。 c 和一氧化氮4,8,9. 细胞质 c 可通过将目标物质首先在溶液中与金或银纳米颗粒表面形成多层结合，进而包封于气凝胶中4-8这些多层超结构可保护气凝胶基质中的蛋白质。在我们最新开发的方法中，通过控制蛋白质浓度和缓冲液强度以及其他合成条件，细胞色素 c 即使在没有金属纳米颗粒初始结合的情况下，仍能在气凝胶中保持完整性9.

合成过程的初始步骤与许多气凝胶的合成方法类似，即先将硅溶胶-凝胶前驱体混合一定时间。在完成设定的混合时间后，将细胞色素 c 以缓冲溶液的形式加入混合物中。随后发生凝胶化反应，形成多孔的二氧化硅固体结构，其孔隙中充满水、甲醇、未反应的反应物以及副产物。这些孔隙中的液体可通过一系列溶剂置换步骤，用不同溶剂冲洗除去，最后在低温条件下于临界点干燥装置中使用液态二氧化碳进行置换。当将凝胶加热至二氧化碳的临界温度以上（31.1 °C）时，在加压装置内形成超临界流体，随后可通过排气得到干燥、高度多孔的气凝胶。与其他溶剂相比，二氧化碳形成超临界流体所需的温度相对较低，这一优势有助于使蛋白质保持在不会发生变性的温度以下。

我们采用无金属纳米颗粒的方法将细胞色素c包封于气凝胶中，具有显著优势，因为该方法操作简便，且可能为其他蛋白质的包封建立一种更具普适性的实验方案。许多蛋白质与金属纳米颗粒的相互作用方式可能不同于细胞色素c，而金属纳米颗粒的合成或购买还会增加实验的时间和成本。目前关于将蛋白质包封于气凝胶中的报道较少，因此本方法的建立是迈向开发适用于多种蛋白质气凝胶包封通用方案的重要一步，有望为未来潜在的生物分析装置提供支持。

本论文的实验方案部分概述了如何合成二氧化硅溶胶-凝胶，将细胞色素c包埋于这些溶胶-凝胶中，将这些复合溶胶-凝胶干燥以形成气凝胶，利用紫外-可见吸收光谱和圆二色光谱对这些生物气凝胶进行表征，并利用这些生物气凝胶检测气相中的一氧化氮。当细胞色素c首先溶解于4.4至70 mM的磷酸盐缓冲水溶液中时，已成功将其包埋于气凝胶中。然而，研究发现，当使用40 mM磷酸盐缓冲溶液的细胞色素c进行包埋时，所得气凝胶中的蛋白质结构最为理想，此时气凝胶中细胞色素c的负载浓度范围为5至15 μM9。因此，下述实验方案采用40 mM磷酸盐缓冲溶液的细胞色素c来合成气凝胶，最终在气凝胶中实现15 μM的细胞色素c负载浓度。

方案

实验过程中应始终佩戴护目镜或护目镜、实验服和实验室手套。严禁在未佩戴护目镜或护目镜的情况下操作临界点干燥仪。所有含有四甲氧基硅烷、甲醇、乙醇、丙酮和氨的溶液均应在通风橱内操作。

