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通过分化与凋亡稳态调节成年生物体脂肪细胞数量的机制

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DOI：

10.3791/53822

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2016年6月3日

 , 
1Department of Medicine 3, Rheumatology and Immunology, Universitätsklinikum Erlangen, 2Nikolaus Fiebiger Center of Molecular Medicine, Universitätsklinikum Erlangen

本文内容

摘要

脂肪组织（AT）可影响机体全身的稳态，因此了解脂肪细胞分化与功能的分子机制具有重要意义。本文提供了一种实验方案，通过分析脂肪细胞的稳态、分化过程以及缺氧暴露（作为诱导脂肪细胞凋亡的模型），以深入理解这些生物学过程。

摘要

考虑到脂肪组织（AT）是一种内分泌器官，它能够影响全身代谢。过度的能量储存会导致脂肪细胞功能失调，进而引发脂肪因子分泌异常，触发肥胖、血脂异常、高血糖、高胰岛素血症、胰岛素抵抗和2型糖尿病等代谢综合征。因此，研究脂肪细胞功能失调背后的分子机制，有助于开发新的治疗策略。本方案描述了用于评估成年小鼠脂肪组织在缺氧条件下受影响的分子机制的方法，该条件与脂肪细胞凋亡相关。本方案介绍了如何分析脂肪组织 体内 通过基因表达谱分析以及缺氧暴露期间脂肪细胞分化、增殖和凋亡的组织学分析（通过缺氧细胞染色或HIF-1α蛋白检测确认），进一步 体外 脂肪细胞分化及其对各种刺激反应的分析，完善了对可能导致代谢综合征的脂肪细胞功能障碍相关分子通路的表征。

引言

根据世界卫生组织2014年的报告，全球39%的成年人超重，13%为肥胖1。在不久的将来，超重人群将占老年人口的很大比例。肥胖与衰老的一个重要特征是脂肪在发病率和死亡率方面的调节失常2。脂肪因子（adipokines）是由脂肪组织（AT）分泌的蛋白质，可引发肥胖和2型糖尿病等代谢综合征3。代谢性疾病主要由脂肪细胞内脂滴中过度的能量储存引起，从而导致脂肪组织扩张4。因此，明确脂肪组织扩张的原因及其分子机制，对于寻找干预和控制策略具有重要意义。

营养过剩会导致脂肪组织（AT）扩张，这一过程受两个事件调控：一是过量能量储存至脂肪细胞的脂滴中，导致脂肪细胞肥大（即脂肪细胞体积增大）；二是脂肪生成增加，也称为脂肪细胞增生5。脂肪生成是指多能间充质干细胞（MSC）分化为脂肪细胞的过程。首先，在定型阶段，MSC分化为前脂肪细胞；随后，前脂肪细胞进一步分化，获得成熟且具有功能的脂肪细胞特征6。已有多个转录因子被确认为前脂肪细胞决定的关键主调控因子，例如锌指蛋白423（Zfp423）和早期B细胞因子1（Ebf1）。其中Zfp423促进早期定型，而Ebf1则对脂肪细胞前体的生成至关重要6。终末分化过程由一个转录级联反应严格调控，其中过氧化物酶体增殖物激活受体γ（PPARγ）是必需的核心转录因子7。其他关键的转录因子还包括CCAAT/增强子结合蛋白（C/EBP）家族成员（即 C/EBPα、C/EBPβ和C/EBPδ）、Kruppel样因子（KLFs）、cAMP反应元件结合蛋白（CREB）以及早期生长反应20（Krox20）6。

最近研究表明，激活蛋白-1（AP-1）家族参与了脂肪细胞分化过程 8,9AP-1 家族由 Fos、Jun 和/或激活转录因子（ATF）成员组成的二聚体蛋白复合物构成。Fos 相关抗原 1 和 2（Fra-1 和 Fra-2）能够调控脂肪细胞分化。Fra-1 通过抑制 C/EBPα 来阻碍脂肪细胞分化。 8而 Fra-2 调控脂肪细胞的更新 9因此，Fra-2不仅通过抑制脂肪细胞分化过程中PPARγ2的表达来减少脂肪细胞数量，还通过直接抑制缺氧诱导因子（HIFs）的表达来降低脂肪细胞凋亡。HIF家族是一类异源二聚体转录因子复合物，由HIF-1α、HIF-2α和HIF-1β组成。该异源二聚体由一个氧敏感的HIF-α蛋白（HIF-1α或HIF-2α）和一个氧不敏感的HIF-1β亚基构成。 10在常氧条件下，HIF-α 蛋白被多聚泛素化，最终由蛋白酶体降解。 11在扩增过程中脂肪组织（AT）内出现的低氧条件下，HIF-α蛋白不再发生羟基化，因而得以稳定并与其持续表达的HIF-1β亚基形成二聚体。由HIF反应元件调控的基因转录激活参与血管生成、代谢及炎症反应的调节。 12事实上，HIF-1α 通过诱导葡萄糖耐受、抑制能量消耗和外周脂质利用，以及升高瘦素水平和加剧高脂饮食诱导的肝脂肪变性，促进脂肪组织功能障碍。 13此外，HIF-1α 调控脂肪细胞凋亡 在体 和 体外9.

