为什么量化事项:表型的表征在果蝇幼虫神经肌肉接头

定性分析将大多数实验研究的重点限制在检查导致大表型效应的基因作或不适合量化的表型，例如不存在/存在。通常不进行表型的量化，并且不考虑表型组成员中存在的变异。此外，如果没有形态学的数学描述，可能很难确定精细的表型变化是遗传诱导改变的结果，还是观察到的变化仅仅是由于随机波动。

我们建议，为了准确、公正地分析由于基因破坏引起的表型缺陷，定量方法应该伴随着更传统的定性方法。表型的定量评估对于突触等结构特别有益，这些结构由于其固有的形态和功能可塑性而呈现出高度的可变性。我们选择了应用于我们最熟悉的研究领域的定量分析示例，即果蝇幼虫神经肌肉接头 （NMJ）。然而，概念和原理同样适用于其他实验系统。

幼虫 NMJ 是研究突触发育和功能的优秀模型系统，因为它的结构高度刻板。幼虫神经肌肉系统的每个半节段包含 32 个可识别的运动神经元，这些神经元与突触后靶肌形成突触接触。每个半节段还包含固定数量的肌肉，可见为附着在角质层内表面的多核纤维¹。使用幼虫神经肌肉系统的另一个优势是果蝇遗传学的强大功能和多功能性，它很容易产生许多突变等位基因，并有可能以时间和组织限制的方式修饰基因表达。最后，75% 导致疾病的人类基因在果蝇² 中具有进化上保守的直系同源物。事实上，果蝇和人类之间的整个遗传途径都是保守的。正因为如此，果蝇幼虫神经肌肉系统是一种非常流行的实验模型，用于阐明包括肌萎缩侧索硬化症 （ALS） 在内的许多人类疾病的分子机制¹。

在这里，我们表明几种可靠的免疫组织化学标志物的可用性，结合生物成像技术和准确的形态测量分析，可以描述可能发挥重要功能作用的解剖特征^3,4,5。在适合定量分析的细胞过程中，我们关注细胞内结构（如细胞核）的形状、大小和位置的变化。所有这些都是我们知之甚少的过程。

分子遗传学家在未来几十年面临的挑战将是，通过分析产生非常细微表型缺陷的基因突变的影响来扩展我们目前的知识。允许研究人员仔细探索基因突变影响的定量方法可以更全面地了解基因型与表型的关系，特别是对于知之甚少的细胞过程。

1.实验准备

注意:夹层动脉瘤和在第2免疫组织化学程序和3是根据参考文献^3-6进行的，但具有修改。

1. 制备1×磷酸盐缓冲盐水（PBS）和含有0.1％的Triton-X 100的PBS（PBT）。让他们在冰上。
2. 制备布安的固定液（15苦味酸:10甲醛:1冰醋酸）。使这种试剂新鲜。
3. 选择干净的不锈钢minutien销和细镊子。
4. 准备含5cm的培养皿的Sylgard盘夹层板。

2.第三龄幼虫NMJs剖析

1. 从这里选择小瓶或用细刷瓶流浪三龄幼虫，并将它们放到含有4℃PBS洗涤残留的食物客场2厘米的培养皿。
2. 放置在夹层板的SYLGARD表面的最上面的一个幼虫并确保它是POSITIoned其背侧，使得两个纵向气管导管是在顶部可见。
3. 使用镊子保持销，销的幼虫向下在其前端，右下嘴钩。舒展幼虫出尽可能多地和引脚及其后端下来。
4. 添加足够的PBS盐水到达板的壁和完全沉浸幼虫。
5. 重复从步骤2.1的方法，以2.3的相同基因型的其他幼虫。单5厘米培养皿夹层板可以轻松容纳多达8个幼虫。
6. 使用显微解剖剪，微微抬起背侧角质层并在销附近的后端使一小的水平切口。
7. 插入剪刀入切口，切开幼虫一路沿着气管的两个纵向束之间的中线的前端。确保中线削减足够的肤浅，只是通过角质层，避免通过肌肉切腹侧。
8. 在每一端，切断左侧和右两侧两个槽口。
9. 通过把两个引脚上的前切口两侧打开圆角。重复与后端相同。当将针，一定要掰开体壁。
10. 清理出使用镊子和PBS液内脏。离开中枢神经系统完好无损。轻轻地用针角落伸展幼虫直到完全伸展，但要确保肌肉不会在此过程中撕裂。
11. 重复同样的解剖程序在同一夹层板其他幼虫。
12. 用PBS盐水洗涤三次以除去所有的内部器官。
13. 与布安固定液更换PBS，在室温下放置10分钟。
14. 与PBT洗几次。
15. 小心取出针和各项准备工作，目前已相当严格，转移到了免疫染色1.5 ml的微离心管中。