1. 配制缓冲液和细胞色素 c 溶液

  1. 配制约 750 ml pH 7、40 mM 的磷酸钾缓冲液时，首先使用 500 ml 容量瓶称取 2.72 g 磷酸二氢钾，溶于水，配制成 500 ml 0.04 M 的磷酸二氢钾溶液。
  2. 称取 3.48 g 磷酸氢二钾，使用 500 ml 容量瓶溶于水，配制成 500 ml 0.04 M 的磷酸氢二钾溶液。
  3. 将磷酸氢二钾溶液倒入带有搅拌子的大烧杯中，并在搅拌器上开始搅拌。
  4. 在 pH 电极和 pH 计监测下，缓慢将磷酸二氢钾溶液分批加入磷酸氢二钾溶液中，直至 pH 达到 7.00。此过程大约使用 250–300 ml 的磷酸二氢钾溶液。
  5. 称取约 0.023 g 细胞色素 c，置于玻璃闪烁瓶中。使用移液器加入 2,000 μl 已配制的磷酸钾缓冲液，轻轻旋转混匀，直至所有红色的细胞色素 c 固体完全溶解，溶液中无任何颗粒残留。
  6. 取 20 μl 已配制的细胞色素 c 溶液，加入一个光程为 1 cm 的塑料比色皿中，再加入 3 ml 已配制的缓冲液。
  7. 以缓冲液作为空白对照，测定 300–700 nm 范围内的紫外-可见吸收光谱。利用细胞色素 c 在 409 nm 处的吸光度（A）、文献值31的摩尔吸光系数（ε）106,100 M-1cm-1、比色皿光程（l）以及比尔-朗伯定律（A = εlc）计算溶液的浓度（c）。
  8. 反向计算原始配制溶液的浓度。通常，2 ml 配制的细胞色素 c 溶液浓度在 0.7 至 0.9 mM 之间。
  9. 将原始配制的细胞色素 c 溶液稀释至 800 μl 的 0.105 mM 浓度：用移液器取 117 μl 浓度为 0.72 mM 的细胞色素 c 溶液加入闪烁瓶中，再补加所需体积的缓冲液（本例中为 683 μl），使总体积达到 800 μl，轻轻旋转混匀。具体体积将根据原始细胞色素 c 溶液的实际浓度而变化，所需移取的细胞色素 c 体积计算公式为：(800 μl × 0.105 mM) /（原始细胞色素 c 溶液的 mM 浓度）。
  10. 将原始配制及稀释后的细胞色素 c 溶液储存于 2–8 °C 冰箱中，可保存至多两周，待用。

2. 合成二氧化硅（SiO2）溶胶

  1. 将一个一次性50 ml聚丙烯烧杯标记为“烧杯A”。将烧杯置于分析天平上，使用玻璃巴斯德移液管向烧杯中加入1.88 g四甲氧基硅烷。将天平归零，然后用移液管向“烧杯A”中加入2.88 g甲醇。
  2. 用封口膜覆盖“烧杯A”。
  3. 将另一个一次性50 ml聚丙烯烧杯标记为“烧杯B”。加入一个磁力搅拌子，并将其置于分析天平上。使用玻璃移液管加入0.75 g水和3.00 g甲醇。
  4. 用封口膜覆盖“烧杯B”。
  5. 在通风橱内的搅拌器上开始搅拌“烧杯B”中的内容物，然后使用注射器将5 μl浓度为28.0–30.0%的氨水溶液穿过封口膜注入混合物中，同时持续搅拌。
  6. 一旦步骤2.5完成，立即将“烧杯A”中的内容物加入“烧杯B”中。在封口膜覆盖下继续搅拌混合物20分钟。

3. 准备凝胶模具

注意：在步骤 2.6 中硅胶溶胶混合物搅拌的同时，可以准备凝胶模具。

  1. 取8-9个聚丙烯闪烁瓶（16 mm × 57 mm，体积6.5 ml，底部已切除）及相应的瓶盖。将塑料薄膜覆盖在瓶盖端，以形成供凝胶形成的平整表面，并将瓶盖盖在上面，确保塑料薄膜在瓶盖内保持完整。
  2. 将瓶盖朝下、开口底部朝上的闪烁瓶在实验台面上排成一行。

