不同的树突状细胞亚群作为稀有群体存在于淋巴器官中，因此难以分离出足够数量和高纯度的细胞用于免疫学实验。本文介绍一种高效、高产量的方法，用于分离目前所知的所有小鼠脾脏树突状细胞主要亚群。
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摘要
摘要
树突状细胞（DCs）是专业的抗原呈递细胞，主要负责摄取、加工抗原，并将抗原呈递至抗原呈递分子上，以启动T细胞介导的免疫应答。树突状细胞可根据表型和功能分为多个异质性亚群。脾脏树突状细胞的三个重要亚群为浆细胞样树突状细胞、CD8α⁺树突状细胞和CD11b⁺树突状细胞。位置 和 CD8α阴性 细胞。浆细胞样树突状细胞是I型干扰素的天然生产者，在抗病毒T细胞免疫中具有重要作用。CD8α阴性 DC亚群专门负责MHC II类抗原呈递，在激活CD4 T细胞过程中起核心作用。CD8α位置 树突状细胞（DCs）主要负责外源性抗原的交叉提呈以及CD8 T细胞的活化启动。CD8α阳性 树突状细胞（DCs）已被证实能够通过CD1d分子向一种称为不变的自然杀伤T（iNKT）细胞的特殊T细胞群体呈递糖脂抗原，其效率最高。给予Flt-3配体可增加树突状细胞前体从骨髓迁移的频率，最终导致在小鼠模型中外周淋巴器官中树突状细胞数量的扩增。我们已采用此模型以大量纯化具有功能的树突状细胞，用于细胞转移实验，以进行比较 体内 不同DC亚群的功能熟练程度。
引言
树突状细胞（DC）近四十年前被发现作为 "大型星状（希腊 树形分子细胞" 存在于淋巴器官中1许多研究表明，树突状细胞（DCs）是唯一能够有效刺激初始T细胞的抗原提呈细胞2这些细胞的主要功能是摄取和呈递抗原，并高效地加工处理这些抗原，进而将其加载至抗原呈递分子上。在小鼠脾脏中，树突状细胞（DCs）可分为浆细胞样和经典两种亚群。浆细胞样树突状细胞的特征是低水平表达CD11c，高水平表达B220和Gr-1，同时表面标志物mPDCA1呈阳性，并可在Toll样受体9（TLR9）配体刺激下分泌I型干扰素。经典树突状细胞高表达CD11c和MHC II类分子，可根据表面表型标志物如CD4、CD8α、DEC205、CD11b以及树突状细胞抑制性受体2（DCIR2，可被33D1抗体识别）的表达情况进一步分为三个不同的亚群。 3,4CD8α位置 树突状细胞（DCs）也被称为cDC1，表达DEC205，但不表达髓系标志物如CD11b和33D1。CD8α阴性 树突状细胞（DCs），也称为cDC2，表达33D1、CD11b和CD4，但不表达DEC205。双阴性亚群（即，对CD4和CD8α均为阴性）相对罕见，且DEC205和33D1呈阴性。该亚群特征最不明确，可能是CD8α的一种低度分化形式阴性 DC
不同DC亚群之间的表型....
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方案
动物实验均按照机构动物护理与使用委员会（IACUC）批准的指南进行。所有需要无菌操作的步骤均在生物安全柜中进行。
1. 小鼠体内植入 B16.Flt3L 黑色素瘤
- 在含有10% CO2、37 °C的完全DMEM培养基中，将表达Flt-3的B16黑色素瘤细胞系以0.5 × 106 个细胞/ml 的密度接种于T25培养瓶中进行培养。持续培养至细胞融合度达到约90%（约20小时）。
- 通过胰蛋白酶消化法收集细胞。吸除细胞培养基，并用PBS洗涤贴壁细胞。加入5 ml 0.05%胰蛋白酶溶液，于37 °C孵育5分钟。加入20 ml 含胎牛血清（FCS）的冷完全DMEM培养基（4 °C）以终止蛋白酶消化反应。轻敲培养瓶使细胞脱落，随后轻轻吹打混匀。
- 在4 °C条件下，以300 × g离心10分钟 收集细胞。使用血细胞计数板或自动细胞活力计数仪对细胞进行计数。将细胞重悬于PBS中，调整浓度至108 个细胞/ml 。
- 按照Machholz et al.19所述方法，将100 µl 细胞悬液（含107个细胞）于小鼠（C57BL/6或其他组织相容性品系）颈背部皮下注射接种肿瘤细胞。
- 接种后让肿瘤生长至可触及或可....
