测量小鼠的压力-容积环

摘要

本文描述了一种从小鼠采集压力-容积数据的详细方案。

摘要

阐明心脏病的病因及其进展过程对生物医学界而言是一项重大挑战。小鼠具有高度的遗传可塑性，为在分子水平上研究心脏功能提供了巨大潜力。然而，小鼠体型较小，在进行精细的心脏表型分析方面带来了一些困难。随着技术的微型化及其他进步，目前已可在小鼠中实现多种心脏功能评估方法。其中，同步采集压力和容积数据的方法能够提供其他任何手段都无法获得的详尽心脏功能信息。本文详细描述了压力-容积环数据采集的具体操作流程，包括测量原理及潜在误差来源的讨论。由于麻醉管理和手术操作对获取高质量血流动力学数据至关重要，本文对此进行了深入阐述。此外，还探讨了血流动力学实验方案设计的基本原则以及数据分析的相关要点。

引言

心血管疾病仍然是全球范围内导致死亡和疾病负担的重要原因¹。心脏疾病在开发新疗法方面尤其面临严峻挑战。遗传学的进步使得识别大量可能参与心脏病发生发展的遗传因素成为可能。由于心血管系统具有高度整合性，这些遗传靶点必须在完整的动物模型中进行验证。小鼠因其遗传操作灵活性强且饲养成本低，已成为评估特定基因生理功能的首选模型。然而，小鼠体型较小，为其心脏功能评估带来了一些独特的技术挑战。尽管存在多种可用于获取心脏功能信息的方法，但只有同时测量心室压力和容积，才能实现心室功能的压力-容积（PV）环分析。PV环分析可将心脏功能评估与其血管连接状态相分离，这对于确定特定遗传因子的功能作用至关重要。

压力-容积环（pressure-volume loops）的评估已在实验和临床领域应用多年，关于这些数据集分析的文献十分丰富^2,3。将压力-容积环技术应用于小鼠，是理解小鼠心脏生理学的一项重要进展^4-6。基于导管的压力-容积环技术结合了压力传感器和电导法来估算心室容积。心室容积通过检测导管产生的电场变化来确定。该方法将心室建模为一个圆柱体，其高度由导管上电极之间的距离定义，半径则通过心室内血液对电场的传导计算得出^7-9。导管测得的电导信号包含两个组成部分。第一部分是血液的传导，其随心室容积的变化而变化，构成用于确定心室容积的主要信号。第二部分来自心室壁本身的传导以及沿心室壁的传导，称为并行电导（parallel conductance），必须予以消除，才能获得绝对心室容积。目前研究实验室中有两种 commercially available 的系统可用于采集压力-容积数据，二者在计算和消除并行电导的方法上存在主要差异^6,10,11。电导导管需要注射高渗盐水以计算并行电导。该注射会短暂改变心室内血液的导电性，而心室壁的导电性保持不变。通过这些数据，可以区分电导信号中来源于血液的部分和来源于心室壁的部分。该方法假设在心动周期中并行电导保持不变。导纳法（admittance method）则利用电场的相位变化来评估心室壁对总体容积信号的贡献。该方法依赖于一系列预设的血液和心肌导电性常数来确定最终容积，但可在心动周期中连续测量并行电导。这两种系统均可对左心室容积提供良好的估算，彼此之间的差异在生理学上可能并不显著。然而，由于心室的圆柱体模型及其他假设的存在，这些基于导管的方法的准确性不及其他检测手段，但其能够提供逐搏（beat-by-beat）的数据，这对于评估心脏功能的负荷无关性指标至关重要。

本文所述方法在我实验室中应用，并已为大量研究肌营养不良性心肌病基本病理生理机制的工作提供了数据^12-18。下述方法是获取压力-容积环（PV环）数据的两种方法之一。尽管许多原理适用于两种方法，但本方案将重点介绍开胸心尖入路；闭胸方法已在其他文献中详细描述^19,20。虽然本方案将进行详细说明，但需始终遵循的核心原则是：在尽可能减少对心脏和肺组织损伤的前提下充分暴露心脏。在整个操作过程中，必须牢记这是一项非存活性实验，充分暴露心脏对于导管的准确定位至关重要。