4. 制备细胞色素 c-二氧化硅溶胶-凝胶

  1. 完成溶胶混合（步骤 2.6）后，将 3 ml 溶胶混合物加入一个洁净的一次性 50 ml 聚丙烯烧杯中。
  2. 使用玻璃巴斯德吸管，在约 1 分钟内缓慢滴加 500 μl 浓度为 0.105 mM 的稀释细胞色素 c 溶液（在步骤 1.9 中制备）至 3 ml 溶胶混合物中。添加细胞色素 c 时应轻轻旋转混合，以避免形成大的红色团块。假设体积具有加和性，将 500 μl 的 0.105 mM 细胞色素 c 溶液稀释至 3,500 μl，理论上此时溶胶中的细胞色素 c 浓度为 15 μM。
  3. 将所得的细胞色素 c 硅溶胶各取 0.5 ml 加入每个已准备好的模具中。同时，将剩余的“纯”硅溶胶取 0.5 ml 加入一至两个模具中，作为超临界干燥过程中的对照样品。
  4. 用封口膜覆盖模具朝上的开口，置于冰箱（约 2–8 °C）中过夜或至少 12 小时，以形成溶胶-凝胶。
  5. 将模具从冰箱中取出。取下含有细胞色素 c 溶胶-凝胶的模具顶部的封口膜，同时移除底部的盖子和塑料包裹膜。
  6. 从冲洗瓶中加入一些乙醇至模具中，然后使用注射器推杆的圆形端小心地将凝胶推出模具，并转移至一个含有约 5 ml 乙醇的洁净 20 ml 玻璃闪烁瓶中。
  7. 重复此凝胶取出操作（步骤 4.5 和 4.6），直至所有细胞色素 c 凝胶均转移至该瓶中，且所有硅凝胶均转移至另一个独立的瓶子中。若制备了多种不同浓度的细胞色素 c 凝胶，请确保将相同类型的凝胶存放于各自的独立瓶子中。随后用乙醇加满各瓶子，盖紧并储存在 2–8 °C 条件下。
  8. 在白天每隔四小时，将凝胶从冰箱中取出，倾去乙醇，并更换为新鲜乙醇。
  9. 在接下来的额外三天内，将湿润的溶胶-凝胶浸入丙酮中，每天倾去并更换新鲜丙酮三次。

5. 超临界干燥细胞。c-二氧化硅溶胶-凝胶

  1. 通过将连接的循环器温度设置为 8 °C，使临界点干燥仪（见图 1）冷却至 10 °C。
  2. 当仪器温度达到 10 °C 后，将转移舟中装入丙酮并密封于仪器内，对仪器进行漏气检测。
    1. 打开仪器的填充阀，加入二氧化碳，直至仪器内填充至一半。
    2. 关闭填充阀，并仔细听门和阀门处是否有嘶嘶声，以判断O型圈或密封件是否老化。
    3. 若发现漏气，应更换相应的O型圈或密封件。
  3. 完成漏气检测后，打开排液阀，将丙酮和二氧化碳排入通风橱的排水口，然后从仪器中取出转移舟。
  4. 确认仪器无泄漏后，小心地将闪烁瓶中的湿凝胶连同大部分丙酮一起倒入转移舟的三个长槽中（无需使用样品篮或纱布罩）。用镊子在舟内轻柔地推动和调整凝胶位置，确保所有凝胶完全浸没在丙酮中。在将转移舟密封入仪器前，如有需要可补充更多丙酮。
  5. 打开仪器的填充阀以加入二氧化碳，当通过仪器观察窗看到丙酮与二氧化碳混合物开始沉降至仪器底部时，立即打开排液阀排放丙酮，持续五分钟。由于丙酮下沉现象会在仪器尚未完全充满二氧化碳时即发生，因此在排放过程中应保持填充阀适当开启，以确保即使排液阀打开时仪器仍能继续填充。
  6. 关闭排液阀，保持填充阀略微开启。
  7. 五分钟后，再次打开排液阀排放五分钟，并调节填充阀开度，使仪器在整个排放期间始终保持充满状态。关闭排液阀，保持填充阀略微开启，五分钟后重复此排放步骤一次。
  8. 完成上述前三次排放步骤后，在至少六小时内，每隔约 40 分钟打开排液阀排放 5 分钟，以确保凝胶内的丙酮被液态二氧化碳完全置换。每次排放过程中均需调节填充阀开度，确保仪器内液面在排放期间始终不低于转移舟尖端位置。
  9. 完成所有排放步骤后，关闭填充阀，并排出部分液态二氧化碳，通过观察窗观察，使液面刚好保持在转移舟尖端略上方的位置。
  10. 将仪器连接的循环器温度设置为 40 °C，确保液态二氧化碳升至其临界温度和压力以上（Tc = 31 °C；Pc = 7.4 MPa）。
  11. 约 15 分钟后，通过观察窗观察到转移舟尖端上方的液体弯月面消失，表明液体已转变为超临界流体。至少保持 15 分钟的平衡时间，然后轻微打开排气阀，开始释放超临界流体。
  12. 在约 45 分钟内，逐步逐渐增大排气阀开度，使释放的流体发出持续但非常微弱的嘶嘶声，同时观察压力表缓慢降至零。
  13. 当仪器压力降至零后，打开仪器门，取出转移舟，并用镊子将新干燥的气凝胶转移至洁净的玻璃闪烁瓶中。