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结果
该实验结果依赖于由植入的黑色素瘤细胞表达的小鼠 Flt-3L 所介导的树突状细胞亚群的扩增。B16.Flt3L 肿瘤源自 C57BL/6 小鼠，因此应植入具有相同品系背景的动物体内，以避免因免疫排斥导致肿瘤无法成功建立。在某些情况下，可能需要使用基因修饰小鼠，以获得在特定信号通路或受体方面存在已知缺陷的树突状细胞。需要注意的是，此类动物体内肿瘤的生长动力学可能有所不同，因此必须通过观察和触诊接种部位来密切监测肿瘤的生长情况。根据我们的经验，一旦肿瘤可被触及，携带 B16.Flt3L 肿瘤的小鼠 consistently show 脾细胞数量显著增加，且与所有树突状细胞亚群的扩增相关（图2A我们通常观察到，与未处理动物相比，B16.Flt3L黑色素瘤荷瘤小鼠脾脏中获得的总脾细胞数量增加2至3倍。树突状细胞（DC）数量的增加部分导致B细胞频率明显降低，而B细胞的绝对数量则几乎没有变化。有趣的是，尽管在这些小鼠中传统型DC的绝对数量显著扩增（约增加15至20倍），浆细胞样DC亚群仅表现出适度增加（约4倍）。
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讨论
树突状细胞被公认为是参与启动T细胞应答的主要专职抗原呈递细胞。其主要功能是通过摄取和加工抗原并将其呈递给T细胞，来监测组织微环境。为了研究特定DC亚群的功能，需要采用能够维持其正常表型和功能的方法，以获得足够数量的细胞。目前大多数方案依赖于从未经处理的小鼠中分离特定的DC亚群。由于这类细胞数量稀少，分离过程效率低下，所得细胞数量有限。例如，一只小鼠脾脏仅能获得约0.5 - 1 × 10⁶个CD8pos DCs，而大多数采用细胞转移实验的研究每只动物至少需要使用同等数量的细胞。因此，现有方法的一个主要局限在于，若不使用大量供体小鼠和大量试剂，则难以获得足够的细胞数量。我们的方法通过使用植入可分泌Flt-3L肿瘤的小鼠，显著扩增DC数量，再结合一系列免疫磁珠纯化步骤，从而能够纯化出数量显著更多的三种公认DC亚群 ，在很大程度上克服了上述问题。因此，本文所述方案在细胞得率方面比现有方法至少提高了数倍，实现了显著改进。
本研究所述的分离方案存在一些注意事项。主要局限性在于，用于分离这些细胞的操作可能会无意中改变其表型。树突状细胞（DCs）对内毒素污.......
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披露
作者声明不存在相互竞争的经济利益。
致谢
本研究工作获得了美国国立卫生研究院（NIH）/国家过敏与传染病研究所（NIAID）授予 S.A.P. 的资助项目 AI45889 的支持。流式细胞术研究使用了阿尔伯特·爱因斯坦癌症中心（美国国立卫生研究院/国家癌症研究所 CA013330）和艾滋病研究中心（美国国立卫生研究院/国家过敏与传染病研究所 AI51519）资助的 FACS 核心设施。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 0.05% 胰蛋白酶-EDTA | Life Technologies，Gibco | 25300-054 | |
| 异氟烷 | Sigma-Aldrich | CDS019936-250MG | |
| 胶原酶D | 罗氏诊断 | 11088858001 | |
| DNase I（干粉） | QIAGEN | 79254 | |
| 200 proof 乙醇 | Thermo Fisher Scientific | 9-6705-004-220 | 用于配制70%乙醇 |
| 红细胞裂解缓冲液 | Sigma-Aldrich | R7757 | |
| 含L-谷氨酰胺的RPMI-1640培养基 | Life Technologies，Gibco | 11875-119 | |
| 含L-谷氨酰胺的DMEM培养基 | Life Technologies，Gibco | 11995-073 | |
| 200 mM L-谷氨酰胺 | Life Technologies | 25030081 | |
| MEM 非必需氨基酸 | Life Technologies，Gibco | 11140-050 | |
| MEM必需氨基酸 | Life Technologies | 11130-051 | |
| β-巯基乙醇 | Life Technologies，Invitrogen | 21985-023 | |
| 丙酮酸钠 | Life Technologies | 11360-070 | |
| HEPES | Life Technologies，Invitrogen | 15630 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS Ca2+ 和 Mg2+ pH 7.2，无自由基 | Life Technologies，Invitrogen | 20012-050 | |