方案

在执行本方案中所述任何操作之前，须获得当地机构动物护理和使用委员会的批准。

1. 实验装置的设置

注意：本操作需在麻醉动物上进行，数据质量与为动物提供的麻醉支持质量成正比。本第一部分将详细说明在执行本方案时为小鼠提供麻醉所必需的设备和操作步骤。

1. 选择一种麻醉方案。吸入性麻醉剂在进行压力-容积环（PV-loop）分析时具有多种优势，尽管也有使用一些注射性麻醉方案的情况。有关选择麻醉方案的更多信息，请参见讨论部分。
2. 将压缩氧气瓶固定在手术台或靠近手术区域的墙壁上。
3. 若使用吸入性麻醉剂，应使用挥发器以确保准确给药。每年校准挥发器，以保证其提供适当的麻醉气体剂量。将挥发器连接至流量计，以便控制气体进入麻醉回路的速率。设定流量为 0.5 - 1.0 L/min。
4. 使用歧管将麻醉气体定向输送至1）诱导室，2）面罩，以及3）呼吸机。麻醉气体的回收至关重要，应通过主动式系统进行，该系统可将气体排入通风橱（或其他类似的建筑设施）或通过专用于清除麻醉气体的吸收罐。
   注意： 咨询当地职业健康主管部门，以确保符合所有地方性法规要求。
5. 使用加热垫和/或加热灯维持核心体温。通过直肠温度计持续监测体温。这有助于主动调节加热强度，以确保体温处于生理范围≈ 37 °C）在采集血流动力学数据期间。
6. 提供液体支持以代偿失血和非显性体液丢失。
   1. 取1 ml 25%白蛋白溶液与1.5 ml 0.9% NaCl加入注射器中，配制10%白蛋白溶液。
   2. 准备低残留体积的血管内导管。
      1. 使用钳子压碎0.5英寸30号针头的塑料针座。用持针器夹住针头并取下针座。用止血钳刮去针头残留的粘合剂。将针头的钝端插入一段微孔管中。微孔管长度应小于20英寸。
   3. 使用注射泵以精确输送液体体积。
7. 确保良好的通风以采集高质量的PV数据。市面上有多种小鼠呼吸机可供购买。压力控制型呼吸机可提供吸入性麻醉气体所需的密闭环境，并在操作过程中实现更精确的通气控制。
   1. 确保吸气压限制在 <15 cm H₂以防止气压伤。将呼吸机设置为在呼吸周期的35%期间输送吸气脉冲。使用4 - 5 cm H₂O水平的呼气末正压（PEEP）。₂O 将通过防止肺不张并支持气体交换，显著改善小鼠的通气功能。
   2. 限制呼吸管路中Y型接头远端的死腔。这一点至关重要，因为小鼠的潮气量非常小，任何死腔都会减少新鲜吸入气体的输送。
   3. 通过剪除20号留置静脉导管的尖端制备小鼠尺寸的气管插管（ET导管），以形成锥形末端，便于插入。将剪裁后的末端插入麻醉回路的Y型接头中。
   4. 在呼吸回路中使用柔性导管。导管中的任何结构记忆都会产生外力，可能导致将气管插管从小鼠气道中拉出。
   5. 让小鼠通过使用能够抑制其自身呼吸驱动的最低呼吸频率来确定呼吸频率。起始呼吸频率设为每分钟约60次的相对较低水平。
      注意： 在适当通气的情况下，小鼠的自主呼吸应极为微弱。然而，如果通气不足，二氧化碳蓄积会导致₂ 血液中的变化将启动小鼠的呼吸活动。若观察到此现象，提高呼吸频率是增加肺泡通气量的直接方法。在应对β-肾上腺素能受体刺激引起的心脏负荷增加时，通常需要提高呼吸频率。
   6. 呼吸回路准备就绪后，用手指堵住气管插管（ET）导管的末端，对系统进行压力测试。确保气道压力达到 ≈10 cmH₂O₂O. 此项检测应在每次操作前进行。