6. 使用紫外-可见光谱和圆二色光谱（CD）表征细胞色素c-二氧化硅气凝胶

  1. 准备一个纸板平台，用于在紫外-可见分光光度计或圆二色光谱仪的光路中固定气凝胶整体材料。
    1. 剪下一小块2.5 cm × 2.5 cm的轻质纸板（例如实验室纸巾盒所用纸板），将其对折，在折痕处剪开一半，然后将剪出的两个翻盖向后折叠。
    2. 剪下一小块5 cm × 5 cm的轻质纸板，中间留出一个1.5 cm × 1.5 cm的正方形孔，然后使用黑色电工胶带将孔缩小至0.5 cm × 0.5 cm。
    3. 将折叠并剪裁后的纸板翻盖用胶带固定在5 cm × 5 cm的纸板上，使气凝胶整体材料可放置在一个小型弯曲表面上，并正对0.5 cm × 0.5 cm的孔（见图2）。然后将该纸板用胶带固定在紫外-可见分光光度计上，使孔与光路对齐。
  2. 使用千分尺测量凝胶的厚度，该厚度将作为光程长度使用。
  3. 将一块凝胶置于纸板平台上，使用紫外-可见分光光度计在参考室为空气的条件下，测量300–800 nm范围的光谱。
  4. 在吸光度（A）主要由背景散射引起的波长（λ）区域（约700–800 nm）拟合多项式 A = aλn。通常将系数a拟合为约1 × 108至1 × 106之间的数值，系数n拟合为约2至3之间的数值。
  5. 利用拟合得到的系数a和n，计算其他波长处的散射值。
  6. 从原始光谱中减去计算得到的散射背景吸光度，获得经散射校正的光谱。
  7. 使用适当的软件（GRAMS/AI 8.0）在370至490 nm范围内对扣除散射后的光谱进行高斯曲线拟合，以确定气凝胶Soret峰的峰高、峰位和峰宽。
  8. 应用朗伯-比尔定律，结合测得的凝胶厚度作为光程长度（l）、消光系数31（ε）106,100 M-1cm-1以及Soret峰高度（A），计算气凝胶中细胞色素c的浓度（c）（A = εlc）。
  9. 将计算得到的细胞色素c浓度与理论上凝胶中的浓度（15 μM）进行比较，以评估细胞色素c在气凝胶中的活性。典型的活性百分比接近100%，但需注意，这些活性值仅为估算值，因为计算基于溶液中细胞色素c的消光系数31，而该值可能与气凝胶中细胞色素c的实际消光系数略有不同，后者尚未明确。
  10. 在开启圆二色光谱仪光源前，至少通入氮气5分钟。
  11. 将纸板支架用胶带固定在圆二色光谱仪上，使孔与光路对齐。
  12. 在纸板支架中不放置任何样品，以100 nm/min的扫描速度在350–500 nm范围内测量连续波长的空白光谱，取三次扫描的平均值。
  13. 将一块凝胶（其厚度已在步骤6.2中测量）置于纸板平台上，以100 nm/min的扫描速度在350–500 nm范围内测量光谱，取三次扫描的平均值。
  14. 对所有感兴趣的气凝胶整体材料重复进行紫外-可见和圆二色光谱测量。

7. 利用细胞色素c-二氧化硅气凝胶检测一氧化氮（NO）气体的存在

警告：一氧化氮（NO）具有危险性，所有一氧化氮气体操作均须在通风橱内进行，或确保废气排入通风橱。一氧化氮接触空气后会生成高毒性的二氧化氮和/或四氧化二氮，长期暴露对组织有毒性。此外，一氧化氮接触水时还会产生热量和腐蚀性气体。

