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为何定量至关重要：在表型水平上的特征描述 果蝇 幼虫神经肌肉接头

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DOI：

10.3791/53821

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2016年5月12日

 ,  , 
1Euan MacDonald Centre for Motor Neurone Disease Research, University of Edinburgh, 2School of Biomedical Sciences, University of Edinburgh

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

细胞内细胞器的形态、大小和位置在进化上是保守的，并且似乎直接影响其功能。了解这些过程背后的分子机制已成为现代生物学的重要目标。本文展示了如何通过应用定量技术来促进这些研究。

摘要

大多数关于形态发生的研究所依赖的是对特定基因和遗传通路被干扰后解剖性状改变的定性描述。尽管基因操作会产生一系列表型效应，且对照组个体之间也存在可观察到的变异，但定量描述仍很少开展。 越来越多的证据表明，细胞器的形态、大小和位置在细胞功能与存活中发挥着此前被低估但极为关键的作用。本文提供了对表型进行定量分析的逐步操作指南 果蝇 幼虫神经肌肉接头（NMJ）。我们结合多种可靠的免疫组织化学标记、生物成像技术以及形态计量学分析，以检测基因突变对特定细胞过程的影响。特别是，我们重点关注影响横纹肌内细胞核形态、大小和位置的表型的定量分析。 果蝇 幼虫。该 果蝇 幼虫神经肌肉接头是研究健康与疾病状态下神经肌肉系统结构和功能分子机制的重要实验模型。然而，本文所述方法也可推广应用于其他系统。

引言

定性分析将大多数实验研究的重点限制在考察导致显著表型效应或难以量化的表型的遗传操作上， 例如，有或无。表型的量化通常不进行，且表型组内个体间的变异未被考虑。此外，若缺乏对形态的数学描述，可能难以确定细微表型变化是基因诱导的改变所致，还是仅由随机波动引起。

我们建议，为了准确且无偏倚地分析基因失活所导致的表型缺陷，定量方法应与传统的定性方法相结合。对于突触等由于其内在形态和功能可塑性而具有高度变异性的结构，表型的定量评估尤其有益。我们选取了定量分析的应用实例，这些实例来自我们最为熟悉的研究所域，即黑腹果蝇（Drosophila）幼虫的神经肌肉接头（NMJs）。然而，这些概念和原理同样适用于其他实验系统。

幼虫神经肌肉接头（NMJ）因其结构高度保守，是研究突触发育与功能的优良模型系统。幼虫神经肌肉系统的每个半节段均包含32个可识别的运动神经元，这些神经元与其突触后靶向肌肉形成突触连接。每个半节段还含有数量固定的肌肉，表现为多核肌纤维，附着于角质层内表面，清晰可见。1使用幼虫神经肌肉系统的另一个优势在于其强大的功能和广泛的适用性 黑腹果蝇 遗传学特性，可轻松产生多种突变等位基因，并能够在时间和组织特异性受限的条件下对基因表达进行修饰。最后，导致人类疾病的基因中有75%在进化上具有保守的同源基因 果蝇2确实，果蝇与人类之间的整个遗传通路都是保守的。正因为如此， 黑腹果蝇 幼虫神经肌肉系统是研究多种人类疾病（包括肌萎缩侧索硬化症，ALS）分子机制的常用实验模型1.

本文表明，多种可靠的免疫组织化学标志物结合生物成像技术以及精确的形态计量分析，能够描述出可能具有重要功能作用的解剖特征3,4,5。在可进行定量分析的细胞过程之中，我们重点关注细胞核等细胞内结构在形态、大小和位置上的变化。这些过程目前我们所知甚少。

未来几十年，分子遗传学家面临的挑战将是通过分析产生极其细微表型缺陷的基因突变，拓展当前的认知。定量研究方法使研究人员能够细致探索基因突变的影响，从而更全面地理解基因型与表型之间的关系，尤其是在那些尚未被充分阐明的细胞过程方面。