本方案描述了研究成年小鼠脂肪组织状态以揭示脂肪细胞稳态分子特征的方法。内容展示了脂肪细胞的凋亡、增殖和分化过程 体内 和 体外 可受低氧调节。为此，我们采用将携带 Fra-2 基因 floxed 等位基因的小鼠与 Fabp4-CreERT 小鼠杂交，获得脂肪细胞特异性敲除 Fra-2 的小鼠模型 9通过使用Fabp4-Cre ERT小鼠，可在脂肪细胞中特异性地诱导敲除，并通过注射他莫昔芬进行诱导 14对于成年模型，从6周龄开始，连续5天进行腹腔注射他莫昔芬。因此，在分析前，小鼠将接受正常饮食或高脂饮食喂养6周。本研究使用的是基于C57Bl6背景的雄性小鼠，以避免雌激素等女性激素对体脂分布的调节作用。 15使用其他遗传背景也可能改变代谢表型，这是由于品系间在脂质代谢方面的差异所致 16.

本方案演示了如何在缺氧条件下通过组织学方法分析脂肪组织，并定量检测脂肪细胞的凋亡、增殖和分化 体内 通过免疫组织化学和基因表达谱分析完成。该研究由 体外 实验，展示如何分析缺氧暴露引起的原代脂肪细胞分化与凋亡的变化。

方案

伦理声明：动物饲养遵循德国动物福利法的指导方针，采用标准化饲养条件，并提供标准饮食和饮水。 随意摄取 并维持12小时光照/12小时黑暗的循环周期。所有涉及动物的实验均经当地伦理委员会批准。

1. 在体 内 成年雄性个体中脂肪细胞稳态的分析

  1. 量化缺氧程度 体内首先测定小鼠体重，然后按60 mg/kg体重剂量腹腔注射盐酸匹莫硝唑（例如：对25 g小鼠注射1.5 mg）。匹莫硝唑是一种有效的缺氧标记物，可与蛋白质、肽和氨基酸中的巯基形成加合物，并可通过特异性抗体进行检测。
  2. 处死小鼠并取出腹股沟脂肪垫（图1).
    1. 注射后45分钟，通过CO处死小鼠2 窒息后颈椎脱位。
    2. 如图所示，固定小鼠的四肢 图1）并打开腹腔。在腹腔内切除左侧和右侧性腺周围（附睾）脂肪垫。
      注意：脂肪垫通过腹膜瓣与附睾相连，如图所示 图1 （箭头所示为睾周脂肪垫）。
    3. 小心地将性腺组织从脂肪垫中分离。测定脂肪垫重量，以计算脂肪垫重量（g）与体重（g）的比值。

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图1： 小鼠腹膜腔中性腺周围脂肪垫的位置。成年小鼠处死后显示性腺周围脂肪分布的图片，箭头指示性腺周围脂肪垫的位置。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 为了构建定量基因表达谱，使用一个带周脂肪垫来分离RNA。注意：在组织处理之前，将组织样本保存在RNA稳定溶液中，置于-80 °C或液氮中。
    1. 为了均质化脂肪垫，将脂肪垫加入含有1 ml胍盐异硫氰酸苯酚单相溶液的离心管中。使用含有陶瓷珠（1.4 mm）的离心管，在均质器中以6,500 rpm速度破碎组织（每次20秒，重复2次，中间间隔30秒）。
    2. 按以下步骤提取RNA（采用Chomczynski和Sacchi17的单步法）。
      1. 为分离各相，将均质后的脂肪垫转移至微量离心管中，加入0.2 ml氯仿，振荡15秒，室温孵育5分钟，然后在12,000 × g条件下离心5分钟。将上层水相（约400 µl，含RNA）转移至新的微量离心管中。注意不要混入含DNA的中间层或含蛋白质的酚相。
      2. 为沉淀RNA，加入等体积异丙醇，混匀后在4 °C孵育15分钟（也可在-20 °C过夜孵育）。在12,000 × g条件下离心10分钟，小心弃去上清液。用75%乙醇洗涤两次，每次在12,000 × g条件下离心10分钟。
      3. 将沉淀的RNA在室温下干燥约10分钟后，溶于50 µl无RNase的H2O中。为促进溶解，可在65 °C孵育2分钟。
        注意：长期储存时，将RNA保存在75%乙醇中，并置于-80 °C或液氮中。
      4. 通过A260/280测定RNA样品纯度（理想比值在1.8至2.2之间），并根据A260计算浓度：
        DNA浓度公式：浓度[µg/ml] = OD260 × 40[µg/ml] × 稀释倍数，测量计算。
    3. 为避免DNA污染，取1 µg RNA样品，在10 µl反应体系中加入1 U DNase I，在37 °C孵育30分钟。随后在65 °C灭活10分钟。
      注意：此步骤为可选步骤。
    4. 取含1 µg RNA的10 µl RNA样品进行逆转录反应，生成适用于定量PCR的单链cDNA。各组分及其用量见表1。
    5. 使用PCR预混液进行定量实时PCR反应。为检测整个脂肪垫的代谢变化，使用针对脂肪组织稳态相关基因的特异性引物（见表2）以及表3中列出的PCR反应条件。
    6. 实时PCR数据分析。
      1. 设定基线（见图2），通常为第1至15个循环，此阶段荧光信号无明显变化。实时PCR软件将特异性荧光信号归一化至基线荧光及内参染料ROX，从而得到由引物产生的特异性信号强度，即ΔRn（ΔRn）。
      2. 将阈值设定在扩增曲线的指数增长期。阈值与曲线的交点定义为阈值循环数（Ct）。基于Ct值计算相对表达量（ΔCt）和倍数变化（ΔΔCt）：
        定量PCR方程，用于基因表达分析的ΔCt计算公式。
        qPCR中用于比较基因表达水平的ΔΔCt公式，以数学方程形式展示。
组分每反应体积 µl
10x RT Buffer2.0
25x dNTP Mix (100 mM)0.8
10x RT Random Primers2.0
MultiScribe Reverse Transcriptase1.0
Nuclease-free H2O4.2
1 µg RNA10
每反应总量20