  1. 将一个8 L的一氧化氮气瓶（含10%一氧化氮，90%氮气）置于通风良好的通风橱内，并将压力调节至4 psi。
  2. 将管路分别连接至一氧化氮气瓶和氮气瓶（压力设定为6 psi），并将两根管路的末端连接至一个T型阀（见图3a）。
  3. 选择一个气凝胶整料用于实验，并使用千分尺测量其厚度（或光程长度）。
  4. 将气凝胶（约3 mm厚）放入带塑料盖的一次性比色皿中，并将比色皿放入分光光度计内。如有必要，可略微修剪气凝胶以适配比色皿。
  5. 将两支注射器针头插入比色皿的塑料盖中，其中一支连接至T型阀的输出端，另一支连接至导管，作为排空管通入通风橱（见图3b）。使用Parafilm密封针头与管路之间的连接，并密封盖子与比色皿。
  6. 在参比池中放入一个空的一次性比色皿。
  7. 调整气凝胶比色皿的位置，确保在实验开始前气凝胶位于光束路径中。
  8. 采集初始光谱，波长范围为800至300 nm。
  9. 在实验过程中，通过旋转T型阀以在氮气和一氧化氮/氮气混合气之间切换，切换时间间隔固定；同时监测414 nm处吸光度与408 nm处吸光度的差值，确保氮气或一氧化氮/氮气混合气的流速始终不会过高，以免导致气凝胶在比色皿中移动。
  10. 完成暴露循环后，再次采集最终光谱，波长范围为800至300 nm。
  11. 重复该实验步骤，使用三至四个整料样品，以获得平均传感响应。

结果

所述方法可制备含有具有活性的细胞色素 c 的气凝胶。如引言末尾所述，细胞色素 c 可从磷酸盐浓度介于 4.4 至 70 mM 的水性缓冲溶液中进行包埋。由不同缓冲液浓度溶液制备的细胞色素 c-二氧化硅（cyt. c-SiO2）气凝胶示例如图4所示。所有凝胶均呈现一定程度的半透明性，其中以 70 mM 缓冲液制备的凝胶最为不透明。

不同条件下细胞色素 c 的光谱学比较如图5所示。图5c 中典型的光谱显示，细胞色素 c-SiO2 气凝胶在约408 nm处具有明显的Soret峰，与细胞色素 c 在溶液中的光谱（图5a）非常相似。此外，图中还展示了包裹在含金属纳米颗粒气凝胶中的细胞色素 c 的光谱（图5b），细胞色素 c-SiO2 气凝胶的光谱与此光谱也十分相近。当细胞色素 c-SiO2 气凝胶暴露于一氧化氮时，可观察到Soret峰发生典型的位移（图5d）。

不同缓冲液浓度下由细胞色素 c 溶液制备的凝胶的紫外-可见光谱如图6所示。所有这些凝胶均显示出特征性的紫外-可见光谱特征，表明细胞色素 c 在凝胶中未处于变性状态。然而，由70 mM缓冲液制备的凝胶透明度降低，导致这些光谱的信噪比较低。

细胞色素的CD光谱 c-SiO2 气凝胶与细胞色素的光谱相似。 c 被包裹在含有金属纳米颗粒的气凝胶中，而这两类气凝胶的光谱均不同于细胞色素c的光谱。 c 在缓冲溶液中（图7).

图8展示了细胞色素c-SiO2气凝胶及同时含有细胞色素c和金属纳米颗粒的相应气凝胶对一氧化氮的典型监测响应。当凝胶依次暴露于一氧化氮和氮气时，414 nm处与408 nm处的吸光度差值先增大后减小。

如果超临界二氧化碳释放速度不够缓慢，则所形成的气凝胶中细胞色素 c 的活性将受到影响。通过以不同速率释放二氧化碳形成凝胶后测得的紫外-可见光谱对比结果可以证实这一点（图9）。

用于光谱分析的真空室装置，配有压力计和连接器。
图1：临界点干燥装置。 图中所示为临界点干燥装置的（A）正面和（B）背面，转移舟和装置门位于装置背面旁。

用于化学分析的微流控纸质装置示意图，展示流体流动路径和反应区域。
图 2：纸板平台。 组装好的纸板平台，用于在仪器光束路径中固定气凝胶。

用于化学分离实验的气体钢瓶装置和柱层析设备。
图3：一氧化氮检测装置。 图中显示了一氧化氮检测装置，包括（A）通风橱内装有10%一氧化氮和90%氮气的气瓶、管路和T型阀，以及（B）插入针头的比色皿。