2. 手术入路

1. 使用小镊子、剪刀及其他器械从 表1所有器械均体积小巧，便于在放大的手术视野中操作。使用手术立体显微镜，为手术过程的多个环节提供足够的放大倍数。
2. 使用电灼器以在手术过程中最大限度实现止血。
   注意: 电烙器有几种主要类型。热烙器通过加热一根细金属元件来切割肌肉组织并止血。这类设备初期购置成本相对较低，但需要注意的是，其金属丝探头既易损又相对昂贵。电烙器系统初期购置成本较高，但其探头非常坚固，无需频繁更换。
3. 诱导与手术准备
   1. 获取小鼠的体重。
   2. 将小鼠放入充满5%异氟烷的诱导室中。
      注意： 小鼠在此环境中无法存活超过几分钟，仅能维持 45 - 60 秒 小鼠失去翻正反射（当被置于背部或侧部时试图翻转的努力）是必需的。
   3. 一旦翻正反射消失，将异氟烷浓度降至2%，并向面罩开放麻醉气体。
   4. 迅速将小鼠转移至手术台，使其仰卧，鼻部置于面罩内。
   5. 若使用电灼器，应使用浸有生理盐水的纱布将小鼠与电灼器系统的接地垫进行电耦合。
   6. 用手术胶带固定四肢。这种胶带即使在潮湿条件下也具有黏附性。
   7. 插入直肠式体温探针以监测核心体温，并用胶带固定。
   8. 在小鼠的颈部和胸部涂抹脱毛剂，等待 2 - 3 分钟 为使脱毛剂发挥作用，随后使用棉签和/或实验室擦拭纸去除这些区域的毛发。
      注意： 由于该操作为非存活手术，无需对手术区域进行铺巾，但若使用电灼接地垫，可进行铺巾以限制术者接触接地垫。
   9. 小鼠完成手术准备后，通过脚趾夹捏法评估其手术麻醉深度。确认麻醉深度适宜后，小鼠即可进行首次切口。
4. 通过经口插管或气管切开术建立气道控制。气管切开术是一种较为简便且易于实施的有效方法。
   注意： 在整个手术操作描述中，所有方向和方位均以术者为参照。
   1. 在胸骨切迹水平处做一个切口，从 ≈ 中线右侧5 mm处 ≈ 中线左侧5 mm处。
   2. 沿第一切口的右边缘做第二个切口，向头侧延伸至相应水平 ≈ 下颌骨末端后方2 mm处。
   3. 从第二处切口的头端开始，延伸出第三处切口 ≈ 中线左侧5 mm处。将形成的皮瓣向左牵拉，以暴露下方组织。
   4. 通过钝性分离在正中线处分离腮腺和下颌下腺。这将暴露气管上方的底层肌肉组织。
   5. 钝性分离左右胸骨舌骨肌以暴露气管。
   6. 通过 ≈在气管下方穿过一段10 cm长的3-0丝线缝合线，注意避免包含食管。
   7. 确定气管切开位置：在喉部尾侧，第一气管环前方存在一个间隙，此位置是进行气管切开的理想部位。
   8. 调节 manifold 以向呼吸机输送麻醉气体，并打开呼吸机。
   9. 用手指堵住气管插管（ET管）的末端，检查是否存在漏气。确保气道压力达到 ≈10 cmH2O
   10. 使用20号针头作为手术刀，切开气管。切口应相对较宽，因为气管插管将占据气管管腔的大部分空间。
   11. 迅速操作，取下口罩并小心将气管插管插入气管。切勿用力过猛，因为组织非常脆弱，若穿透气管壁可能导致气胸。
       注意： 插入后应立即观察到胸部起伏。
   12. 用胶带固定呼吸回路，以防止气管插管被意外拔出。
   13. 在3-0缝线末端打一个单结，以在气管插管周围形成密封。
       注意： 此时应能明显观察到胸部起伏。若无此现象，通常是因为气管插管在气管内的位置不当所致。可将气管插管稍作回撤并尝试重新定位，以气管的走向作为调整方向的参考。
5. 颈静脉穿刺部位准备
   1. 将左侧唾液腺向头侧外侧牵开，暴露颈外静脉。
   2. 用钝性分离法切开覆盖在静脉上的薄层肌肉（胸锁乳突肌），以暴露颈静脉的外表面。
   3. 小心清除静脉周围较大的组织块，但需格外谨慎，因为静脉壁非常薄。完成此操作后，用唾液腺覆盖颈静脉，以保护静脉，便于后续插管。
6. 开胸术；进入胸膜腔而不损伤心脏或肺组织
   1. 去除覆盖胸部的大部分皮肤，将原始皮肤切口的右边缘向下延伸至剑突水平，然后横跨至中线 ≈ 中线左侧1.5 cm处