方案

1. 实验准备

注意：第2和第3节中的解剖及免疫组织化学操作步骤依据参考文献3-6进行，但有所修改。

  1. 配制 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）以及含 0.1% Triton-X 100 的 PBS（PBT）。将两者置于冰上保存。
  2. 配制新鲜的 Bouin 固定液（15 份苦味酸 : 10 份甲醛 : 1 份冰醋酸）。
  3. 选择洁净的不锈钢显微操作针和精细镊子。
  4. 准备解剖板，在 5 cm 培养皿中放入含 Sylgard 圆盘的装置。

2. 三龄幼虫神经肌肉接头的解剖

  1. 用细毛刷从试管或瓶子中挑选出正在游走的三龄幼虫，放入含有4 °C PBS的2 cm培养皿中，以洗去残留的食物。
  2. 将一条幼虫放置在解剖板的硅胶表面，确保其背面向上，使两条纵向的气管位于上方并可见。
  3. 用镊子夹住大头针，在幼虫前端口钩正下方将其固定，尽可能拉直幼虫，并用大头针将后端固定。
  4. 加入足够的PBS生理盐水，使液体达到解剖板边缘，完全浸没幼虫。
  5. 对同一基因型的其他幼虫重复步骤2.1至2.3。一个5 cm的培养皿解剖板可轻松容纳最多8条幼虫。
  6. 使用显微解剖剪轻轻提起背部表皮，在靠近后端大头针处做一小段水平切口。
  7. 将剪刀插入切口，沿两条纵向气管之间的中线从前向后剪开幼虫。注意切口应足够浅，仅穿透表皮，避免切断腹侧的肌肉。
  8. 在前后两端，分别在左右两侧各剪出两个切口。
  9. 在前部切口两侧各插入一枚大头针，将标本展开；后端同样操作。插针时注意将体壁充分撑开。
  10. 用镊子和PBS生理盐水清除内部器官，保留中枢神经系统完整。用角部的大头针轻轻拉伸幼虫，直至完全展开，但需确保在此过程中肌肉不被撕裂。
  11. 在同一解剖板上对其他幼虫重复相同的解剖步骤。
  12. 用PBS生理盐水洗涤三次，彻底清除所有内部器官。
  13. 将PBS替换为Bouin固定液，在室温下固定10分钟。
  14. 用PBT多次洗涤。
  15. 小心移除大头针，将所有已变得较为坚硬的标本转移至1.5 ml微量离心管中，用于免疫染色。

3. 使用肌肉及肌核特异性抗体对Drosophila NMJ进行免疫组织化学染色

  1. 用PBT快速冲洗幼虫肌片。
  2. 在PBT中加入10%正常山羊血清（NGS），于持续振荡条件下孵育2小时，以封闭样本。
  3. 将一组解剖好的NMJ置于含5% NGS、1:500稀释的兔抗lamin抗体和1:500稀释的豚鼠抗DVAP抗体的PBT中，室温孵育2小时或4 ºC过夜。抗DVAP抗体可标记横纹肌，而抗lamin抗体则用于显示肌核轮廓。
  4. 用PBT快速洗涤一次，以去除多余的抗体；随后在PBT中洗涤2小时，每15分钟更换一次PBT缓冲液。
  5. 将样本置于含5% NGS和1:500稀释的荧光标记二抗的PBT中，室温孵育2小时。若使用与不同发色团偶联的二抗，同一样本可同时进行多种抗体染色。
  6. 去除二抗后，用PBT洗涤2小时，每15分钟更换一次PBT缓冲液。
  7. 为染色肌核内部，先用PBS洗涤样本三次，然后按以下步骤操作：
    1. 在PBS中以1:1,000稀释核标记物TO-PRO-3，加入后在持续振荡条件下孵育20分钟。本研究使用该标记物，但也可使用其他市售的核标记物。
    2. 封片前用PBS快速洗涤三次。

4. 在载玻片上封片

  1. 用镊子从1.5 ml 微型离心管中夹取样品，并将其平放在处理载玻片上。
  2. 使用显微解剖剪刀剪去肌片的头部和尾部，并使内表面朝上。
  3. 在洁净的载玻片两侧各贴上三条相距约1 cm的纤维素胶带，以制备封片用载玻片。当盖玻片置于两条胶带之上时，会形成一个间隙，从而避免样品被压平。若需对结构进行三维体积重建，此步骤至关重要。
  4. 在封片载玻片中间、三条纤维素胶带之间的区域，滴加约20 µl的封片介质。
  5. 用洁净的镊子将封片介质铺开后，将解剖好的幼虫转移至载玻片上的封片介质中，保持其内表面朝上。尽量将样品以每行四至五个的方式排列。
  6. 轻轻将盖玻片盖在封片载玻片上，确保不产生气泡。用透明指甲油密封切片边缘。成像前让样品至少干燥10分钟。