表1：逆转录反应生成单链cDNA所需的各组分及其相应体积。

正式全称符号序列 3´--> 5´
正向反向
脂肪生成Delta样1同源物（pref-1）Dlk1GACACTCGAAGCTCA
CCTGG		GGAAGGCTGGGACGG
GAAAT
早期B细胞因子1Ebf1CCACCATCGACTACGG
CTTC		TCCTGGTTGTTGTGGGG
CATC
锌指蛋白423Zfp423GTGCCCAGGAAGAAGA
CGTA		GGCGACGTGGATCTGA
ATCT
脂肪酸结合蛋白4（Ap2）Fabp4TCACCTGGAAGACAGCT
CCCTC		AAGCCCACTCCCACTTC
TTTC
CCAAT/增强子结合蛋白（C/EBP）αCebpaAAGAGCCGCGACA
AGGC		TCGCAGCTCCAGCACCT
TGTG
CCAAT/增强子结合蛋白（C/EBP）βCebpbTTTCGGGACTTGATGC
AATC		CCGCAGGAACATCTTT
AAGG
cAMP应答元件结合蛋白1Creb1ACTCAGCCGGGTACT
ACCAT		TTGCTGCCTCCCTGTT
CTTC
CCAAT/增强子结合蛋白（C/EBP）δCebpdCAGCGCCTACATTGAC
TCCA		GTTGAAGAGGTCGGCG
AAGA
Kruppel样因子4Klf4GCAGTCACAAGTCCCC
TCTC		TAGTCACAAGTGTGGG
TGGC
早期生长反应2（Krox20）Egr2AGGCGGTAGACAAAATC
CCAG		GATACGGGAGATCCAG
GGGT
过氧化物酶体增殖物激活受体γPpargAGAGGTCCACAGAGCTG
ATTC		GATGCACTGCCTATGAGC
ACTT
脂质合成乙酰辅酶A羧化酶αAcacaTGGGGACCTTGTCTTCA
TCAT		ATGGGCGGAATGGTCTC
TTTC
脂肪酸合酶FasnACATCCTAGGCATCC
GAGA		CCGAGTTGAGCTGGGT
TAGG
硬脂酰辅酶A去饱和酶1Scd1CGGGATTGAATGTTCTTG
TCGT		TTCTTGCGATACACTCTG
GTGC
脂解作用含Patatin样磷脂酶结构域蛋白2Pnpla2AAGGACCTGATGACCA
CCCT		CCAACAAGCGGATGGT
GAAG
脂肪酸摄取脂蛋白脂酶LplGTATCGGGCCCAGCAA
CATTATCC		GCCTTGCTGGGGTTTTC
TTCATTC
CD36抗原Cd36GTCTTCCCAATAAGCATGT
CTCC		ATGGGCTGTGATCGGA
ACTG
缺氧缺氧诱导因子1α亚基Hif1aCCTGCACTGAATCAAGAG
GTGC		CCATCAGAAGGACTTGCT
GGCT
内皮PAS结构域蛋白1（又称：HIF-2α）Epas1CAAGCTGAAGCTAAAG
CGGC		TTGGGTGAATTCATCG
GGGG
Von Hippel-Lindau肿瘤抑制因子VhlACCGAGGTCATCTTTG
GCTC		TTCCGCACACTTGGGT
AGTC
芳香烃受体核转运蛋白（又称：HIF-1β）ArntTGGGTCATCTTCTCGC
GGTT		TGTCCTATCTGAGCAT
CGTG

表2： 用于分析脂肪细胞稳态的相关基因及其引物序列列表。

步骤温度 (°C)时间 (分:秒)
聚合酶激活保持9510:00
PCR40 个循环变性950:15
退火/延伸601:00
熔解曲线60 至 950.5 °C/秒