用特异性抗体肌肉和肌细胞核果蝇 NMJs 3.免疫组织化学染色

1. 快速漂洗PBT幼虫鱼片。
2. 通过用在PBT中的10％正常山羊血清（NGS）孵育下恒定搅拌2小时阻断制剂。
3. 孵育在含有NGS的5％，和兔抗核纤层蛋白抗体（以1:1的浓度:500）的PBT一套解剖NMJs的并用豚鼠抗DVAP抗体（以1:1的浓度:500）2小时在室温下，或在4ºC过夜。而抗拉明染色检测肌细胞核的轮廓抗DVAP抗体染色的横纹肌。
4. 洗一次迅速PBT除去过量的抗体。通过改变PBT缓冲每15分钟洗在PBT中2小时。
5. 孵育样品在含有PBT的5％NGS和荧光标记的二抗以1:在室温下500稀释2小时。相同的样品C一个受到与在同一时间的多个抗体染色，如果具有不同的发色团共轭次级抗体用于。
6. 除去次级抗体和通过改变PBT缓冲每15分钟在PBT中洗涤2小时。
7. 染色内部的肌细胞核洗样品三次，用PBS和步骤如下:
   1. 在PBS 1000和孵育在搅拌条件下20分钟:添加核标记TO-PRO-3以1:1的稀释度。该标记物在该研究中使用，但任何其他市售的核标记物可以用作良好。
   2. 安装前应清洗在PBS快三倍。

4.在幻灯片上安装样本

1. 从1.5毫升微量离心管钳挑样品起来，躺在下来在处理幻灯片。
2. 通过使用显微解剖剪，切头和圆角的尾部，并保持其内部表面上。
3. 日准备e。通过以约1厘米的相互距离在一个干净的幻灯片的每一侧纤维素带的三个板条缠绕安装滑动。一旦盖玻片被定位在两个条的顶部，间隙将生成，这将避免样品的平坦化。这是至关重要的，如果结构的三维体积渲染要制成。
4. 把约20微升所述安装平台的一小滴在三纤维素带条之间的安装滑道的中间。
5. 推广用干净的镊子安装介质后，拖动解剖幼虫到安装滑入安装介质，保持内表面的。尝试装入他们的四个或五个行。
6. 轻轻地砸在安装滑道顶部盖玻片，并确保没有气泡产生。密封透明指甲油的幻灯片。让试样干燥成像前至少10分钟。

5.设置共聚焦成像

注:电子倒置显微镜:在本研究中呈现的图像是使用集成到钛尼康A1R共聚焦单元拍摄。然而，用最少的在488纳米，561纳米和642纳米和一个3通道的检测系统的波长区域的3-激光单元的任何共聚焦显微镜是适合于该目的。

1. 接通激光器，探测器单元，汞灯泡，舞台控制器，显微镜和电脑。启动控制软件和安全在舞台上持有人的幻灯片。
2. 为了使成像速度，选择并通过使用20X物镜标记的样品上感兴趣区域（ROI）中的所有区域。
3. 仔细摆动物镜转换器的60X高倍物镜（60X计划阿婆VC / NA 1.4 OIL）。
4. 放置浸油下降到物镜，然后从XYZ概述窗口在计算机上的标记的ROI中的一个。
5. 通过使用下面的光学设置启动成像:选择第一分色镜:48分之4058/561/640。选择488nm的激光发射滤波器在信道1，561 nm激光器在信道2和642纳米的激光五十零分之五百九十五发射滤波器与信道3个长通滤波器650纳米525/50纳米。
6. 启动图像采集之前，请使用以下扫描设置:选择电扫描器;扫描方向:一种方式;扫描速度:每秒0.5帧。
7. 选择频道系列，以避免渠道流失通。
8. 调整针孔大小为1通风装置。扫描和调整激光功率，检测增益并适当地偏移对每个信道，以避免像素饱和度和背景水平。
9. 通过使用体素尺寸0.2×0.2×0.5微米³为所有感兴趣区和滑动制剂获得的z栈。如果图像将经受卷积然后设置体素尺寸，以0.06×0.06×0.15微米^3。
10. 保存.nd2文件格式或的.ics格式的图像。