| 杜尔贝科’s PBS（含Ca的DPBS）2+ 和 Mg2+) | Life Technologies，Gibco | 14040-182 | |
| 0.5 M 乙二胺四乙酸（EDTA）溶液 | Life Technologies | 15575-020 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma-Aldrich | A2153 | |
| 胎牛血清 | Atlanta Biologicals | S11050 | |
| 青霉素/链霉素 | Life Technologies，Invitrogen | 15140-163 | |
| 台盼蓝（干粉） | Sigma-Aldrich | T6146-5G | 用 PBS 配制 0.08% |
| 小鼠浆细胞样树突状细胞分离试剂盒 II | Miltenyi Biotech | 130-092-786 | |
| 与抗小鼠 CD11c 偶联的磁珠 | Miltenyi Biotech | 130-152-001 | |
| CD8α阳性 小鼠DC分离试剂盒 | 美天旎生物技术 | 130-091-169 | |
| Fc-γ受体阻断抗体（克隆2.4G2） | BD Biosciences | 553141 | |
| 抗小鼠 CD11c-FITC | BD Biosciences | 553801 | |
| 抗小鼠 CD8α-PerCP | BD Biosciences | 553036 | |
| 抗小鼠 B220-PE | BD Biosciences | 553090 | |
| 1 ml 注射器 | BD | 26048 | |
| 23 G1 针头 | BD | 305145 | |
| 100 mm 皿 | Thermo Fisher Scientific | 875712 | |
| 手术器械 | Kent Scientific | INSMOUSEKIT | |
| 细胞筛（70 µm) | BD | 352350 | |
| 大号培养皿 | 赛默飞世尔科技 | FB0875712 | |
| 真空过滤系统（500 ml（0.22 µm) | 康宁 | 431097 | |
| LS 柱 | Miltenyi | 130-042-401 | |
| 磁力架 MACS 分离器 | Miltenyi Biotec | 130-042-302 | |
| 宽孔径 200 μl 移液器吸头 | PerkinElmer | 111623 | |
| Corning 超低吸附 96 孔板 | 康宁 | CLS3474-24EA | |
| 6-8周龄雌性C57BL/6小鼠 | 杰克逊研究所，Jax | ||
| 小鼠 B16.Flt3L 黑色素瘤细胞系 | 由 Mach 描述 等人, 2000 | ||
| 无血清 DMEM 和 RPMI 培养基 500 ml DMEM 含 L-谷氨酰胺，或 500 ml RPMI-1640 含 L-谷氨酰胺 5 ml MEM 非必需氨基酸（100倍，10 mM 5 ml HEPES缓冲液（1 M） 5 ml L-谷氨酰胺（200 mM 0.5 ml 2-巯基乙醇（5.5 × 10-2 M) | 在生物安全柜中，根据需要使用 DMEM 或 RPMI 培养基混合所有成分。通过 0.22 微米滤膜过滤培养基以实现过滤除菌。 µm 真空过滤系统 | ||
| 完全 RPMI 和 DMEM 培养基 | 向无血清的 RPMI 或 DMEM 培养基中加入 50 ml 热灭活的胎牛血清，制备完全培养基。 | ||
| MACS 缓冲液 | 加入 2 ml 0.5 M EDTA 和 10 ml 热灭活的胎牛血清至 500 ml 磷酸盐缓冲液（PBS, Ca2+ 和 Mg2+ 游离，pH 7.2）和 2 µg/ml 2.4G2（Fc阻断抗体） | ||
| FACS 染色缓冲液 | 将叠氮化钠溶解于MACS缓冲液中至0.05%（每500 ml加入0.25 g），配制FACS染色缓冲液 | ||
| 10倍浓度胶原酶D和DNase 1储存液 将 1 g 胶原酶 D 和 0.2 ml DNase 1 储存液（1 mg/ml，100 倍浓度）溶解于 20 ml 含 Ca 的 PBS 中2+ 和 Mg2+ 获得每毫升约含 1,000-2,000 单位胶原酶活性的溶液。 | 该10倍储存液可预先配制，并于-20℃保存 °C 下保存数周。使用前立即用 9 ml 无血清 RPMI 培养基稀释 1 ml 该溶液。 |
参考文献
- Steinman, R. M., Cohn, Z. A. Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution. J Exp Med. 137 (5), 1142-1162 (1973).
- Banchereau, J., Steinman, R. M. Dendritic cells and the control ....
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