5. 成像的共聚焦显微镜设置

注意：本研究中展示的图像采用集成于Ti:E倒置显微镜上的Nikon A1R共聚焦单元获取。然而，任何配备至少3个激光单元（可用波长分别为488 nm、561 nm和642 nm）以及三通道检测系统的共聚焦显微镜均适用于本实验目的。

  1. 打开激光器、检测器单元、汞灯、载物台控制器、显微镜和计算机。启动控制软件，并将玻片固定在载物台夹持器上。
  2. 为加快成像速度，使用 20X 物镜在样品上选择并标记所有感兴趣区域（ROI）。
  3. 小心旋转物镜转换器至 60X 高倍物镜（60X Plan Apo VC/ NA 1.4 OIL）。
  4. 在物镜上滴加一滴浸油，并从计算机的 XYZ 概览窗口中选择一个已标记的 ROI。
  5. 使用以下光学设置开始成像：选择第一块二向色镜：405/488/561/640；通道 1 选择 488 nm 激光器与 525/50 nm 发射滤光片，通道 2 选择 561 nm 激光器与 595/50 nm 发射滤光片，通道 3 选择 642 nm 激光器与 650 nm 长通滤光片。
  6. 开始图像采集前使用以下扫描设置：选择检流计扫描器；扫描方向：单向；扫描速度：每秒 0.5 帧。
  7. 选择通道序列以避免通道串色。
  8. 将针孔大小调整为 1 个艾里单位。针对每个通道扫描并适当调节激光功率、检测增益和偏移量，以避免像素饱和和背景过高。
  9. 对所有 ROI 和玻片样本，使用体素尺寸 0.2 x 0.2 x 0.5 µm3 采集 z 轴层扫图像。若图像将进行去卷积处理，则将体素尺寸设为 0.06 x 0.06 x 0.15 µm3。
  10. 将图像保存为 .nd2 或 .ics 文件格式。

