微流体流钱伯斯再造使用血止血建模和血小板输注体外

摘要

使用血液重构和微流体流室对血小板输注和止血进行建模，以研究血库血小板的功能。数据证明了血小板贮积病变对体外止血的影响。

摘要

准备输血的血小板在储存过程中逐渐失去止血功能。血小板功能可以使用各种（间接）体外实验来研究，但这些实验都不如微流体流动室全面。在该方案中，血小板减少性新鲜血液与储存的血库血小板的重建用于模拟血小板输注。接下来，将重构的样品在微流体流动室中灌注，该流室模拟暴露的内皮下基质蛋白的止血作用。献血、运输、成分分离、储存和病原体灭活的影响可以在配对实验设计中测量。这样可以可靠地比较血液成分制备中的每项作对止血的影响。我们的结果表明，温度循环、剪切速率、血小板浓度和储存时间对血小板功能的影响。总之，该方案分析了血库血小板的功能，这最终有助于优化加工链，包括静脉切开、运输、成分制备、储存和输血。

引言

止血需要的细胞，蛋白质，离子和组织在有限的时空背景下¹组合和受规管活动。不受控制的活性可能导致出血或血栓形成和发病率或死亡率有关凝血障碍的光谱。一种微流体流室的实验是一个具有挑战性的技术， 在体外模拟止血。这种方法允许的参与止血与血小板的主导作用过程中的复杂的相互作用的研究。

血管损伤后，血小板粘附到暴露的内皮下基质（糖）的蛋白质，以防止失血。以下粘附，血小板激活和聚集响应于自动和旁分泌信号并最终导致形成血小板网络的，由纤维蛋白稳定化，并导致一公司，伤口密封血栓^2。与大多数其他的血小板功能检测，experi与流动室ments顾及血流的物理参数，因此，流变学对参与细胞和生物分子的^3,4的影响。

流动腔实验通过改变影响止血（分）关键参数过程，包括粘合剂基质，流变和流动剖面，蜂窝组合物，毒素或药物，离子强度等等的存在产生在止血和血栓形成里程碑式的见解。在过去的二十年中，低通量需要大样本量（10-100毫升）流动腔实验已经发展到微流控室往往由小平行板室，并包括现代技术控制在墙上剪切条件下⁵灌注全血。 Microscaling已显著增加检测的吞吐量主要是因为硬件设置简化并需要更少的（血）量，使实验更加方便和versati勒。例如，来自小实验动物的血液，现在可以无需牺牲动物使用。因此，转基因小鼠的血样已经在帮助促进或抑制止血的关键分子的鉴定，并在新的基本见解^6。

专门研究实验室还经常使用，例如定制流室从聚二甲基硅氧烷^（PDMS）7上，可以通过软件blueprinted石印模具聚合。所得室是便宜，一次性和可容易地拆卸为事后分析。此外，基本上船只，包括分叉或急转弯的任何设计可以建立在命令。这种优势也是其缺点，因为标准化已经与流室实验的首要问题，而PDMS定制室都没有帮助这一点。在这个特殊问题的顶部，涂层（条件），荧光探针，抗凝，临时erature和时间采样和分析之间都很差标准化^8。这些变量标准化是具有挑战性的，但仍然需要允许实验室间的结果进行比较。本主题是血栓与止血国际社会在对生物流变学^9,10科学和标准化分委员会的主要议题。

血小板浓缩物（PC）进行输血在从引起血小板减少和/或出血的各种疾病的患者。但血小板在个人计算机是众所周知的脱敏，特别是在放置时间¹¹功能，劣化进程链接到老化和通常被称为血小板储存损伤。据说有时，这种血小板输血一次发行¹²恢复，但对于这方面的证据是稀缺的。此外，血小板构成的PC的功能不是常规测试，因为这样的测定之间的关系的治疗或预防效力是¹³不清楚。微流体流动腔室提供给调查在个人电脑的血小板功能，以优化收集和发行之间操作的链的装置。它是PC，因为我们先前公布的^14,15和这里描述的直接（配对）比较强大的研究工具。