表3：实时PCR条件。

qPCR扩增曲线图，ΔRn与循环数的关系，突出显示指数期的阈值和Ct值。
图2： 实时PCR扩增曲线的特征。 请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 为了进行脂肪细胞稳态的组织学分析，使用第二对性腺旁脂肪垫。切勿使组织干燥！
    1. 将脂肪垫置于3.7% PBS缓冲的甲醛中固定过夜，随后进行石蜡包埋（具体操作步骤参见其他文献所述） 18）并将包埋的组织切成2-5 µm 厚切片（最大） 5 µm).
    2. 在苏木精-伊红（H&E）染色后，于明场显微镜下测定每视野内脂肪细胞数量及脂肪细胞大小。&E）染色：
      1. 用二甲苯洗涤切片3次，每次5分钟以脱蜡，随后将切片在100%乙醇中洗涤2次，每次2分钟，再在96%乙醇中洗涤2次，每次2分钟以进行水化。最后，用蒸馏水洗涤切片2O，5 分钟
      2. 用蒸馏水按1:5比例稀释的苏木精染色2O，室温孵育10分钟，用H洗涤2O，5 分钟。用伊红溶液染色（20 ml 5% 伊红 Y / 210 ml 蒸馏水 H2O/25 µl 冰醋酸）中处理30秒，再用H2O 型，5 分钟
      3. 使用96%乙醇和100%乙醇各处理2次，每次2分钟，再用二甲苯处理3次，每次5分钟，对切片进行脱水。用无水封片剂封片。
      4. 在明场显微镜下观察切片。使用 ImageJ 1.48v 分析脂肪细胞的代表性示例 19 如图所示 图 3：单位面积细胞数量（µm2），细胞面积（×103 µm2），细胞大小（µm).
        1. 使用 ImageJ 1.48v 打开切片图像。如果图像参数以像素为单位而非长度单位，需调整比例尺。
        2. 选择 直线 在工具栏中，参照比例尺将线条调整至已知距离。前往 分析 -> 设定比例尺 线条的距离以像素显示；添加已知距离及长度单位， 例如, µm. 用以下方法确认 好的图像的尺寸和参数分析均以给定的长度单位表示。
        3. 为确定脂肪细胞的参数，调整阈值。前往 图像 -> 调节 -> 阈值 打开 阈值 窗口。选择以下设置： 阈值分割方法默认 阈值颜色：B&W; 颜色空间：HSB。图像现显示为黑白。调整 亮度 清除白色脂肪细胞并闭合黑色细胞间间隙，如 图 3b.
        4. 每单位脂肪细胞数量计数 µm2 (图 3e）与 多点 在工具栏中选择并标记每个细胞以进行计数。
        5. 为确定脂肪细胞大小，选择 直线 再次在工具栏中绘制一个脂肪细胞的直径（图3c。前往 分析 -> 测量 直径长度的新窗口将会出现 µm.
        6. 为确定脂肪细胞面积，选择 *示踪笔工具* 并点击脂肪细胞内部。脂肪细胞的内壁以红色标出（图3d）。前往 分析 -> 测量 将出现一个新窗口，显示该脂肪细胞的面积 µm2.
    3. 免疫组织化学染色时，按如下步骤进行切片的抗体及末端脱氧核苷酸转移酶介导的dUTP-生物素缺口末端标记（TUNEL）染色前处理：
      1. 将切片在二甲苯中洗涤3次，每次5分钟以脱蜡，随后将切片在100%乙醇中洗涤2次，每次2分钟，再在96%乙醇中洗涤2次，每次2分钟以进行水化。最后，将切片在蒸馏水H2O.
      2. 抗原修复时，将组织切片在37°C下消化30分钟 37 °C 蛋白酶K工作液20 µg/ml 在10 mM Tris/HCl（pH 7.4–8）中孵育，并用PBS洗涤。
    4. 在湿盒中进行抗体染色：
      1. 为阻断内源性过氧化物酶，使用含3%过氧化氢的PBS孵育10分钟，随后用PBS洗涤2次，每次5分钟。为阻断抗体的非特异性结合，使用含10%血清的PBS溶液，血清应与二抗宿主一致，本实验中为山羊血清。
      2. 用于染色时，采用凋亡、增殖和缺氧检测的抗体（表4）。将抗体用 PBS/10% 小牛血清稀释。孵育于 4 °C 过夜。用 PBS 洗涤切片，每次 5 分钟，共洗 3 次。
      3. 为增强信号，使用下表所列稀释比例的生物素标记二抗 表5对于缺氧检测，使用HRP标记的兔抗FITC作为二抗，在室温下孵育1小时。用PBS洗涤切片，每次5分钟，共洗涤2次。
        注意：使用 FITC-MAb1 进行缺氧染色时，跳过步骤 1.4.4.4），继续进行步骤 1.4.4.5）。
      4. 每个载玻片均需预先孵育 50 µl 链霉亲和素溶液与 50 µl 室温下用生物素化过氧化物酶H孵育30分钟（该方法也称为亲和素/生物素ABC复合物法），然后加入切片中继续孵育45分钟。用PBS洗涤2次，每次5分钟。
      5. 将切片置于过氧化物酶底物溶液中孵育，直至染色加深（5至10分钟）。用蒸馏水洗涤5分钟2O.
      6. 用蒸馏水按1:5比例稀释的苏木精进行复染2O，室温孵育10分钟，用H洗涤2O 培养 5 分钟。
      7. 将切片依次浸入96%乙醇和100%乙醇各2次，每次2分钟，再浸入二甲苯3次，每次5分钟进行脱水。用盖玻片和无水封片剂封片。在明场显微镜下观察切片。
    5. 通过TUNEL检测法检测细胞凋亡，并遵循试剂盒说明书操作：
      1. 添加 50 µl 酶溶液加入到 450 µl 标记溶液，然后应用 50 µl TUNEL反应混合物作用于组织切片，并在+37°C下孵育60分钟37 °C 在避光、湿润的环境中孵育。用 PBS 洗涤切片 3 次，每次 5 分钟，然后使用含 DAPI（4',6-二脒基-2-苯基吲哚）的荧光封片剂封片，用于复染。
      2. 在荧光显微镜下以100倍放大倍数观察该区域。测量荧光素时，使用488 nm激发波长，并在515–565 nm范围内检测（绿色激光）；DAPI在结合DNA后于约360 nm处激发，约460 nm处发射（蓝色激光）。
      3. 量化 DAPI 与荧光素的重叠区域：
        细胞凋亡方程，凋亡脂肪细胞百分比公式，生物学，凋亡率计算，示意图

组织学显微镜结果；细胞结构分析，显示测量数据和放大细节。
图 3：脂肪垫切片中脂肪细胞特征的分析。 使用明场显微镜观察雄性小鼠经高脂饮食（HFD）或正常饮食（ND）处理后的腹膜周脂肪垫切片图像（a）；将图像调整为黑白阈值（b），并使用 ImageJ 1.48v 软件对脂肪细胞大小（长度；c）、面积（d）以及每 mm2 的脂肪细胞数量（e）进行定量分析。请点击此处查看该图的放大版本。

储存浓度稀释比例
细胞凋亡Cleaved Caspase-3 (Asp175) (5A1E) Rabbit mAb1:2,000
增殖Purified Mouse Anti-Human Ki-67 Clone B56 (RUO)1:50
缺氧HIF-1 alpha Antibody1:100
FITC-MAb11:100