6. 横纹肌细胞核间距的计算 通过最近邻分析法研究肌肉

  1. 在此分析中，使用共聚焦图像，该图像显示了用 DVAP 抗体染色的幼虫体壁肌肉，以观察肌肉，同时用 lamin 抗体和核标记物染色以突出细胞核。
  2. 使用图像分析软件中 MeasurementPro 模块的测量点（Measurement Points）来估算细胞核之间的最近距离，例如，Imaris）。其他类似的图像分析软件也可用于相同目的。
  3. 打开共聚焦图像。首先，双击软件图标以启动程序。将共聚焦z轴层叠图像拖放到Arena中。
  4. 双击图像即可在工具栏菜单图标下方的 Surpass View 中自动打开  figure-protocol-1Surpass 视图包含三个主要工作区面板：视图区域、对象列表和对象属性区域。
  5. 单击菜单图标 3D 视图，创建一个三通道体积渲染图像 figure-protocol-2.
  6. 单击“添加新的测量点”图标 figure-protocol-3 从 对象工具栏并按照对象属性区域中出现的创建向导进行操作。
  7. 在创建向导中，首先选择“编辑”选项卡，然后选择“特定通道”。选择细胞核标记物或层粘连蛋白通道以突出显示细胞核。
  8. 通过按下键盘上的 Esc 键，将指针设置为选择模式。
  9. 使用鼠标滚轮调整3D游标框的大小，使其包含图像中的某个特定细胞核。按住 Shift 键并左键单击同一细胞核，以添加测量点。
  10. 在同一条肌肉上靠近的另一个细胞核处，重复前述步骤添加第二个点。系统将自动在两点之间绘制一条线，并显示两个细胞核之间的测量距离。该距离作为统计变量，记录在“统计”选项卡下的“对象属性区域”中。 >详细>距离数据。
  11. 对围绕某一特定细胞核的所有细胞核，重复执行步骤 6.6 至 6.10 的操作。
  12. 来自统计学 > 详细> 显示所有采集测量点的距离数据，选择最短距离。
  13. 单击“标签页显示到文件”中的“导出统计” figure-protocol-4 在“对象属性区域”中可获取，数据将保存在电子表格中。
  14. 对每种基因型的其他邻近细胞核以及选定数量的肌纤维重复相同的操作步骤。
  15. 使用导出至电子表格文件的数据，计算平均最短距离（D平均) 使用以下公式计算所有 M 块肌肉的数值：
    figure-protocol-5
    Di 表示在给定的第 i 个细胞核中，其与邻近细胞核之间的最短距离，其中 i 的取值范围为 0 到 N，N 为每块肌肉中分析的细胞核数量。从 j = 0 到 j = m 的求和表示共分析了 M 块肌肉。
  16. 或者，使用 使用“斑点创建向导”和“斑点到斑点最近距离”功能来估算到最近邻近细胞核的平均距离。为此，需要一个 Matlab 扩展模块。
    1. 在 Arena 中双击某一特定图像，View Area 将显示对应的 3D 体积图像。点击 Object Creation 图标，添加新斑点 figure-protocol-6 来自“对象”工具栏。
    2. 在“对象属性”区域的创建向导中，单击“跳过自动创建，手动编辑”选项。
    3. 选择层连蛋白或核标记通道以显示细胞核。
    4. 按住 Shift 键并单击图像中特定肌肉的所有细胞核，每个细胞核上将出现一个标记点。
    5. 在“对象属性”区域的“工具”选项卡下，选择“点到点最近距离”。在结果模式下选择“点统计”，将弹出一个Matlab窗口。
    6. 在“统计”选项卡下，选择“详细”然后选择“特定值”。单击“Distmin”，每个细胞核的最小距离值将显示出来。
    7. 将数据导出至电子表格文件，并计算每块肌肉的平均距离。对给定基因型的所有肌肉重复该操作。

7. 确定体壁肌肉内细胞核的形态 果蝇 幼虫

  1. 进行此分析时，使用经层粘连蛋白和核标记物染色的体壁肌共聚焦图像，以观察细胞核。
  2. 为评估肌核的形态，测量其球形度（定义为与该细胞核体积相同的球体的表面积与该细胞核实际表面积的比值）或椭圆度（用于区分扁球体/长球体与球体）。
  3. 按照前述方法打开图像。点击工具栏中的“添加新表面”对象图标 figure-protocol-7。
  4. 在对象属性区域出现的创建向导中，选择核标记物染色作为“源通道”，以显示细胞核。
  5. 将“绝对强度”设为阈值。通过调整阈值曲线上的数值，确保大多数细胞核呈现平滑且不过度渲染的效果；同时，使用同一曲线避免任何细胞核出现孔洞或掩膜不完整的情况。
  6. 使用 滤波工具排除表面渲染中的噪声。在新创建的表面层的“编辑”选项卡下，对错误渲染的细胞核表面进行分割或合并。
  7. 将“统计”选项卡中可获取的表面渲染细胞核的椭圆度和球形度数值导出至电子表格文件。
  8. 或者，使用 ImageJ 或 Fiji 软件测量细胞核的圆形度，其中圆形度（C）定义为 Cfigure-protocol-8。数值为1表示完美的圆形，而接近0的数值则表示形状越来越细长。
  9. 通过菜单“图像>堆栈>Z 投影”创建Z堆栈的最大强度投影。将投影类型设置为“最大强度”。
  10. 拆分通道并选择核标记物通道。
  11. 从主菜单中选择“图像>调整>阈值”。
  12. 通过调整强度阈值对细胞核进行分割。如果相邻的细胞核被分割为单一单元，请点击“处理>二值化>分水岭”工具以分离细胞核。
  13. 从主菜单中选择“编辑>选择>创建选区”。
  14. 通过点击菜单“分析>工具>ROI 管理器”，将所有选定的感兴趣区域（ROI）添加到 ROI 管理器中。在 ROI 管理器窗口中点击“添加”，然后在同一窗口中选择“更多 > 拆分”。
  15. 在“分析>设置测量”中选择“形状描述符”。在 ROI 管理器窗口中点击 “测量”选项卡。这将显示所有选定细胞核的圆形度数值列表。
  16. 此外，为测量细胞核体积，请按照第7.3–7.7小节所述，使用核标记物染色通道运行表面创建向导。