方案

该协议遵循了人类样本的研究机构道德准则和所涉及的所有供体获得知情同意书。从安特卫普大学医院的机构审查委员会获得批准，这里所描述的实验。

注:温度指示总是室温下，除非另有说明。

1.准备流室设置

1. 准备车道，油管和引脚
   1. 涡流的胶原悬浮液剧烈和在由提供者提供到50微克/ ml的终浓度，等渗葡萄糖溶液稀释1/20。
      注意:我们使用马肌腱胶原蛋白，主要由I型纤维的。该马I型胶原常被称为"禾木"胶原和为这种类型的测定法⁹的两个历史以及生物原因金标准。第三人型胶原也可使用，但第Ë蛋白原纤维外套较差，血小板反应不强。其它涂覆的表面也可以使用，例如血管性血友病因子（vWF），纤维蛋白原，纤连蛋白，层粘连蛋白，玻连蛋白，血小板反应蛋白-1或这些¹⁶的组合。
   2. 以从供应商的容器新的一次性生物芯片。这里使用的生物芯片的尺寸单位为mm ³ 0.4W点¯x0.1H点¯x20L。
   3. 吸管0.8微升到微流体生物芯片上的芯片和标记为出口的一端车道（多个）。确保车道填充5/6用含有1.1.1制备涂覆溶液中的胶原蛋白。确保有没有气泡。
      注意:通道被部分地涂覆，以避免胶原纤维堆积在通道的入口（见讨论）。
   4. 孵育在4℃下，在湿润的和封闭的容器4小时或过夜。
   5. 吹打封闭缓冲液（1.0％（重量/体积）牛血清白蛋白的方框涂覆频道ð0.1％（重量/体积）葡萄糖在10mM 4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸（HEPES）缓冲的盐水（HBS; 0.9％（重量/体积）氯化钠，pH值7.4）在其另一端与标记作为入口。确保该车道被完全填充有封闭缓冲避免气泡。
   6. 在等长（12厘米）的切割管道。使用每通道之一，各管一个引脚连接。例如，一个实验比较两种条件下，一式两份运行将需要四个管道伸展和四个引脚来制备。
   7. 冲洗使用注射器和一＆G针或所附连接用蒸馏水油管。
   8. 饱和用封闭缓冲液的管。商店中最少1小时的封闭和加湿容器。
2. 准备泵和阀组
   1. 冲洗泵和用蒸馏水歧管，以消除气泡。
   2. 吸出封闭缓冲液出使用在出口处的固定的10微升末端生物芯片车道（多个）。清洁的表面用精密无尘擦拭酒精变性生物芯片去除印刷品和灰尘。
   3. 修正了在自动化显微镜阶段的生物芯片。如果多于一个车道在一个运行同时使用的，八车道歧管分离器连接至生物芯片的插座。
      注意:八车道歧管分离器是一个硬件（ 图S1）连接到所述泵和生物芯片。它允许在生物芯片或车道可以是运营商定义在所附的软件的组合的所有可用（8）泳道的操作。
   4. 使用管道针修复他们在生物芯片的入口。将管接头（没有针）的1.5毫升的锥形试管填充用HBS的另一端。冲洗所有管道和它们与使用泵1毫升HBS连接通道，以便除去剩余封闭缓冲液和不良粘附胶原蛋白。

2.血液样品的制备

1. 收集和分离新鲜全血从健康志愿者^。17
   1. 收集的血液的第一毫升在含有乙二胺四乙酸（EDTA）作为抗凝剂真空管和只用自动血液分析仪使用该样本为全血计数（CBC）。
   2. 收集的血液在使用真空管合适的抗凝剂的体积。对于流动腔实验标准抗凝剂是肝素或水蛭素时血纤维蛋白形成不是研究方案和柠檬酸钠时，它是的一部分。
      注意:肝素用作在结果中所描述的所有实验中的抗凝血剂。
      注意:血液的量取决于实验次数被执行。大约1管（7ml）中为3条车道。
   3. 放置试管旋转器上挂起的血液重建。
      注意:该测定应放血的3小时内完成。
   4. 在250G离心15分钟，以制备富血小板血浆（PRP）。不要使用离心机休息，防止松散填充颗粒的干扰。
      1. 当收集多个管子，池血在一个锥形离心管中。
         注意:离心可以做更慢或长或短，取决于PRP产量和差动单元"污染"优选的。
   5. 卸下并丢弃PRP和白膜层产生浓缩红细胞少数血小板。
      注:在聚集的红细胞部分的血小板计数为13±5×10 ^3％微升（平均值±SD，N = 12），平均在我们手中。
2. 重建血
   1. 在37℃下解冻AB血型（恒河猴D阴性）等离子体进行5分钟，每4毫升20秒。
   2. 确定使用自动血液分析仪在2.1.5中制备的浓缩红细胞的血细胞比容。
   3. 确定血库的血小板浓度来制备浓缩血小板塔T将用于重建上述红细胞馏分。
   4. 计算聚集的红血细胞和血小板浓缩，将产生40％的血细胞比容和250×10 3血小板/微升1ml样品中的体积。
      注:细胞的其它靶滴度可任意设定，取决于研究协议。
   5. 转移使用裁剪吸管尖和添加血小板浓缩直至达到1毫升的样品体积堆积的红血细胞和血浆入新鲜试管。
      注意:根据所研究的变量，将血浆部分应该是所有冲调样品在等于因为等离子体具有对血栓形成速率的显著影响。例如，反复从不同供体或不同的抗凝血剂作出可能影响结果冻融或血浆。
   6. 轻轻颠倒混合重组血液和执行CBC。
   7. 制备其中血小板馏分的体积置换的"空白"对照样品用相同体积的0.9％（M / V）氯化钠的水，以确定内源性血小板中使用CBC重构血液中的浓度（ 即非血库血小板）。
3. 贴标
   1. 移液管1毫升含有1微升的5mM钙黄绿素AM（5μM的最终浓度）的试管中重构血液。
      注:其他细胞的染料可以使用^14。
   2. 通过颠倒轻轻混匀。
   3. 孵育在37℃，使用前5分钟。