缓冲液浓度对膜通透性的影响；带棋盘格背景的实验装置示意图。
图4：细胞色素c-SiO2气凝胶样品。 从左至右分别为：含15 μM细胞色素c、置于4.4 mM、40 mM和70 mM磷酸钾缓冲液中的气凝胶，以及作为尺寸参照的10美分硬币。这些气凝胶的高度约为0.2–0.5 cm。经许可重印9。

光谱分析，细胞色素c在SiO2气凝胶中的吸收，图示；波长 vs. 相对吸收度。
图5：细胞色素 c-SiO2 气凝胶光谱分析。 15 μM 细胞色素 c 在以下样品中的可见光谱：（a）50 mM 磷酸盐缓冲溶液；（b）Au(5-nm)~细胞色素 c-SiO2 气凝胶；（c）细胞色素 c–SiO2 气凝胶（暴露于空气中）；（d）细胞色素 c-SiO2 气凝胶（暴露于一氧化氮中3.5分钟）。每种凝胶类型的代表性光谱为清晰起见进行了偏移，虚线表示细胞色素 c 在缓冲液中Soret峰的位置。尽管每条光谱均对应15 μM 细胞色素 c，但凝胶的厚度（或高度）仅为0.2–0.5 cm，而溶液比色皿为1 cm，导致溶液的吸光度更高。经许可转载9。

缓冲液的光吸收光谱；图表；波长 vs 吸收度；光谱分析。
图6：随着包埋缓冲液浓度变化的气凝胶光谱分析。 包埋了15 μM 细胞色素 c 的气凝胶在70 mM（黑色）（4条光谱的平均值）、40 mM（红色，点线）（8条光谱的平均值）和4.4 mM（绿色，虚线）（9条光谱的平均值）磷酸钾缓冲液中的紫外-可见吸收光谱，经凝胶光程长度归一化处理。经许可重印9。

显示蛋白质二级结构分析吸收光谱的圆二色性图谱。
图 7：气凝胶圆二色性光谱。 细胞色素 c 在磷酸钠缓冲溶液（实线）、两种典型的细胞色素 c-SiO2 气凝胶（虚线）以及两种典型的 Au(5-nm)~cyt. cSiO2 气凝胶（点线）中的圆二色性光谱。经许可转载9。

一氧化氮与氮气循环下气凝胶的吸收分析图；显示 Au、细胞色素 c 随时间的相互作用。
图 8：利用细胞色素 c 检测一氧化氮。c-SiO2 气凝胶。 监测包裹在 SiO2 复合气凝胶纳米结构中的细胞色素 c（实线红色）和 Au~细胞色素 c（虚线蓝色）的 Soret 带强度变化（ΔA = A414 nm - A408 nm），当气体在氮气（Soret 峰最大值约为 408 nm）和一氧化氮（Soret 峰最大值约为 414 nm）之间切换时的变化情况。每条曲线均为 3–4 次实验的平均值，其中两次细胞色素 c-SiO2 实验监测的是 ΔA = A414 nm - A407 nm，因为这两次实验的初始 Soret 峰最大值位于 407 nm。经许可重印9。

吸光度光谱图；7分钟与45分钟时CO2释放对比；波长375-600 nm比较。
图9：超临界流体释放时间的影响。 对细胞色素 c-SiO2 气凝胶的平均紫外-可见光谱吸光度除以凝胶光程长度的结果，该气凝胶封装了10 μM 细胞色素 c，并置于50 mM磷酸缓冲液中；气凝胶通过超临界干燥制备，其中超临界二氧化碳的释放时间为45分钟（实线，黑色（9条光谱的平均值））或7分钟（虚线，红色（4条光谱的平均值））。经许可重印9。

讨论

如所述，该操作步骤 consistently 获得了有活力的细胞。 c 包裹在气凝胶中。细胞色素c的浓度 c 气凝胶内的浓度可在5至15 μM范围内变化，且初始细胞缓冲液的浓度 c 气凝胶包封溶液中的磷酸盐浓度可在4.4至70 mM范围内调节 对蛋白质活性无严重不利影响。然而，特征性细胞色素 c 气凝胶中的Soret峰最接近细胞色素c的Soret峰。 c 在溶液中当细胞色素时。 c 被包裹在40 mM缓冲溶液的气凝胶中9.