6.计算之内横纹核之间的距离60，肌肉由最近邻分析方法

1. 对于这种分析，使用共焦图像显示与DVAP抗体可视化的肌肉和与核纤层蛋白的抗体和核标记来突出细胞核染色的幼虫体壁肌肉。
2. 为了估计原子核之间的最近距离，使用图像分析软件（ 如了Imaris）的MeasurementPro模块内测量点。用于图像分析其它类似的软件应用程序可以被用于相同的目的。
3. 打开共聚焦图像。要启动，软件图标双击。拖动和共聚焦Z堆栈图像拖放到竞技场。
4. 在图像上双击在超越视图中自动打开它们，菜单工具栏图标下 。该超越观主要有三个工作区面板:查看区域，对象列表和对象属性区。
5. 创建一个卷呈现Ť通过点击菜单图标3D视图重稀土通道图像 。
6. 点击添加新的测量点图标来自 对象工具栏并按照出现在对象属性区创建向导。
7. 从创建向导首先选择编辑选项卡，然后特定通道。选择核标记或核纤层蛋白通道突出核。
8. 通过按下键盘上的ESC选项卡中设置的指针选择模式。
9. 调整3D光标框的大小与鼠标滚轮以包含在图像中的给定核。通过举办同一核Shift键并点击鼠标左键添加一个测量点。
10. 通过重复前面的步骤中添加上的相同肌肉附近的核的第二点。一条线是在两个点之间的距离测量之间的自动绘制被显示在两个细胞核。这两个核之间的距离，现在被记录为对象属性区域标签下的统计>详细>距离数据的统计变量。
11. 从重复步骤6.6步骤6.10围绕给定的所有核细胞核。
12. 从统计>详细>距离数据显示所有收集到的测量点，选择最短的距离。
13. 通过单击导出统计上的标签显示到文件对象属性区下提供的数据将被保存在一个电子表格。
14. 重复同样的程序为其它周围细胞核和为每基因型肌纤维的选定数量。
15. 使用导出到电子表格文件中的数据，计算使用下列公式肌肉的所有M个的平均最短距离（D _AVE）:
    OAD / 53821 / 53821eq1.jpg"/>
    二是对于给定的核其中i从0变化到N，N是每块肌肉分析核数目相邻核的最短距离。从j值的总和= 0到j = m表示分析肌肉的M个。
16. 另外，使用 斑点创建向导和斑点到斑点最近距离来估计到最近的相邻核的平均距离。为此，需要一个Matlab扩展模块。
    1. 关于竞技场和3D容量图像一个特定的图像，双击将显示在查看区域。点击对象创建图标，并添加新景点从对象工具栏。
    2. 从对象属性区创建向导，点击选择跳过自动创建，编辑手动。
    3. 选择的核纤层蛋白或核标记物通道，以显示细胞核。
    4. 按住Shift键并单击LEF对图像中的特定肌肉的所有核吨鼠标按钮。每个核的点就会出现。
    5. 选择斑点斑点在对象属性区域的工具选项卡中列出最近的距离。出现的结果模式和Matlab的窗口下选择景点统计。
    6. 根据统计选项卡，选择Detailed，然后具体数值。点击Distmin并为每核的最小距离的值将出现。
    7. 将数据导出到电子表格文件，并计算出每肌肉这些距离的平均值。重复该过程对于一个给定的基因型的所有肌肉。

7.确定果蝇幼虫的体壁肌肉内的细胞核形态

1. 对于这种分析，请使用核纤层蛋白和核标记以可视化的细胞核染色体壁肌肉的共聚焦图像。
2. 来评价肌细胞核，测量球形的形状（定义为的河畔的比率与同体积的给定核一个球体，以核的表面积）或椭圆（的面部区域扁圆/扁长椭球和球状体）进行了区分。
3. 如前所述打开图像。点击对象工具栏图标添加新面 。
4. 在出现的对象属性区创建向导中，选择核标记染色来源渠道，以显示细胞核。
5. 设置选项绝对强度为阈值。确保大部分核的表示由阈值曲线上改变的值的平滑和不超载渲染。同时，使用相同的曲线避免孔或不完整的掩模的存在的任何核。
6. 使用 过滤工具排除在表面呈现的任何噪声。在新创建的表面层，斯普利特的编辑选项卡或合并是错误的重原子核表面ndered。
7. 导出到电子表格文件表面呈现核是统计标签下的椭圆球形和价值观。
8. 或者，使用ImageJ的或斐济软件来测量核的圆度，其中圆形度（C）被定义为C 。一项的值代表一个完美的圆，而接近零值表示一个逐渐拉长的形状。
9. 创建菜单图像>栈>以Z项目的Z堆栈的最大强度的预测。设置投影类型最大强度。
10. 拆分渠道和选择核标志的通道。
11. 从主菜单中，选择图像>调整>阈值。
12. 段的核通过调整强度阈值。如果附近的核被分割为单个单元，点击处理>二进制>分水岭工具断开细胞核。
13. 从主菜单中，选择Edit>取值选>创建的选择。
14. 通过点击菜单上的分析>工具> ROI管理器添加所有选定的投资回报的投资回报率经理。在ROI管理器窗口中单击添加。在同一个窗口中，选择更多>分割。
15. 选择分析>设置测量形状描述。在ROI管理器窗口中点击标签 测量。这将显示所有选择的核的圆的值的列表。
16. 此外，为了测量核体积，使用如在小节7.3-7.7中描述的核标记物染色通道遵循表面创建向导。