3.灌注试验

1. 专注于车道的底部附着在胶原纤维的目标。理想情况下，用于此聚焦战略相衬或微分干涉对比（DIC）的设置。在实验软件选择"选定的小片区域的设置当前Z'以数字修正所选Z-位置。
2. 在的米实验软件选择的车道（XY）感兴趣区域（ROI）的区域icroscope将在实验过程中被记录。
   注:投资回报率可以是灌注车道内随意选择任何表面区域。最好是不进行分析血栓形成接近一个车道的入口和出口，以便避免在该区域中的可变流动剖面的副作用，即使这是比较小的。在ROI表面积应包含血小板的显著数或血栓，以允许信号的流平性。在这个协议中的投资回报率是得到0.62 ^平方毫米的2厘米长车道中间的三个相等大小的侧面并排图像的数字缝合集合体。
3. 轻轻颠倒混合样品并在自动阶段这些旁生物芯片的位置。
4. 放置与该生物芯片在含有重组血样试管入口连接的管路。
5. 启动用于链接到试管那些信道（根据需要或其它剪切应力），在50达因/厘米²的泵含有用泵的软件重构血样。
   注:其他的剪切应力可以被使用。
6. 记录的图像，每15秒，用显微镜的采集和实验软件实时5分钟。
   注:其他的时间序列可以根据实验设置使用。
   注意:我们一般使用放大100倍（10X物镜和10X透镜），但更高（或更低）放大率可以方便地用来作为替代。

4.洗出

1. 洗出所有管路连接于出口，并使用蒸馏水连接到多信道歧管或泵，接着次氯酸钠（漂白剂）0.5％（体积/体积），最后的0.1M NaOH水溶液。放弃固定在生物芯片的入口作为危险废物管道。

5.数据分析

1. 确定与该图像分析软件血栓生长动力学。下列命令专用于ZEN2012。
   1. 打开插件图像分析来确定血小板的表面覆盖。
   2. 坐落在分析交互式标签来定义一个积极的信号相关 ​​的像素亮度， 即在坚持血小板或血小板粘附荧光阈值。
   3. 使用创建的表自动生成的电子表格将包含那些"对象"包含的像素与所选择的阈值之间的信号的单独的表面积（以^μm2）。这是对每个时间点进行。
      注意:一旦荧光阈值已选择，分析软件会自动检测视野'对象'是符合标准。这些对象是血栓，小血小板聚集体或单个血小板并覆盖像素的数量。每个对象在电子表格中单独列出。
   4. 以XML格式保存这些电子表格和电子表格程序打开它们进一步计算。
   5. 由求和所选对象的总的表面积和由测量字段（微米^2）的总面积除以结果。这将产生的相对表面覆盖率（％）。这样做的每一个时间点。
   6. 在灌注时间函数图，这些表面覆盖范围，并通过线性回归计算斜率，产生特定条件血栓生长动力学。

结果

为了证明批内变异，三个相同的重构的全血样品，在胶原涂覆的表面（ 图1）同时灌注。这导致了8.7％的变异系数。这一统计数字表明，接受内部试验和实验室内的变化允许相关样本之间可靠的比较。

商业流室的我们在这里描述的入口垂直于测量室，这可引起轻微的湍流，而不是在该点的层流。特别是在无抗凝实验这可能会导致由于血液和固定激动剂之间的增加的接触时间的堵塞。堵塞的入口可以混淆在腔室下游的读出。因此，安装用部分涂覆流动室（ 图2）离开优化入口缺乏血小板激动剂，从而避免主次止血不及时激活。粘合面的部分涂层而且成功地在该领域¹⁶被其他研究团体。此外，这种简单实用的技巧是一种资产，研究"过渡"区，在那里流过非反应型（无涂层）表面的血液继续通过反应（涂层）部分。

输血...