      注意： 切割乳腺外部血管时应小心操作，因为这些血管可能是大量出血的来源。在切断这些血管前进行电凝，可有效防止出血。
   2. 使用钝性分离法将皮瓣向外侧牵拉，以暴露下方的肌肉组织。
   3. 使用血管扩张钳分离右侧胸大肌在胸骨尾侧区域的止点。电灼并切断该肌肉。
   4. 沿胸骨附着处切开胸大肌，电凝切缘以确保止血。
   5. 接着分离同侧的背阔肌，该肌肉是一块覆盖小鼠体侧的大片状肌肉。电灼并切断该肌肉，然后将切断端向头侧牵开。此步骤可能需要一些钝性分离操作。
      注意： 此时肋骨已清晰可见，某些小鼠品系中还可观察到心脏。在大多数小鼠中，于第四肋间隙的尾侧半部进入胸腔可良好暴露心脏。第四肋间隙是第二靠尾侧的肋间隙。
   6. 使用一把锐利的镊子，小心地穿过肋间肌层，以进入胸腔。
   7. 打开胸膜腔后，小心插入钝头血管扩张器。利用血管扩张器对胸壁施加轻柔的上抬力量，用钝头弹簧剪仔细切开剩余的肋间肌。
   8. 先横向切开，注意不要切到下方的肺叶。接着向内侧延伸切口，但需保持在中线外侧3 - 4 mm处，以避免损伤胸廓内动脉。
      注意： 胸廓内血管与胸骨平行走行，若不慎切断可导致大量出血。
   9. 使用小棉签轻轻将肋间肌切缘向上卷起，以确保电灼时仅接触切开的组织，避免与肺或心脏接触，仔细电灼肋间肌的切缘。
   10. 将浸有生理盐水的小棉签通过切口插入，棉签头指向中线方向。轻轻向上牵引，使胸壁与下方结构分离。从切口内侧边缘开始电灼胸壁，直至结束 ≈ 左侧中线外侧1 cm处。
   11. 将施用器向左推进，使其始终位于电灼头下方。
   12. 组织彻底烧灼后，用剪刀小心剪开胸骨。此时应能清晰看到心脏的心尖。
   13. 使用钝性分离法破坏心包膜，并辨认后腔静脉。
   14. 检查是否有出血迹象，并立即进行电凝止血。确认所有出血点处理完毕后，仔细移除铺巾、电凝负极板以及浸有生理盐水的纱布。
7. 颈静脉置管
   1. 将1.6.2步骤中制备的导管小心地套接在30号针头上，连接至含有10%白蛋白的注射器。
   2. 通过导管开始输注白蛋白。
   3. 将导管调整至针头自然位于颈静脉上方，针尖斜面朝上。必要时，可使用持针器旋转导管内的针头，使斜面处于正确方向。
   4. 当导管完全冲洗后，停止输注。
   5. 用镊子夹住导管针。另一只手使用组织镊牵拉唾液腺，以暴露颈静脉。轻柔牵拉颈静脉远端周围组织，使血管壁产生张力。以较小的角度进针，小心将针头插入静脉，将针尖向前推进 3 - 4 mm 进入血管。
   6. 在松开导管针之前，先用胶带固定导管管路，以限制针头松开后发生任何移动。
   7. 松开针头，轻轻回抽注射器活塞，观察管路中是否有血液，以确认导管位于血管腔内。
   8. 正确放置后，使用外科胶水将导管固定，以连接针头与下方的唾液腺。
   9. 计算需要输注的总体积。若无明显失血，输注体积为5 µ每公斤体重给予 l/g 已足够。若存在显著失血，则输注 6–6.5 µ可能需要1升/克。设定流速，使整个输注过程在10至15分钟内完成。
8. 左心室PV导管置入
   1. 在上述手术过程中，将PV导管置于含有生理盐水溶液的注射器中，使其达到平衡。
   2. 在放置前，将注射器和导管移至小鼠旁边。使导管尖端与心脏大致处于同一高度，校准压力读数为零。
   3. 使用浸有生理盐水的小型棉签轻轻移动心脏，以暴露心尖以便观察。
   4. 使用25号针头，在尽可能靠近心尖中心的位置进行穿刺切口。
   5. 拔出针头后，迅速将导管通过切口插入。插入导管无需施加较大力量，因此在将导管推进心室时应控制力度。有时需要进行额外的刺切。若确需如此，应尽量在初始切口附近进行后续切口，以最大限度减少对心脏的损伤。
      注意： 导管进入心室后，最终位置的确定至关重要。心室压力波形可通过低舒张压来识别（<10 mmHg）和较高的收缩压（>80 mmHg）。理想情况下，导管应位于心室中央，外电极恰好处于心室内。可通过观察PV环数据对导管位置进行微调，寻找呈方形的轨迹图形 ≈ 90° 边之间的夹角