在果蝇幼虫体壁肌肉内的核选择8. 3D体渲染到评估特定蛋白质的核内本地化

1. 利用共聚焦图像与申报核标志物，并与特定的核纤层蛋白和DVAP抗体染色体壁肌肉。
2. 通过启动软件和SEL打开图像待分析等的特定核。这可以通过选择主菜单项编辑>作物3D来完成。
3. 使用如第7.3-7.7描述拉明频道关注表面创建向导。
4. 一旦表面被创建，在对象属性区域点击编辑，然后选择屏蔽所有的细胞核内的信号隔离开来。这将创建一个新的窗口。
5. 从选择通道下拉菜单中选择DVAP信号。通过点击选项设置体素外表面零选择细胞核内的DVAP免疫反应信号。一个新的掩码通道被创建，并在选择显示器调整窗口中。
6. 以可视化的细胞核内信号的存在通过点击图标添加新的裁剪平面创建一个平面轮廓从对象工具栏。
7. 交互式调整剪裁的角度平面和其可视化的核内的信号的分布位置。

ALS是专门影响运动神经元导致横纹肌7的渐进和致命性瘫痪退行性疾病。在人类VAMP相关蛋白B（hVAPB）错义突变导致一系列运动神经元疾病，包括ALS 8型8-12。在hVAPB基因的错义突变（V234I）已在人类13 ALS的典型一例最近已确定。评估其致病潜力，我们产生表达hVAPB 果蝇直向同源物DVAP携带致病突变（DVAP-V260I）的转基因苍蝇。这种转基因的表达被靶向使用UAS / GAL4系统和肌肉特异性驱动BG57-Gal4的14,15的肌肉。 DVAP-V260I转基因表达的影响进行比较和对比于其他两种转基因（DVAP-WT1和DVAP-WT2），其表达不同水平的野生型DVAP蛋白16的。莫尔ê具体地，在DVAP免疫反应的增加比为DVAP-WT2线控制2.2倍高，而相同的信号16的DVAP-V260I和DVAP-WT1展览可比和更低的水平。

核的改变已经与衰老和几种神经变性疾病，包括帕金森氏病17,18相关联。为了评估我们的ALS8蝇模型是否表现出核架构，位置和大小的变化，我们的适当基因型横纹肌内染色的核具有核标记物和抗核纤层蛋白抗体19-22，其中可视化核膜。以突出的肌肉，特定DVAP抗体也被加入到同一样品（ 图1）。共焦图像收集和使用图像分析软件进行详细形态分析。在控制的肌肉，发现核沿着肌肉均匀分布纤维而在DVAP-V260I和DVAP-WT表达肌肉，细胞核表现出以重新分布密切相关的簇（ 图1）的倾向。

我们进行了最近邻分析来执行核的沿着每一基因型的肌纤维的分布的定量评价。最近邻分析，通过测量给定核的中心，并且每个其他的周边核的中心之间的距离的第一识别用于每个核的最接近的邻居。然后重复该过程沿着肌肉纤维隔核。最后，一​​个特定的肌肉内原子核之间的最短距离，通过平均每个核和其最近的邻居的最短距离来计算。 （ 图2A - C）。与对照组相比，肌肉表达任DVAP-V260I转基因或任何转基因过表达的野生型蛋白的中，存在于细胞核之间的平均最短距离的显着降低，并且作为结果，核似乎在簇密切相关。所述的ALS引起等位基因DVAP-V260I效果比，与野生型蛋白质的过表达有关的更严重，即使最强DVAP-WT2转基因时（ 图1和图2D）。

要么DVAP-V260I或DVAP-WT转基因的过表达也显示出核架构造成与一个细长结构（ 图1）变形核严重恶化。这个结构畸变是通过使用其中圆形度由式C所限定的的ImageJ软件定量 ，衡量的宽度与C = 1代表一个完美的圆和C = 0无限拉长的多边形每个核的长度的比值。在对照醇细胞核表现出明显的圆形状，C等于1，而在转基因突变体形状的改变与圆的因此而丧失，导致从该值（ 图1和图3）一个显著偏差。