8. 所选细胞核的三维体积重建 果蝇 利用幼虫体壁肌肉评估特定蛋白的核内定位

  1. 使用报告体壁肌肉的共聚焦图像，这些肌肉经核标记物以及特异性针对lamin和DVAP的抗体染色。
  2. 启动软件并打开图像，选择需要分析的特定细胞核。可通过选择主菜单中的“编辑”＞“裁剪3D”来完成。
  3. 按照第7.3–7.7小节所述，使用lamin通道进行表面创建向导操作。
  4. 表面创建完成后，点击“对象属性区域”中的“编辑”，然后选择“遮罩全部”，以分离细胞核内部的信号。此时将创建一个新窗口。
  5. 从“选择通道”下拉菜单中选择DVAP信号。通过点击“将表面外部体素设为零”选项，选择细胞核内部的DVAP免疫反应信号。此时将生成一个新的遮罩通道，并可在显示调节窗口中进行选择。
  6. 为可视化细胞核内部信号的存在，可在“对象工具栏”中点击“添加新裁剪平面”图标 figure-protocol-9，创建一个轮廓平面。      
  7. 交互式调整裁剪平面的角度和位置，以观察细胞核内信号的分布情况。

结果

肌萎缩侧索硬化症是一种选择性累及运动神经元的退行性疾病，导致骨骼肌进行性、致命性瘫痪7人类VAMP相关蛋白B（hVAPB）的错义突变可导致一系列运动神经元疾病，包括肌萎缩侧索硬化8型8-12在人类典型肌萎缩侧索硬化症（ALS）的一例病例中， recently 发现 hVAPB 基因存在错义突变（V234I）13为了评估其致病潜力，我们构建了表达hVAPB的转基因果蝇 果蝇 携带致病突变的同源基因 DVAP（DVAP-V260I）。利用 UAS/GAL4 系统和肌肉特异性驱动子 BG57-Gal4，将该转基因的表达靶向定位于肌肉组织14,15将DVAP-V260I转基因表达的效果与另外两个转基因（DVAP-WT1和DVAP-WT2）进行比较，后者表达不同水平的野生型DVAP蛋白16更具体而言，DVAP-WT2 品系中 DVAP 免疫反应性的增加是对照组的 2.2 倍，而 DVAP-V260I 和 DVAP-WT1 品系则表现出相对可比且较低的相同信号水平。16.

细胞核的改变与衰老及多种神经退行性疾病（包括帕金森病17,18）相关。为了评估我们的ALS8果蝇模型是否出现细胞核结构、位置和大小的变化，我们使用核标记物和抗核纤层蛋白抗体19-22对具有适当基因型的横纹肌内的细胞核进行染色，后者可显示核膜结构。为突出显示肌肉，还在同一样本中加入了DVAP特异性抗体（图1）。通过共聚焦显微镜采集图像，并使用图像分析软件进行详细的形态计量分析。在对照组肌肉中，细胞核沿肌纤维均匀分布；而在表达DVAP-V260I和DVAP-WT的肌肉中，细胞核则倾向于重新分布，形成紧密聚集的簇状结构（图1）。

我们进行了最近邻分析，以对每种基因型的肌纤维中细胞核分布情况进行定量评估。最近邻分析首先通过测量某一特定细胞核中心与其他周围所有细胞核中心之间的距离，来确定该细胞核的最近邻细胞核。此过程随后在肌纤维上的其他所有细胞核中重复进行。最后，通过计算每个细胞核与其最近邻细胞核之间最短距离的平均值，得出特定肌肉中细胞核间的最短距离（图2A–C）。与对照组相比，表达DVAP-V260I转基因或任何过表达野生型蛋白转基因的肌肉，其细胞核间的平均最短距离显著减小，因此细胞核呈现出紧密聚集的簇状分布。导致肌萎缩侧索硬化（ALS）的等位基因DVAP-V260I所造成的影响比野生型蛋白过表达更为严重，即使使用最强的DVAP-WT2转基因也是如此（图1和图2D）。