细胞色素c-SiO2气凝胶的合成受到某些起始试剂存放时间的影响。甲醇、正硅酸四甲酯和氢氧化铵溶液均具有吸湿性，应每隔一至两个月更换一次。这些试剂随时间推移吸收的水分增加，会影响凝胶的结构特性以及溶胶-凝胶转变时间。

进行超临界干燥时，临界点干燥装置的转移舟最多可容纳十八个厚度为0.5 cm、直径为1 cm的凝胶。如实验方案部分所述，应遵循特定的填充和排空程序，将二氧化碳导入溶胶-凝胶中。需要注意的是，在排空程序开始时，二氧化碳与丙酮的混合物流出速度极快，导致排水管外壁因水分凝结成冰而冻结变硬。由于所用丙酮并非无水丙酮，排出的混合物中含有少量水，这些水有时会冻结，导致排水管实际发生堵塞。因此，必须注意观察此类堵塞情况，并倾听流体流动是否停止。一旦发现堵塞，应关闭排水阀数分钟，使堵塞物融化。在最坏情况下，若未及时关闭排水阀，堵塞可能导致压力积聚过多，致使排水管从装置上强力弹出。经过最初的数次排空周期后，装置中绝大部分丙酮将被冲洗干净，湿冰块的出现频率将显著减少。随着排空程序的继续进行，排出物将逐渐呈现干冰的特征，至排空过程结束时，任何丙酮残留迹象（如气味）均不可察觉。

当装置中的二氧化碳从液态转变为超临界流体并开始排气过程后，有必要按照步骤9所述，以缓慢的速率释放流体，持续至少45分钟。若释放速度过快，可能导致细胞色素 c 在气凝胶中的活性降低（如图9所示），同时气凝胶本身也可能因流体迅速逸出而破裂。通常情况下，即使打开装置门后气凝胶仍保持完整，也必须小心轻柔地操作，因为它们质地脆，容易破碎。

与细胞色素c-SiO2凝胶同时制备的空白二氧化硅凝胶，在经超临界干燥后用于判断二氧化碳向凝胶中的转移是否成功。有时细胞色素c-SiO2凝胶可能呈现浑浊状态，此时需明确这种浑浊是由于溶剂转移不完全所致，还是与凝胶中包埋的细胞色素c浓度或缓冲液有关。如果未添加细胞色素c的二氧化硅凝胶在干燥后整体呈现均匀且半透明的外观，则可作为溶剂已完全转移的证据，即使细胞色素c-SiO2凝胶存在一定程度的浑浊。而在干燥后未添加细胞色素c的二氧化硅凝胶内部出现浑浊，则表明在放气过程中仍有部分丙酮残留在凝胶内部。

如方案部分所述，使用一氧化氮（NO）时需采取重要的安全预防措施。利用气凝胶检测NO时，必须将比色皿密封良好，并将流经气凝胶的气体排入通风橱。作为额外的防护措施，也可将整个分光光度计连同一氧化氮气瓶一同置于通风橱内，以限制NO气体的暴露。NO与空气接触后会立即生成剧毒的二氧化氮、四氧化二氮或两者兼有。NO还可与水反应，产生热量并释放腐蚀性烟雾。因此，持续暴露于NO可能导致直接的组织毒性。

使用细胞色素c-SiO2气凝胶检测一氧化氮时，其Soret带最初位于约408 nm处，在一氧化氮存在下会红移至约414 nm。当重新切换至氮气环境后，Soret带应可逆地恢复至约408 nm处。此外，细胞色素c-SiO2气凝胶也可能用于检测其他配体（如一氧化碳）的存在27。