3. 操作步骤

注意：导管放置到位后，需要一段短暂的稳定期（10 - 15 分钟），以使动物从手术引起的急性应激中恢复，并为液体输注留出时间。在此稳定期结束后，即可开始正式的实验方案。

1. 一旦放置好脉压（PV）导管并停止外科操作后，降低异氟烷的浓度至 ≈ 1% 时，对深部手术麻醉平面的需求降低。
   1. 在此期间，需密切监测小鼠，以确保维持适当的麻醉深度。仔细评估任何运动反应；呼吸肌运动提示存在通气不足，可通过增加呼吸机的呼吸频率予以纠正。肢体活动或胡须抽动表明小鼠麻醉过浅，需要追加麻醉药物。
      注意： 可将多种不同处理方式与本方案联合使用。其中许多处理需要通过输注给药。有效管理管路死腔容积至关重要。溶液切换可通过将导管管路从一个注射泵的针头滑动至另一个注射泵的针头来实现。在前一次输注即将结束前及时进行此操作，可使导管管路中充满下一种药物。必须明确导管管路内的液体体积，以确定溶液切换的时机。在管路中引入一个小气泡，可精确判断输注切换的时间；该气泡进入静脉循环后通常耐受良好。
2. 通过降低前负荷和增加后负荷来改变心脏的负荷条件。
   1. 通过阻断静脉回流至心脏以降低前负荷。在此操作中，观察并阻断从膈肌走向心脏的尾腔静脉。该阻断操作应平稳且相对快速地进行，持续时间不超过2 - 3秒。通过施加持续1 - 2秒的轻柔腹部压迫，短暂增加左心室后负荷。
   2. 在心脏负荷变化期间，暂停呼吸以消除呼吸机引入的任何伪影。
3. 使用导管电导法校准容积信号。采用导纳技术的导管无需进行这些步骤。
   1. 实验方案结束后注射 5 - 10 µl 的高渗盐水（20% NaCl）以计算并行电导。
   2. 通过移除导管并从左心室向肝素化注射器中采集血液。将血液放入已知体积的比色皿中，并使用导管测量导电性。
   3. 利用比色皿电导测量值将电导信号转换为容积，且必须通过并联电导来确定导管所测得的绝对容积。
4. 实验方案完成后，通过横断下腔静脉和主动脉连接后摘除心脏，处死小鼠。