过表达 DVAP-V260I 或 DVAP-WT 转基因均表现出严重的核结构恶化，导致细胞核变形，呈现拉长的形态（图1）。该结构异常通过 ImageJ 软件进行量化分析，其中圆形度（C）由公式 Cfigure-results-1 定义，用于测量每个细胞核的宽长比，C = 1 表示完美的圆形，C = 0 表示无限拉长的多边形。在呈现明显圆形的对照组细胞核中，C 值等于 1；而在转基因突变体中，细胞核形态发生改变，伴随圆形度的丧失，导致该数值显著偏离 1（图1 和 图3）。

我们还发现，在表达相同转基因的肌肉中，细胞核的核体积明显大于对照组，尽管与DVAP-WT转基因相比，导致ALS的等位基因在诱导该表型方面似乎效率更高（图4）。

几乎所有神经退行性疾病都以细胞内病理性蛋白聚集体的积聚为特征。我们对细胞核进行了三维重建和体积渲染，发现表达突变转基因或过表达野生型蛋白的肌肉中，DVAP 免疫反应性会形成簇状结构，其中部分簇状结构定位于细胞核内（图 5）。相反，在对照组神经肌肉接头中，DVAP 免疫反应性在肌纤维中呈微弱弥散分布，且不进入细胞核16。

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图1：表达DVAP-WT或DVAP-260I转基因的横纹肌中肌核的共聚焦图像。 （A）BG57-Gal4/+ 对照，（B）BG57;DVAP-V260I，（C）BG57;DVAP-WT1 和（D）BG57;DVAP-WT2 肌肉组织表达指定的转基因，使用特异性识别DVAP（红色信号）、lamin（绿色信号）的抗体以及特异性标记细胞核的核标记物（蓝色信号）进行染色。比例尺 = 30 µm 请点击此处查看该图的放大版本。

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图2：通过最近邻分析确定细胞核与其最近邻细胞核之间的平均距离。（B）代表性结果显示，在过表达DVAP-WT2转基因的肌肉中，细胞核定位发生改变，与（A）中的对照组相比存在差异。使用（C）中的公式估算指定基因型肌肉中的平均细胞核间距，数据展示于（D）。幼虫神经肌肉接头用特异性针对DVAP（红色信号）、lamin（绿色）以及细胞核标记物（蓝色信号）的抗体进行染色。星号表示统计学显著性差异。***P <0.001，**P <0.01。本实验及以下所有实验的统计分析均采用单因素方差分析（one-way ANOVA），当ANOVA检验发现基因型间差异具有显著性时，进一步采用Tukey多重比较检验作为事后检验。误差线表示标准误（SEM）。比例尺 = 30 µm 请点击此处查看该图的放大版本。

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图3：显示核体积计算过程中代表性步骤的图像。 (A) 使用表面创建向导对细胞核进行分割的代表性图像。忽略位于图像边界的细胞核。(B) 显示在利用细胞核标记通道生成的表面屏蔽周围DVAP染色信号后，细胞核的DVAP信号图像。(C) 表面层提供包括细胞核体积和球形度在内的其他参数信息。(D) 不同基因型细胞核体积的数据。星号表示统计学显著性。解剖的神经肌肉接头用抗DVAP抗体（红色信号）、抗lamin抗体（绿色信号）以及细胞核标记物（蓝色信号）染色。***P <0.001，**P <0.01。误差线代表标准误（SEM）。比例尺 = 30 µm 请点击此处查看该图的放大版本。

