使用重建血液的微流控流动腔室体外模拟止血和血小板输注 In Vitro

摘要

采用血液重建和微流控流动腔模拟血小板输注与止血过程，以研究血液库保存血小板的功能。体外实验数据展示了血小板储存损伤对止血功能的影响。

摘要

用于输注的血液血小板在储存过程中会逐渐丧失止血功能。血小板功能可通过多种（间接的）体外实验进行研究，但这些方法中没有一种能像微流控流动腔那样全面。在本方案中，采用储存的血库血小板重悬血小板减少的新鲜血以模拟血小板输注。随后，将重悬后的样本灌注至微流控流动腔中，以模拟暴露的内皮下基质蛋白上的止血过程。可通过配对实验设计测量献血、运输、组分分离、储存及病原体灭活等因素的影响。这使得能够可靠地比较血液组分制备过程中每一步操作对止血功能的影响。我们的结果展示了温度循环、剪切速率、血小板浓度和储存时间对血小板功能的影响。综上所述，本方案可分析血库血小板的功能，最终有助于优化包括采血、运输、组分制备、储存和输注在内的整个处理流程。

引言

止血需要细胞、蛋白质、离子和组织在特定的时空范围内协同并受调控地发挥作用¹不受控的活性可能导致一系列与血液凝固相关疾病的出血或血栓形成，进而引发发病或死亡。微流控流动腔实验是一种模拟止血过程的具有挑战性的技术。 体外该方法可用于研究止血过程中各种复杂相互作用，其中血小板发挥主导作用。

血管损伤后，血小板会黏附于暴露的内皮下基质（糖）蛋白，以防止血液流失。黏附后，血小板在自分泌和旁分泌信号的刺激下被激活并发生聚集，最终形成由纤维蛋白稳定、牢固封闭伤口的血小板网络，即血栓²。与其他大多数血小板功能检测方法不同，流动腔实验考虑了血流的物理参数，因而能够反映流变学对参与细胞及生物分子的影响^3,4。

通过改变影响止血（亚）过程的关键参数，如黏附基质、流变学和流动轮廓、细胞组成、毒素或药物的存在、离子强度等，流动腔实验在止血与血栓形成研究中取得了里程碑式的科学发现⁵。在过去二十年中，传统的低通量流动腔实验需要大量样本体积（10–100 ml），现已发展为微流控腔室，通常由小型平行板腔构成，并结合现代技术，可在受控的管壁剪切条件下灌注全血。微缩化显著提高了检测通量，主要原因是硬件设置更简化，且所需（血液）体积更少，使实验更具可及性和灵活性。例如，现在可使用小型实验动物的血液，而无需牺牲动物。经基因修饰小鼠的血样因此有助于识别促进或....

方案

本方案遵循机构关于人体样本研究的伦理准则，并已获得所有供体的知情同意。本研究所述实验已获得安特卫普大学医院机构审查委员会的批准。

注：温度指示均为室温，除非另有说明。

1. 准备流动腔装置

1. 准备通道、管路和插针
   1. 剧烈涡旋混匀胶原蛋白悬浮液，并用供应商提供的等渗葡萄糖溶液稀释至20倍，最终浓度为50 µg/ml。
      注：我们使用马腱来源的胶原蛋白，主要由I型纤维组成。这种马源I型胶原蛋白常被称为“Horm”胶原蛋白，由于历史和生物学原因，已成为此类检测的金标准⁹。也可使用人III型胶原蛋白，但其纤维在表面包被效果较差，且血小板反应较弱。其他包被表面也可使用，例如血管性血友病因子（VWF）、纤维蛋白原、纤连蛋白、层粘连蛋白、玻璃粘连蛋白、血小板反应蛋白-1，或这些蛋白的组合¹⁶。
   2. 从供应商容器中取出一个新的一次性生物芯片。本实验所用生物芯片的尺寸为0.4W × 0.1H × 20L mm³。
   3. 将0.8 µl胶原包被液从芯片一端加入微流控生物芯片的通道中，并标记为出口端。确保通道中有5/6长度被步骤1.1.1制备的含胶原包被液填充，避免产生气泡。
      注：通道部分包被可防止胶原纤维在通道入口处积聚（见讨论部分）。
   4. 在加湿密闭....