讨论

微流体流室的实验是研究在流动的血液中血小板的功能一个很好的工具，用于在不同的实验环境，以评估在体外止血。尽管可怜的实验室间标准化^9，我们证明了我们的实验室内的实验误差是可以接受的。这允许一个给定的研究中比较可靠（配对）的样品。这是使用血小板存储病变，这是血小板保存在血库条件¹¹的不利后果的有案可稽现象验证。此外，我们最近公布的三个可用的病原体灭活技术在PC上血小板功能在微流控流动腔血液之后的^14,15重建的影响。

血小板有不同的反应时，生物物理和-化学参数变化^20。因此，剪切应力，细胞数和细胞composi化，温度，涂层，抗凝血剂和许多其它因素可根据所研究的问题该协议内进行修改。该协议仅使用市售硬件和软件工具，允许其他实验室以进行类似的测定。对基础研究的目的这可能是一个缺点，特别是因为可用的硬件比定制的设置功能较少。本身该法是强大的，但重复性从生物学和时间变化受到影响。因此，测定样品需要尽可能配对并研究尺寸应足够大。样品也需要时间来进行配对，因为重建血液只能存放时间短。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
BD 含 EDTA 的真空采血管	Becton， Dickinson and Company	368856
BD 真空采血管与肝素	Becton， Dickinson and Company	368480
BD 真空采血管与柠檬酸钠	Becton， Dickinson and Company	366575
水蛭素采	Roche	6675751 001
BD 真空采血管 Eclipse	Becton， Dickinson and Company	368650	带预装支架的采血针
头 移液器吸头 100-1,000	Greiner bio-one	740290
移液器吸头 2-200	Greiner bio-one	739280
移液器吸头 1-10	Eppendorf	A08928
管 5 ml	Simport	11691380
锥形管 15 ml	Greiner bio-one	1888271
锥形管 50 ml	Greiner bio-one	227261
10 ml 注射器	BD	309604
精密湿巾	Kimtech	5511
Vena8 Fluoro + Biochips	Cellix	188V8CF-400-100-02P10	在 图 S1 A 中命名为"Biochip"
Vena8 管材	Cellix	TUBING-TYGON-B1IC-B1OC-ROLL 100F	在中命名为图S1 B为"一次性管子"
Vena8针	Cellix	SS-P-B1IC-B1OC-PACK200	中命名 B为"针脚"
生物芯片单入口电缆连接器	Cellix	CONNECTORS-B1IC-PACK100
Multiflow8 connect	Cellix	MF8-CONNECT-BIC3-N-THROMBOSIS	在 图 S1 B 中命名为"可重复使用的管子"和"分流器"
加湿箱	Cellix	HUMID-BOX
软件 微流体泵	Cellix	N/A	Venaflux Assay
Horm 胶原蛋白	Takeda/Nycomed	1130630	天然马肌腱胶原蛋白（I 型） 补充
用于稀释胶原蛋白的等渗葡萄糖溶液HEPES 缓冲盐水 （HBS）	内部制备	内部制备	10 mM 4-（2-羟乙基）-1-哌嗪乙磺酸 （HEPES） 缓冲盐水 （0.9% （w/v） NaCl，pH 7.4）
封闭缓冲液		制备 内部制备	1.0% （w/v） 牛血清白蛋白和 0.1% （w/v） 葡萄糖，溶于 HBS
钙黄绿素 AM	分子探针	C1430
漂白剂 10%	内部制备	室内制备
0.1 M NaOH	室内制备	室内制备
变性醇	Fiers	T0011.5
Mirus Evo Nanopump	Cellix	188-MIRUS-PUMP-EVO	带多流8。在 图 S1 A 中命名为"泵"和"歧管"
显微镜	司	Axio Observer Z1	配备 colibri-LED 和高分辨率 CCD 相机
软件显微镜	蔡司	N/A	ZEN 2012
血液分析仪	Sysmex	N/A
台式离心机	Eppendorf	521-0095
血小板孵育器	Helmer	PF-48i
培养水浴	GFL	1013
移液器	品牌	A03429
试管滚轮	Ratek	BTR5-12V
无菌对接装置	Terumo BCT	TSCD
管道密封机	Terumo BCT	AC-155
涡流	VWR	58816-121