表4： 用于AT组织切片免疫组织化学染色的抗体及其相应稀释比例。

抗体稀释比例
生物素标记的抗小鼠 IgG (H+L)1:200
生物素标记的抗小鼠 IgG (H+L)1:200
HRP 标记的兔抗 FITC1:100

表5：用于免疫组织化学染色的二抗及其稀释比例。

2. 体外 缺氧影响下脂肪细胞稳态的分析

  1. 处死小鼠并取出皮下脂肪组织。
    1. 采用 CO2 窒息法处死小鼠，随后进行颈椎脱位。
    2. 如图4所示，将小鼠四肢固定。从大腿上部、腰部和侧腹部分离皮肤，并用针固定，如图4所示。随后取出位于后肢基部后方、围绕腹股沟淋巴结的皮下脂肪组织（如图4所示，左侧：箭头所示为皮下脂肪垫；右侧：箭头所示为腹股沟淋巴结）。

小鼠解剖示意图，重点展示肌肉与皮肤的连接关系，生物学教育。
图4： 皮下脂肪垫的位置。皮下脂肪垫示意图；左侧箭头指示皮下脂肪垫，右侧箭头指示腹股沟淋巴结。 请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 按照先前所述方法分离脂肪来源的干细胞（ADSC）20。
  2. 将ADSC以4,000个细胞/cm2的密度接种于添加了10%正常小牛血清、1%青霉素/链霉素、0.5%两性霉素B、16 µM生物素、18 µM泛酸和100 µM抗坏血酸的Dulbecco改良Eagle培养基-Ham's F-12中，培养至约70%至80%融合，通常在培养4至6天后达到。
  3. 诱导脂肪向分化。
    1. 通过胰蛋白酶处理将贴壁的ADSC从培养表面解离。
      1. 移除培养基，用PBS洗涤，加入预热至37 °C的0.025%胰蛋白酶溶液消化2分钟（直至细胞从表面脱落），立即加入培养基终止消化并收集细胞。
    2. 使用血细胞计数板（Neubauer计数室）对细胞进行计数。
      1. 将盖玻片置于Neubauer计数室中央区域，将细胞悬液按1:10稀释后取10 µl加入计数室。计数位于四个角的四个大方格（每个由16个小方格组成）中的细胞数。按下式计算每毫升细胞数量：
        细胞浓度公式，方程：细胞数/ml = (细胞数/4) × 10 × 10,000。
    3. 将ADSC（如步骤2.2所述）接种于12孔培养板中，培养至约70%至80%融合（通常需4至6天）。
    4. 通过向培养体系中添加5 µg/ml胰岛素、1 µM地塞米松和5 µM 3-异丁基-1-甲基黄嘌呤（IBMX）诱导脂肪向分化。每2天更换一次培养基。细胞在7天后将完全分化。
  4. 为分析脂肪向分化情况，使用油红O染色法对甘油三酯进行染色，该染料可特异性染色成熟脂肪细胞中的脂滴。
    注意：操作必须在通风橱中进行！
    1. 移除培养基，用PBS轻轻洗涤脂肪细胞，加入2 ml 10%福尔马林固定60分钟。
    2. 配制油红O染色工作液：将3份油红O储备液（300 mg油红O粉末溶于100 ml 99%异丙醇）与2份蒸馏H2O混合，室温孵育10分钟，然后用0.2 µm注射式滤器过滤。
      注意：工作液在2小时内稳定。
    3. 进行油红O染色时，移除福尔马林，用H2O洗涤脂肪细胞，加入2 ml 60%异丙醇孵育5分钟，移除异丙醇后加入2 ml油红O工作液染色5分钟。用自来水冲洗细胞至洗液澄清。参照步骤1.4.4.5）进行苏木精复染。
    4. 在相差显微镜下以100倍放大倍数观察培养板。脂肪细胞中的脂滴呈红色，细胞核呈蓝色。
  5. 可选步骤：通过shRNA转染沉默目标基因。
    1. 更换培养基，加入无血清培养基。
    2. 对脂肪细胞进行转染时采用脂质体转染法。按照试剂说明书操作，每12孔板使用1 µg shRNA。加入脂质-DNA复合物后，在37 °C孵育48小时。
  6. 为分析处于低氧条件下的脂肪细胞，使用低氧工作站或低氧培养箱维持细胞在低氧环境中。根据研究需要，低氧条件可设定为0.5%、1%或2%氧气。
    1. 使用FITC标记的Annexin V染色并结合流式细胞术分析细胞凋亡。
      1. 使用超软细胞刮刀收集脂肪细胞，用PBS洗涤后将1 × 106个细胞重悬于100 µl Annexin V结合缓冲液（10 mM Hepes/NaOH，pH 7.4；140 mM NaCl；2.5 mM CaCl2）中。加入试剂厂商推荐量的Annexin V-FITC，室温避光孵育15分钟。
      2. 进行流式细胞术检测时，加入200 µl Annexin V结合缓冲液和1 µM核复染染料。检测绿色和紫色荧光通道信号。Annexin V+/核复染+细胞定义为继发性坏死细胞，Annexin V+/核复染-细胞定义为凋亡细胞（图5）。
    2. 定量分析脂肪细胞RNA水平，以评估其在低氧条件下的稳态状态。
      1. 每孔加入1 ml含硫氰酸胍和苯酚的单相溶液，提取RNA [采用Chomczynski和Sacchi的一步法17（步骤1.3.2）]，并继续执行步骤1.3.2.1）至1.3.5.2）。