不同的已发表方案包括在溶胶中加入金或银纳米颗粒与细胞色素 c 的混合步骤，随后进行超临界干燥以形成气凝胶4-8。通过比较含有金属纳米颗粒的气凝胶中封装的细胞色素 c 与不含金属纳米颗粒的气凝胶中封装的细胞色素 c 的紫外-可见光谱，结果表明，这两种封装技术在气凝胶中产生的细胞色素 c 活性相似（图5）。然而，含有金属纳米颗粒的气凝胶中封装的细胞色素 c 比不含金属纳米颗粒的气凝胶中封装的细胞色素 c 略为稳定9。两种类型细胞色素 c 气凝胶的圆二色光谱也相似，但均与缓冲液中细胞色素 c 的光谱有所不同，表明细胞色素 c 在气凝胶中发生了一定程度的去折叠（图7）。先前关于细胞色素 c 封装于气凝胶中的研究报道指出，圆二色光谱法最可能检测的是蛋白质最外层的结构，即在接触二氧化硅凝胶时发生去折叠的部分，该结构可能存在于由金属纳米颗粒引发的多层细胞色素 c 结构中，也可能存在于无金属纳米颗粒存在时形成的松散结构中4,9。尽管如此，通过紫外-可见光谱分析可知，气凝胶内任一类型自组装结构中的大部分细胞色素 c 仍保持折叠状态。本文所述不使用纳米颗粒的方案的优势在于，无需昂贵地购买或耗时地合成金属纳米颗粒。蛋白质在气凝胶中的成功封装尚不常见，因此该方法具有重要意义，可能为其他蛋白质在气凝胶中的封装提供一种更通用的方法，对未来的生物分析装置具有潜在价值。

披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本研究及/或出版工作得到了费尔菲尔德大学文理学院科学研究所、费尔菲尔德大学教师研究资助、研究促进会科学进步组织颁发的科特雷尔大学科学奖以及费尔菲尔德大学文理学院的支持。 & 科学与费尔菲尔德大学化学系 & 生物化学系。我们衷心感谢Jean Marie Wallace在本研究领域提供的诸多有益见解和建议。此外，我们特别感谢Harper-Leatherman研究实验室所有过去、现在和未来的本科生研究人员。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
磷酸二氢钾Fisher ScientificP285-500符合ACS认证标准（也可使用磷酸二氢钠）
无水磷酸氢二钾Fisher ScientificP288-500符合ACS认证标准（也可使用磷酸氢二钠）
水Millipore Direct-Q18 MΩ cm
pH计及电极Denver InstrumentUB-10
马心细胞色素cSigma AldrichC7752-100MG ≥95%（基于分子量12,384），直接使用并储存于-20 °C
玻璃闪烁小瓶Wheaton03-341-25J20 ml，外径×高度（带盖）：28 mm × 61 mm
一次性比色皿Fisher Scientific14-955-126甲基丙烯酸酯材质，10 mm × 10 mm × 45 mm
紫外-可见分光光度计ShimadzuUV-1800使用UVProbe v 2.33软件
圆二色光谱仪（或光谱偏振仪）JASCOJ-810
Isotemp实验室冰箱Fisher Scientific
聚丙烯一次性烧杯Fisher Scientific01-291-1050 ml
正硅酸四甲酯（又称四甲氧基硅烷，TMOS）Sigma Aldrich218472-500G纯度98%
甲醇Fisher ScientificA457-4GC Resolv级
氢氧化铵溶液Sigma Aldrich221228-25ML-AACS试剂，28.0%-30.0%
通用聚丙烯闪烁小瓶Sigma AldrichZ376825-1PAK16 mm × 57 mm，体积6.5 ml，用锋利刀片或剃刀切去底部
普通塑料薄膜多种品牌
Parafilm M实验室封口膜Fisher ScientificS37440
塑料注射器推杆多种品牌使用3 ml注射器的推杆
乙醇Acros61509-0040无水，200 proof，99.5% ACS试剂
丙酮Fisher ScientificA949-4HPLC级
临界点干燥仪Quorum TechnologiesE3000系列
循环器Fisher ScientificIsotemp 3016
二氧化碳气瓶Tech Air带虹吸管
千分尺Central Tool Company
GRAMS/AI 8.0软件Thermo Electron Corporation
氮气气瓶Tech Air可用其他惰性气体替代
10%一氧化氮/90%氮气气瓶Airgas
Tygon软管多种品牌
T型切换阀多种品牌
注射器针头多种品牌

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在不含金属纳米颗粒的情况下将细胞色素 c 封装于二氧化硅气凝胶纳米结构中并保持其气相生物活性
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