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图4： 使用ImageJ评估细胞核形态的代表性步骤示意图。  采用ImageJ分析图像的最大强度投影，以评估肌肉中细胞核的圆形度。(A) 协议中第7.9步所示的三通道图像强度投影的代表性示例。(B) 显示协议第7.10步的图像，其中通道被分离，并选择细胞核标记通道。 (C) 代表性图像显示，在应用强度阈值分割细胞核并使用ImageJ中的ROI管理器插件后，可选中所有感兴趣的细胞核，并通过“形态描述符”测量其形态（步骤7.11–7.15）。(D) 不同基因型细胞核圆形度的定量分析。在幼虫神经肌肉接头处，红色信号代表DVAP染色，绿色轮廓标记细胞核，对应于lamin染色。每个细胞核内部因细胞核标记物染色而呈蓝色。星号表示统计学显著性。***P <0.001，**P <0.01。误差线表示标准误（SEM）。比例尺 = 30 µm 请点击此处查看该图的放大版本。

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图5：生成肌核体积渲染图像过程中的特定步骤示意图。（A）显示用DVAP蛋白（红色）、核纤层蛋白（绿色）和DNA标记物（蓝色）染色的肌肉的三维强度融合视图图像。（B）使用核纤层通道分割细胞核所生成的表面层图像。（C）显示一个细胞核，其中已使用表面层遮蔽所选细胞核外部的DVAP信号。图像中用黄色高亮显示添加的切割平面，其视角和位置可交互调整，以观察信号在细胞核内部的分布情况。（D）报告核表面层的横截面视图图像，该表面层由核纤层通道生成，并与未遮蔽的DVAP信号及核标记信号合并。（E 和 F）同一细胞核的其他切片体积渲染图像。比例尺 = 10 µm 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

过去，实验组内及组间的形态学变异很少被纳入考虑。然而，如今在形态学比较研究中，定量方法的应用正逐渐成为常态，解剖结构的数学描述也得以计算。在评估基因操作对特定细胞过程的影响时，采用定量分析有望提升我们检测形态学变化的能力，并提高描述这些变化的准确性。此外，对定量数据进行统计学分析，可使我们评估表型间观察到的差异是否具有显著性。

在横纹肌中，细胞核具有明显的圆形结构，并沿肌纤维均匀分布。尽管建立和维持细胞核大小、形状及结构的分子机制尚不清楚，但这些细胞核特征可能在调控肌肉功能中起着基础性作用。事实上，多种肌病是由调控肌肉内细胞核形态和位置的基因突变所引起的。细胞核形状及其在细胞内的分布功能重要性不仅局限于肌肉组织。越来越多的证据表明，细胞核缺陷也与帕金森病等神经退行性疾病相关18,24。此外，我们逐渐认识到，其他细胞器（如内质网和线粒体）的形态、大小及细胞内分布也可能具有重要的功能影响。例如，线粒体形态的改变与视神经萎缩症1型（OPA1）和腓骨肌萎缩症2A型神经病等神经系统疾病相关25。

为了帮助阐明这些重要过程背后的分子机制，我们提出将高分辨率共聚焦成像数据与图像分析软件及形态计量学分析相结合，以定量评估基因操作如何影响肌纤维内细胞核的形态、大小和位置。Drosophila 遗传学的强大功能与灵活性，以及 Drosophila 幼虫神经肌肉系统的高度保守特性，使得幼虫神经肌肉接头（NMJ）成为此类分析尤为理想的实验模型。在幼虫 NMJ 处，表型分析可在单个突触水平上进行，从而实现精确的形态计量学分析，可在同一只果蝇内研究多个 NMJ，甚至可在不同基因型的果蝇之间比较同一可识别的 NMJ3,4。

细胞核位置、形态和大小的表型表征 黑腹果蝇 幼虫神经肌肉接头（NMJ）的分析首先对解剖得到的NMJ进行免疫染色，使用可标记肌肉及肌内细胞核的抗体。在本文所述方案中，肌核通过抗lamin多克隆抗体进行染色，lamin是核膜的标志物，同时结合用于标记核内区域的核标记物，以及特异性识别DVAP的抗体以标记整个肌肉。本实验所用的抗lamin抗体由Paul Fisher惠赠。19-22 但也可使用其他来源的抗核纤层蛋白抗体。此外，目前市面上有多种针对核膜的特异性抗体可供选择。最后，还可利用DAPI和碘化丙啶等核标记物对细胞核进行标记，而肌肉组织则可通过抗肌动蛋白或抗微管蛋白抗体染色实现可视化。若使用本实验方案中未包含的其他抗体，则免疫染色步骤需要额外优化，包括调整新抗体的固定条件和工作浓度。本方案中的一个关键步骤是将样品封片于载玻片上，尤其是在需要进行三维体积成像分析时尤为重要。此时，必须在载玻片与盖玻片之间加入间隔物，以防止样本被压碎。一种简便的制作间隔物的方法是在盖玻片两侧的载玻片上各缠绕三条纤维素胶带。