流式细胞术散点图；凋亡/坏死细胞分类，AXV-FITC 与核复染对比。
图5：通过流式细胞术分析脂肪细胞凋亡。脂肪细胞Annexin V-FITC与TO-PRO-3染色的FACS散点图展示。请点击此处查看该图的放大版本。

结果

我们展示了如何测定脂肪细胞稳态 体内 和 体外 以 Fra-2 为例fl/fl 与野生型同窝小鼠相比，Fabp4-CreERT 小鼠中缺氧诱导的 HIF 表达升高与脂肪细胞功能障碍相关，表现为脂肪细胞凋亡增加。本方案明确了这一关联机制。

高脂饮食（HFD）处理小鼠的脂肪细胞体积和面积增加

营养过剩等因素会导致脂肪细胞肥大，其原因是脂滴中过度储存能量所致。脂肪细胞的大小和面积是判断肥大的指标。正常饮食（ND；图6a）和高脂饮食（HFD；图6b）小鼠脂肪组织切片以及脂肪细胞大小和面积的定量分析结果清楚显示，经过6周高脂饮食后出现明显的脂肪细胞肥大，表现为高脂饮食处理小鼠的脂肪细胞尺寸显著增大（图6c 和 d）。

成年 Fra-2fl/fl Fabp4-CreERT 小鼠脂肪组织（AT）中缺氧程度增加，导致 HIF-1α 水平升高以及脂肪细胞凋亡

为确定脂肪组织（AT）中缺氧的体内状态，对12周龄时经Fra-2缺失处理6周的Fra-2fl/fl Fabp4-CreERT小鼠进行分析，并与野生型同窝小鼠进行比较。通过腹腔注射给予小鼠匹莫尼唑，作为一种有效的缺氧标志物；该物质无毒且能够分布至脂肪组织。脂肪组织中体内的缺氧脂肪细胞通过免疫组化抗体染色进行鉴定（图7a）。此外，小鼠脂肪组织缺氧状态的增强伴随着HIF-1α阳性脂肪细胞数量的增加，免疫组化染色结果（图7b）显示了这一点，并通过HIF-1α表达水平及其靶基因的定量分析得到证实9。另外，对Fra-2fl/fl Fabp4-CreERT小鼠及其对照同窝小鼠的脂肪组织切片进行TUNEL染色（图7c）显示，脂肪细胞凋亡的增加与缺氧及HIF-1α表达的存在相关。

通过缺氧诱导脂肪细胞凋亡，增加原代脂肪细胞中HIF-1α的表达

分析脂肪细胞凋亡 体外我们采用如其他文献所述方法，由皮下脂肪垫生成的脂肪细胞 20. 与预期一致，脂肪细胞中HIF-1α的表达在缺氧24小时后增加（图8a）。为了进一步分析HIF-1α的活性，通过qPCR定量检测HIF靶基因（如Inos（诱导型一氧化氮合酶））的RNA水平。 图8b 表明在缺氧条件下HIF-1α表达升高可导致iNOS mRNA水平上升。由于我们已经证明 体内 (图8) 脂肪细胞中HIF-1α表达升高与脂肪细胞凋亡增加相关，同时也对凋亡进行了定量分析 体外 在缺氧条件下通过Annexin V染色检测细胞培养。结果与 体内 数据（图7），缺氧条件下 HIF-1α 水平升高伴随着脂肪细胞凋亡的增加图8b此外，为了证明缺氧诱导的凋亡依赖于HIF，采用RNA干扰技术在来自野生型或Fra-2缺陷型小鼠的脂肪细胞中沉默HIF-1α或HIF-2α。通过Annexin V染色显示，沉默HIF-1α或HIF-2α可恢复增高的脂肪细胞凋亡水平 图8b，证明低氧感应器HIF-α调控脂肪细胞凋亡。

脂肪细胞组织学及大小分析；显微镜图像与图表比较正常饮食与高脂饮食的影响。
图6：高脂饮食（HFD）小鼠脂肪细胞大小和面积增加。（a，b）雄性野生型小鼠摄取正常饮食（ND）（a）或高脂饮食（HFD）（b）6周后，取其睾周脂肪组织切片进行H&E染色。标尺代表500 μm。（c，d）野生型小鼠摄取ND（a）或HFD（b）6周后，睾周脂肪组织中脂肪细胞大小（c）和面积（d）的定量分析。n = 10。数据以均值±标准误表示。统计学分析采用Student's t-检验。***p <0.0001。请点击此处查看该图的放大版本。

缺氧、HIF1α、TUNEL 检测示意图显示 Fra-2 ΔAdip 的影响；20x、40x 放大倍数下的显微图像。
图 7：成年 Fra-2fl/fl Fabp4-CreERT 小鼠脂肪细胞中 HIF-1α 水平升高及细胞凋亡增加。雄性 Fra-2fl/fl Fabp4-creERT 小鼠及其对照 littermates 在注射他莫昔芬后 6 周，脂肪组织（AT）中的缺氧（a）和 HIF-1α（b）染色结果。放大倍数为 20X，插图为 40X。黑色箭头指示缺氧区域和 HIF-1α 阳性细胞。（c）Fra-2fl/fl Fabp4-CreERT 小鼠及其对照 littermates 在注射他莫昔芬后 6 周的脂肪组织 TUNEL 染色结果。放大倍数为 20X，插图为 40X。黑色箭头指示 TUNEL 阳性细胞。本图经 Luther et al. 9 修改。 请点击此处查看该图的放大版本。