我们还发现，在表达相同转基因的肌肉，细胞核与对照相比显示一个标记放大核体积，虽然ALS引起等位基因的似乎是诱导这种表型相比，DVAP-WT转基因（ 图4）更有效。

几乎所有的神经变性疾病是由含有致病蛋白质聚集体的细胞内积累为特征。我们做了三维重建和核的体积渲染和我们发现，在肌肉表达突变体转基因或过表达野生型蛋白质，DVAP免疫反应形成簇第二，其中一些也被本地化为核（ 图5）。相反，在控制NMJs，DVAP免疫反应是微弱地分散在整个肌肉纤维，并从核16排除。

图1:横纹肌表达任DVAP-WT或DVAP-260I转基因内肌细胞核的共聚焦图像 （A）的BG57-Gal4的/ +对照，（B）的BG57; DVAP-V260I;（C）BG57; DVAP-WT1和（D）BG57;表达所指示的转基因DVAP-WT2肌肉染色与特异于DVAP（红色信号），核纤层蛋白（绿色信号），并用一个核特异性标记物来可视化的细胞核（蓝色信号）的抗体。比例尺= 30微米请点击这里查看更大的版本这个数字。

图2:最近邻居分析来确定核和其单最近的邻国之间的平均距离 （B）代表性的结果显示肌肉过度表达DVAP-WT2基因改变核的定位相比，在（A）的控制。在指定基因型的肌肉平均核距离用下式（C）中，估计和数据（D）中被报告。幼虫NMJs沾满特异性DVAP（红色信号），核纤层蛋白（绿色）的抗体，并用核标记（蓝色信号）。星号表示统计显着性。 *** P <0.001，** P <0.01。对这个实验的统计分析，并使用报告低于一个单向ANOVA测试的所有实验以及Tukey的MULTIP勒对比试验涂布作为事后测试时发现的基因型之间的差异是由ANOVA检验显著。误差棒表示SEM。比例尺= 30微米请点击此处查看该图的放大版本。

图 3: 照片显示，在核体积的计算步骤代表 （A）的代表图像显示使用表面创建向导分割核。在图像的边界细胞核被忽略了。 （B）中示出了周边DVAP染色后核DVAP信号的图像已经通过使用在核标记信道创建的表面屏蔽。 （C）表面层提供的附加 ​​参数信息包括核体积和球形。不同基因型的核体积（D）的数据。星号表示统计显着性。解剖NMJs用抗DVAP抗体（红色信号），抗核纤层蛋白抗体（绿色信号）和核标记（蓝色信号）染色。 *** P <0.001，** P <0.01。误差棒表示SEM。比例尺= 30微米请点击此处查看该图的放大版本。

图4: 图像显示在核形状由ImageJ的估计代表性的步骤。   使用ImageJ肌肉内估计核圆图像的最大强度投影进行了分析。 （ 一 ）密度投影的一个代表性的例子作为该协议的步骤7.9三个通道图像。 （B）中示出，其中信道被分割的协议和核标记信道的步骤7.10的图像被选择。 示出在ImageJ的施加强度阈值，以段细胞核和ROI经理插件后，所有感兴趣的核可以选择和它们的形状，通过形状描述符测定（℃）的代表性图像（步骤7.11-7.15）。不同基因型的圆度（D）量化。上幼虫NMJs，红色信号指示DVAP染色而绿色概述核并对应于拉明染色。每个核的内部被标记为蓝色由于与核标记在染色。星号表示统计显着性。 *** P <0.001，** P <0.01。误差棒表示SEM。比例尺= 30微米请点击她的E要查看此图的放大版本。

图5:图像显示在创建肌细胞核的体积渲染的具体步骤 。 （A）显示3D图像的强度混合视图与DVAP蛋白（红色），核纤层蛋白（绿色）和DNA标记（蓝色）染色的肌肉。 （B）表示通过使用拉明信道段的原子核产生的表面层的图像。 （C）表示，其中表面层已被用来掩盖所选择核外DVAP信号的核图像。以黄色突出显示的是已被添加到图像的剪取平面。其视和位置角可以交互调节到可视信号的细胞核内的分布。 （D）的一种图像报告了核表面层产生USI的剖视图NG的核纤层蛋白通道与非屏蔽DVAP和核标记信号合并。 （E和F）相同的细胞核的附加 ​​切片体积渲染。比例尺= 10微米请点击此处查看该图的放大版本。

作者没有什么可透露的。