尽管ImageJ被用于二维图像分析，但本文中大多数三维多通道图像分析是利用Imaris完成的，因为该软件可内部获取。然而，任何其他类似的商业软件包也可用于这些应用。

目前有多种可用于共聚焦图像分析的开源（例如 ImageJ、CellProfiler、Vaa3D、Icy、KNIME 及其他）和商业软件平台。由美国国立卫生研究院（NIH）开发的免费软件 ImageJ26，或其功能增强版本 FiJi27，为全球成像社区提供了大量可用的导入滤镜、宏和插件。这些插件大多专注于逐层处理图像信息。此外，也有可用于多通道三维图像可视化与分析的插件。然而，这些插件通常针对特定任务设计，用户可能需要根据自身需求对其进行扩展或调整。另一方面，商业平台主要面向经验较少的用户，通常强调易用性、广泛的图像处理功能覆盖以及极高的处理速度。

本实验方案中所述的实验操作及定量表型分析，有助于阐明调控细胞器形态及其在细胞内分布的分子机制。然而，该方法存在明显局限性，即仅能在特定终点进行分析。调控细胞器形态与分布的过程可能具有高度动态性，不仅在不同细胞类型之间存在差异，甚至在同一细胞内也会因其发育或生理状态的不同而发生变化。对该分析方法的进一步改进可采用延时成像技术，从而实现对细胞器形态和位置随时间变化的动态监测。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢Andrea Chai博士对本文手稿提出的深刻见解。本工作由惠康信托基金（资助编号：Pennetta8920）和运动神经元疾病协会（资助编号：Pennetta6231）提供支持。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.3 mm × 0.25 mm 微型镊子Fine Science Tools 11030-12
硅胶解剖板 SIGMA-ALDRICH76103将预称量的弹性体基质与固化剂混合。将混合物倒入直径为 5 cm 的培养皿中，在 60 °C 下固化至少 24 小时
直径 0.1 mm 不锈钢 minutien 针Fine Science Tools 26002-10
显微解剖剪刀（超精细） Fine Science Tools 15200-00
1× PBS（磷酸盐缓冲盐水）。成分：3 mM NaH2PO4、7 mM Na2HPO4、130 mM NaCl，pH 7NaH2PO4（SIGMA-S8282）、Na2HPO4（SIGMA-S7907）、NaCl（SIGMA-S7653）
Bouin 氏液。成分：苦味酸、甲醛、乙酸（15:10:1）苦味酸（SIGMA 197378）、甲醛（F8775）、乙酸（SIGMA-1005706）
1× PBT（含 Triton 的磷酸盐缓冲盐水）。1× PBS + 0.1% Triton Triton-X100，SIGMA-T8787
正常山羊血清 SIGMAG9023
豚鼠抗 DVAP 抗体由英国爱丁堡大学 Giuseppa Pennetta 博士提供。使用时以 5% NGS 稀释至 1:200
兔抗 HRP（辣根过氧化物酶）抗体Jackson ImmunoResearch123-065-021使用时以含 5% NGS 的 PBT 稀释至 1:500
兔抗 Lamin 抗体由美国纽约州立大学石溪分校 Paul Fisher 博士提供。使用时以含 5% NGS 的 PBT 稀释至 1:500 
TO-PRO-3Molecular ProbesT3605
山羊抗兔抗体，Alexa Fluor488 标记Jackson ImmunoResearchbs-295G-A555-BSS使用时以含 5% NGS 的 PBT 稀释至 1:500
山羊抗豚鼠 IgG 抗体，Cy3 标记Jackson ImmunoResearchbs-0358G-Cy3-BSS使用时以含 5% NGS 的 PBT 稀释至 1:500
荧光封片用 Vectashield 封片介质Vector laboratoriesH-1000

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DeVAP Lamin

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