Hif1α 和 Inos 表达的柱状图；Annexin V 凋亡检测结果，氧气变化。
图 8： 缺氧诱导的原代脂肪细胞中 HIF-1α 表达增加及脂肪细胞凋亡。 （a）将原代脂肪细胞置于缺氧环境中，在指定时间点检测 HIF-1α 及其靶基因 Inos 的 mRNA 水平的实时 PCR 分析结果。 （b）通过 Annexin V FACS 染色定量分析来自 Fra-2fl/fl Fabp4-CreERT 小鼠或野生型对照小鼠的原代脂肪细胞的凋亡情况，这些细胞转染了对照 shRNA 或针对 HIF-1α 或 HIF-2α 的 shRNA 质粒，并在低氧条件（1% O2）下培养 24 小时。该图改编自 Luther et al. 9。数据以均值 ± 标准差表示。统计学分析采用 Student's t-检验。*P <0.05 和 **P <0.01 被认为具有显著性差异。 请点击此处查看该图的放大版本。

讨论

脂肪细胞在表型上以其大小、数量和面积为特征，这些特征揭示了由于营养过剩导致能量过度储存所引发的脂肪细胞增生和肥大5。这些事件导致脂肪酸代谢失调及继发性代谢综合征，但也存在脂肪质量增加而代谢仍保持正常的状态，这种状态也被称为"健康"性脂肪扩张。例如，Kusminski et al.21研究表明，发生显著脂肪扩张的小鼠仍可保持代谢健康，提示脂肪扩张并不必然与代谢综合征相关，需谨慎评估脂肪细胞的特性。脂肪组织（AT）在机体代谢调控中发挥关键作用。AT是人体最大的内分泌器官，可影响血脂异常、动脉粥样硬化、高胰岛素血症和高血糖3。评估AT的稳态及其调控的分子机制，有助于更深入理解代谢系统紊乱。因此，阐明调控脂肪细胞分化、脂肪细胞大小及脂肪垫质量的机制，将有助于开发针对肥胖相关疾病的新型治疗策略。通过体内（in vivo）和体外（in vitro）方法，可确定食物和基因表达对脂肪细胞分化与活性的影响。为评估AT稳态，根据本方案建议，确定脂肪细胞分化、增殖与凋亡之间的平衡，与分析葡萄糖和胰岛素代谢反应同等重要22-24。

对原代脂肪细胞和内脏脂肪组织中参与脂肪生成、脂质合成、脂解、脂肪酸摄取、缺氧、凋亡及增殖相关基因进行表达谱分析，是一种高通量获取脂肪细胞稳态及其潜在功能障碍概况的方法。有研究价值的候选基因应进一步通过蛋白质印迹或免疫组织化学染色在蛋白水平进行分析。为了在使用不对称氰化染料的实时PCR系统中获得最佳结果，应测试1至10 ng的cDNA浓度以及50至900 nM的最佳引物浓度，以最大限度减少非特异性扩增。关键组分是引物；每次实验均需严格控制熔解曲线，以确保扩增特异性并排除引物二聚体的形成。因此，建议使用以H2O代替cDNA的阴性对照。此外，市售的不对称氰化染料通常以预混液形式提供，其中包含被动参比染料（如ROX），用以提供内部参考信号。在数据分析过程中，cDNA信号将被标准化为ROX信号，以校正孔间信号波动。为了建立良好的qPCR系统，另一个需要考虑的因素是内参基因的选择。在每种实验条件下，应使用多个内参基因，例如HPRT、β-actin、GAPDH、β-2-MG或HSP90。

在缺氧条件下稳定的HIF蛋白是决定脂肪细胞存活以及葡萄糖代谢、胰岛素耐受性和脂质代谢等代谢变化的关键调控因子11,25,26。为了确定脂肪垫中的缺氧区域，可通过免疫组织化学方法检测脂肪组织（AT）切片中的HIF-1α表达。由于HIF蛋白在常氧条件下会在5至10分钟内迅速降解，因此组织处理及脂肪垫固定过程必须严格控制，以避免操作延迟。因此，除了通过HIF染色确认缺氧状态外，还使用匹莫尼唑（pimonidazole）来标记AT中的缺氧区域。匹莫尼唑能够扩散进入组织——此前已在骨组织中得到证实27——并在缺氧细胞中特异性地与含硫醇的蛋白质结合，从而有效标记缺氧区域，随后通过特异性抗体结合在组织切片中进行检测28。然而，也可采用其他标志物和方法来分析缺氧信号通路。例如，为了全面了解该通路，还需分析脯氨酰羟化酶（prolyl hydroxylase, PHD）的作用，该酶在常氧条件下可催化脯氨酸残基的羟基化；以及冯·希佩尔-林道（von Hippel-Lindau, VHL）蛋白的作用，该蛋白可识别羟基化的脯氨酸残基，并介导HIF的多聚泛素化，从而导致其经由蛋白酶体途径降解29,30。此外，对HIF的广泛性检测还可反映其蛋白稳定性及降解过程，这些过程可能发生改变31,32。

此外，通过Ki67染色检测细胞增殖，通过TUNEL染色检测细胞凋亡 体内 通过AT组织切片染色实现。还通过流式细胞术分析Ki67染色检测细胞增殖，以及TUNEL或Annexin V染色检测细胞凋亡进行定量分析 33增殖当然也可以通过其他技术来测定，例如分析脂肪细胞周期，而Ki67阳性细胞的检测并不能反映这一过程。此外，TUNEL法检测凋亡可结合Annexin V和TO-PRO-3的流式细胞术（FACS）分析，以区分坏死与凋亡性细胞死亡的程度。凋亡是细胞程序性死亡的基本过程，对脂肪组织（AT）稳态具有重要意义。事实上，脂肪细胞凋亡的失调此前已被认为参与了肥胖症和脂肪营养不良等病理过程。 34此外，2011年，Keuper 等 将脂肪组织炎症与脂肪细胞凋亡联系起来。他们发现，巨噬细胞可诱导前脂肪细胞和脂肪细胞发生凋亡，而凋亡的细胞反过来又会招募巨噬细胞。巨噬细胞的募集加剧了炎症反应，进而促进葡萄糖耐受和胰岛素耐受等代谢综合征的发生 35然而，尽管有假说认为诱导脂肪细胞凋亡可能减轻体重，脂肪细胞凋亡仍是一个研究较少的现象。