结果

为展示批内变异，将三个相同的重建全血样本同时灌注于胶原包被的表面（图1）。结果得到的变异系数为8.7%。该数据表明批内及实验室内的变异处于可接受范围，允许对相关样本进行可靠比较。

本文所述商用流式腔室的入口与测量腔室呈垂直方向，这可能导致该位置的流动略显湍流而非层流。尤其在未使用抗凝剂的实验中，血液与固定化激动剂之间的接触时间增加，可能引起堵塞。入口堵塞会影响腔室下游的检测结果。因此，通过部分包被流式腔室（图2），使入口区域不含有血小板激动剂，从而避免初级和次级止血过程的过早激活，对实验装置进行了优化。此外，部分包被黏附表面的方法已被该领域其他研究团队成功应用¹⁶。同时，这一简单实用的技巧有助于研究血液从非反应性（未包被）表面流向反应性（包被）区域时的“过渡”区域。

讨论

微流控流动腔实验是研究流动血液中血小板功能的优秀工具，可用于评估止血功能 体外 在不同的实验背景下。尽管实验室间的标准化程度较差⁹我们证明，在本实验室条件下，实验变异在可接受范围内，从而能够可靠地比较同一研究中的（配对）样本。这一结论通过已充分记录的血小板储存损伤现象进行了验证，后者是指在血库储存条件下血小板发生的有害变化¹¹此外，我们近期发表了关于三种现有的病原体灭活技术对经血液重组后PC血小板在微流控流动腔中功能影响的研究。^14,15.

当生物物理和生物化学参数发生变化时，血小板的反应也各不相同²⁰。因此，可根据具体的研究问题，在本方案中调整剪切应力、细胞数量和细胞组成、温度、包被条件、抗凝剂以及许多其他因素。本方案仅使用 commercially available 硬件和软件工具，以便其他实验室能够执行类似的检测。对于基础研究而言，这可能是一个劣势，特别是因为现有硬件的灵活性不如定制装置。该检测本身具有较强的稳健性，但其可重复性会受到生物学和时间变异的影响。因此，实验样.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
含EDTA的BD真空采血管	Becton, Dickinson and Company	368856
含肝素的BD真空采血管	Becton, Dickinson and Company	368480
含枸橼酸钠的BD真空采血管	Becton, Dickinson and Company	366575
水蛭素血液采血管	Roche	6675751 001
BD真空采血Eclipse系统	Becton, Dickinson and Company	368650	带预装持针器的采血针
移液器吸头 100–1,000	Greiner bio-one	740290
移液器吸头 2–200	Greiner bio-one	739280
移液器吸头 1–10	Eppendorf	A08928
5 ml离心管	Simport	11691380
15 ml锥形离心管	Greiner bio-one	1888271
50 ml锥形离心管	Greiner bio-one	227261
10 ml注射器	BD	309604
精密擦拭纸	Kimtech	5511
Vena8 Fluoro+ 生物芯片	Cellix	188V8CF-400-100-02P10	在图S1 A中称为“生物芯片”
Vena8管路	Cellix	TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F	在图S1 B中称为“一次性管路”
Vena8针头	Cellix	SS-P-B1IC-B1OC-PACK200	在图S1 B中称为“针销”
生物芯片单入口连接器	Cellix	CONNECTORS-B1IC-PACK100
Multiflow8连接器	Cellix	MF8-CONNECT-BIC3-N-THROMBOSIS	在图S1 B中称为“可重复使用管路”和“分流器”
加湿盒	Cellix	HUMID-BOX
微流控泵软件	Cellix	N/A	Venaflux检测软件
Horm胶原	Takeda/Nycomed	1130630	天然马肌腱胶原（I型） 用等渗葡萄糖溶液稀释胶原
HEPES缓冲盐水（HBS）	实验室自制	实验室自制	10 mM 4-(2-羟乙基)-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）缓冲盐水（0.9% (w/v) NaCl，pH 7.4）
封闭缓冲液	实验室自制	实验室自制	含1.0% (w/v) 牛血清白蛋白和0.1% (w/v) 葡萄糖的HBS溶液
Calcein AM	Molecular probes	C1430
10%漂白剂	实验室自制	实验室自制
0.1 M NaOH	实验室自制	实验室自制
变性酒精	Fiers	T0011.5
Mirus Evo Nanopump	Cellix	188-MIRUS-PUMP-EVO	配备Multiflow8。在图S1 A中称为“泵”和“管路分配器”
显微镜	Zeiss	Axio Observer Z1	配备Colibri-LED和高分辨率CCD相机
显微镜软件	Zeiss	N/A	ZEN 2012
血液分析仪	Sysmex	N/A
台式离心机	Eppendorf	521-0095
血小板孵育仪	Helmer	PF-48i
孵育水浴槽	GFL	1013
移液器	Brand	A03429
试管滚轴混合器	Ratek	BTR5-12V
无菌对接装置	Terumo BCT	TSCD
管路封口机	Terumo BCT	AC-155
涡旋振荡器	VWR	58816-121