结果

按照惯例，体积绘制在 X 轴上，压力绘制在 Y 轴上，如图 1所示。将压力对体积作图所得到的压力-容积环应呈矩形，其垂直边代表等容压力变化（即二尖瓣和主动脉瓣均关闭时）；底部的水平边代表通过二尖瓣的心室充盈，上部的水平边代表通过主动脉瓣的心室排空。在健康的野生型小鼠中，预期左心室压力为 90 - 110 mmHg，最大 dP/dt 为 8,000 - 12,000 mmHg/sec（正常血流动力学参数范围见表 1）。表中提供的正常范围基于野生型 C57BL/10 和 C57BL/6 小鼠获得的数值；但需注意，不同品系之间存在显著差异²¹。本文所述的操作流程重点介绍通过心尖穿刺切口将导管置入左心室的方法。另一种常用方法是经右颈总动脉插入导管后逆行通过主动脉瓣。逆行法的优势在于可在闭胸状态下进行，从而维持正常的胸内压；然而，该操作过程中动物通常需要机械通气，这在一定程度上削弱了该优势。闭胸方法对导管在心室内的方向控制有限，而开胸方法则能更有效地操控导管在心室内的位置。逆...

讨论

该操作中有三个关键步骤：1）气管插管的放置及适当的通气，2）颈静脉留置导管的放置，3）左心室中压力-容积（PV）导管的准确定位。确定合适的呼吸频率是提供通气支持的重要环节。清醒小鼠通常通过快速浅表的呼吸来维持肺泡通气。而机械通气下的小鼠潮气量通常要大得多，因此需要较慢的呼吸频率。这一点至关重要，因为通气不足会导致呼吸性酸中毒，而通气过度则会引起呼吸性碱中毒，这两种情况均会改变心脏功能。优化呼吸频率的一个简单方法是观察小鼠的自主呼吸努力程度，采用能够消除麻醉小鼠呼吸努力的最低呼吸频率。

压力-容积环分析的一个关键特征是在不显著抑制心脏功能的前提下维持足够的麻醉水平。有多种麻醉方案可成功用于压力-容积环分析，这些方案大致可分为两类：吸入性麻醉剂和注射性麻醉剂。在后一类中存在多种可用的混合制剂，但其中许多混合物具有潜在的心脏抑制作用¹⁹。在注射类麻醉混合物中，基于乌拉坦的麻醉剂心脏抑制作用最小^4,19。需注意限制人员接触乌拉坦，因其为疑似致癌物²⁸。目前可用的吸入性麻醉剂包括异氟烷和七氟烷。这两种药物在足以进行外科操作的剂...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
Dumont 5/45 (2)	精细科学工具公司	11251-33
血管扩张镊	精细科学工具公司	18153-11
Castroviejo 微型解剖弹簧剪	Roboz 仪器公司	RS-5668
八角镊 - 有齿/弯型	精细科学工具公司	11041-08
八角镊 - 有齿/直型	精细科学工具公司	11040-08
解剖剪 - 厚刃型	精细科学工具公司	14082-09
透气外科胶带	3M 公司	1527-1
3-0 丝线缝合线	精细科学工具公司	18020-30
TOPO 呼吸机	Kent 科学公司	TOPO
Martin ME 102 电外科设备	哈佛仪器公司	PY2 72-2484
注射泵	Lucca 技术公司	GenieTouch
带臂式支架的体视显微镜	尼康公司	SMZ-800N
热电偶温度计	Cole-Parmer 公司	EW-91100-40
T/Pump 温水循环仪	Kent 科学公司	TP-700
ADVantage 压力-容积系统	Transonic 公司	ADV500
数据采集与分析系统	DSI 公司	Ponemah ACQ-16