本实验方案采用免疫组织化学方法研究增殖、凋亡和缺氧等不同现象 体内因此，组织需用4%甲醛固定，这是关键步骤。过长的固定时间会导致表位发生改变，从而使抗体无法接触；而过短的固定时间则会增加表位对试剂的敏感性。推荐的最佳固定时间为24小时。此外，切片厚度也会影响抗体与其表位的结合，最佳厚度为2至5 µm。厚于5 µm的切片会因结合位点增多而产生假阳性结果；相反，薄于2 µm的切片结合位点较少，阳性区域显示不清。其他关键因素还包括抗体本身、孵育时间、浓度甚至温度，这些均会影响抗体与表位特异性结合的质量。因此，针对每种实验条件，均需验证抗体浓度和孵育时间。

为完成本研究，我们提供了一个 体外 脂肪细胞分化方案，可通过不同处理、刺激或共培养进行扩展。通过使用 体外 脂肪细胞培养可用于确定脂肪细胞分化及功能方面的缺陷。为了获得可靠的结果，与所有原代细胞一样，ADSCs和脂肪细胞的健康状态及形态特征至关重要。颗粒增多、胞质空泡化和/或细胞脱落是细胞退化的表现，提示培养基成分不当、微生物污染或原代细胞衰老。本方案采用从脂肪组织脂肪垫中分离的脂肪细胞，但也可使用骨髓来源的间充质干细胞，具体方法可参考其他已发表的实验方案。 36最新的研究包括间质祖细胞，这可能反映了脂肪细胞分化最初阶段出现的额外分化问题，而这些问题可能在我们目前的方案中被遗漏。此外，ADSCs能够快速扩增（一周内超过10倍），经过多次传代的长期培养后，ADSCs仍能保持其间充质多能性 37,38使用ADSCs的另一个优势在于可以轻松过渡到人类应用，因为可通过吸脂术从患者体内获取ADSCs，而吸脂术是一种简单且微创的方法。

由于脂肪组织以内分泌方式影响多个其他器官，因此该方案应扩展至脂肪因子的检测。脂肪细胞分泌的脂肪因子，如瘦素（leptin）、脂联素（adiponectin）、肿瘤坏死因子-α（TNF-α）和抵抗素（resistin），已被证实可通过调控脂肪代谢、能量稳态和胰岛素敏感性来影响代谢性疾病39。因此，应进行血清和脂肪细胞分泌组分析。在脂肪组织功能障碍的情况下，脂肪因子和促炎性细胞因子（如IL-6）可能导致肝脏、胰腺以及肌肉功能的失调4。为排除系统性器官功能障碍，可利用动物模型或细胞培养体系检测其对葡萄糖刺激和摄取的反应能力。

本文提供了一种用于分析脂肪组织（AT）及脂肪细胞基础状态的实验方案 体内 和 体外 揭示脂肪细胞稳态与功能的分子机制。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

作者谨此感谢 J. Luther 博士和 K. Ubieta 在数据准备方面提供的帮助，以及 B. Grötsch 博士对稿件的校对。本工作由德国研究基金会（Deutsche Forschungsgemeinschaft，项目编号 BO3811/1-1-Emmy Noether）资助。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
RNA保存液 RNAlater 溶液AmbionAM7021RNA 稳定溶液
高容量 cDNA 反转录试剂盒Applied Biosystems4368813
SYBR Select 主混合液4472908
纯化小鼠抗人 Ki-67 抗体BD Biosciences550609克隆株 B56 (RUO)
纯化小鼠抗人 Ki-67 克隆株 B56 (RUO)550609增殖标志物
FITC 标记 Annexin VBioLegend640906
裂解型 Caspase-3 兔单克隆抗体Cell signalling9664S克隆株 5A1E
裂解型 Caspase-3 (Asp175) (5A1E) 兔单克隆抗体9664凋亡标志物
Lipofectamine2000 转染试剂 Invitrogen11668-027
TO-PRO-3 碘化物T3605细胞核复染剂，单体花青类核酸染料，激发波长⁄发射波长：642⁄661 nm
Mayer’s 苏木精染液Merck109249苏木精
pegGOLD TriFastPeqlab30-2030TRIzol，含硫氰酸胍与苯酚的单相溶液
Precellys 陶瓷研磨套件 1.4 mm91-PCS-CK14含陶瓷珠（1.4 mm）的研磨管
Precellys 2491-PCS24组织匀浆器
HIF-1 alpha 抗体PiercePA1-16601
HIF-1 alpha 抗体，16H4L13700505缺氧标志物
原位 细胞死亡检测试剂盒，荧光素标记Roche11 684 795 001TdT 介导的 dUTP 生物素缺口末端标记法 (TUNEL) 
伊红Sigma318906
DNase I 溶液（1 单位/µl）Thermo ScientificEN0525
生物素标记抗小鼠 IgG (H+L)Vector LaboratoriesBA-9200
生物素标记抗小鼠 IgG (H+L)BA-1000
Vectastain ABC 试剂盒PK-4000
含 DAPI 的 VECTASHIELD 封片介质H-1200

参考文献

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