小鼠树突状细胞亚群的分离的高效和高产的方法

Summary

独特的树突状细胞亚群在淋巴器官中作为稀有群体存在，因此难以分离出足够数量和纯度的免疫学实验。在这里，我们描述了一种高效、高产量的方法，用于分离所有目前已知的小鼠脾树突状细胞的主要亚群。

Abstract

树突细胞（DC）是专业的抗原呈递细胞用于获取，处理和对抗原呈递分子以引发T细胞介导的​​免疫呈递的抗原主要责任。树突状细胞可被分离成多个表型上和功能上异质子集。脾树突状细胞的三个重要子集浆^，CD8αPOS和CD8α ^负片细胞。的浆DC是I型干扰素的天然生产者和用于抗病毒的T细胞免疫重要。该CD8α ^负片 DC亚群是专门为MHCⅡ类抗原呈递并集中参与吸CD4 T细胞。该CD8α ^波什的DC是外源性抗原和CD8 + T细胞引发的交叉呈现负主要责任。所述CD8α ^方位的DC已被证明是最有效的在由CD1d的分子糖脂抗原的呈现给专用的T CEL被誉为不变的自然杀伤T（的iNKT）细胞L群体。的Flt-3配体的施用增加了从骨髓的树突状细胞前体的迁移的次数，最终导致在小鼠模型外周淋巴器官的树突状细胞的扩张。我们已经适应了这种模式来净化大量功能性树突状细胞在细胞转移实验使用比较体内不同的DC亚群的能力。

Introduction

树突状细胞（DC）近四十年前被发现的"大星状（希腊树枝 ）细胞"淋巴器官¹中。许多研究表明，DC是，能有效地刺激幼稚T细胞²的唯一的抗原呈递细胞。这些细胞的主要功能是吸收和抗原的演示和高效的处理和这些装载到抗原呈递分子。在小鼠脾，DCS可以分离成浆和常规子集。该浆区议会由CD11c的低表达和高层次的B220和GR-1的表征。他们还积极为表面标志mPDCA1和分泌型我回应样受体9（TLR9）配体干扰素收费。传统的DC是很高的表面CD11c和MHC II类的表达。它们可以分成基于表型标记如CD4，CD8α，DEC205，CD的表面表达三种不同的亚群11b和树突细胞抑制性受体2（DCIR2由33D1抗体识别）的蛋白质^3,4。所述CD8α ^方位的DCs也称为CDC1，是阳性DEC205，但阴性骨髓标志物例如CD11b和33D1。该CD8α ^负片的DC，也叫CDC2，都积极为33D1，CD11b和CD4但缺乏DEC205。双重否定的子集（ 即阴性CD4和CD8α）是比较少见的，而且是负DEC205和33D1。它是最特征子集，并且可以是CD8α ^负片直流的较少分化形式。

在各个DC亚群的表型差异也延伸到他们的体内功能。所述CD8α ^负片 DC是高度吞噬细胞和被认为呈现外源抗原主要通过MHC II类到的CD4 T细胞^3。与此相反，CD8α ^方位 DC是专门用在MHC I类可溶性蛋白抗原的介绍在一种机制称为交叉呈递。交叉呈递的结果取决于这些树突⁵的激活状态，并且可以导致细胞毒性T细胞（CTL）或调节性T细胞^{6 2,7-}发展扩大。针对使用抗DEC205抗体介导的递送结果在很大程度上T细胞⁸的缺失抗原CD8α ^波什的DC，而从感染的细胞凋亡细胞的抗原的演示诱导强CTL反应^9。

除了识别肽抗原的，哺乳动物免疫系统已发展到识别脂质和糖脂抗原。这些抗原由CD1分子，其是存在于各种哺乳动物多个相关形式I类MHC样细胞表面蛋白呈现。在小鼠中，称为CD1d的高度保守的CD1分子的单一类型的负责糖脂抗原¹⁰的介绍。专业识别CD1d分子/糖脂复合物的T细胞群被称为不变NKT细胞（iNKT细胞）。这些细胞表达了与TCRβ链具有有限多样性¹¹配对的不变TCRα链组成的半不变的T细胞受体（TCR）。不像需要增殖和分化成为活化的效应T细胞的常规T细胞，iNKT细胞存在作为效应人口并开始糖脂给药¹²后迅速响应。生理相关脂质抗原呈递细胞的识别是一个活跃的研究领域，并且几种不同的细胞类型，例如B细胞，巨噬细胞和DC已经被建议来执行此功能。然而，有人证明DC的CD8α ^方位子集是主要的细胞介导的摄取和脂质抗原呈现给小鼠iNKT细胞¹³和CD8 T细胞¹⁴的糖脂介导的交叉敏化。

ove_content">要由不同的抗原呈递细胞比较抗原呈递的效率，一个直接的方法是转移不同类型的抗原等量的脉冲进入幼稚主机。纯化的APCs这种类型的细胞转移实验通常为免疫学研究进行的。然而， 离体抗原处理的DC进行转移的研究是具有挑战性的，因为这些细胞存在于其中，它们构成总细胞¹⁵的小于2％的淋巴器官为罕见的人群。因此，有必要提高这些细胞的供体动物的发展增加的隔离协议的效率。

众所周知，在普通的淋巴和常见髓系祖细胞，其需要用于产生的pDC，CD8 ^方位和CD8 ^负片 DC亚群，快速FMS相关受体酪氨酸激酶3（FLT-3）的。 在体内的Flt-3配体（FLT-3L）给药，emigratFlt-3的表达来自骨髓祖细胞的离子增加，导致外周淋巴器官的增加的播种和它们的成熟的DC子代¹⁶的扩张。承诺B，T或NK细胞分化的途径中损失FLT-3的表达。因此，只有很少的改变是在这些细胞中时的Flt-3L给药观察到。在DC群相似膨胀荷瘤小鼠由B16黑素瘤细胞系分泌的鼠的Flt-3L，其中提供了用于提供的Flt-3L ^17,18的持续全身水平的简单和经济的方法的注入而产生的肿瘤中观察到。使用这种方法，我们已开发了基于对B16黑色素瘤细胞的分泌的Flt-3L刺激小鼠脾所有正常DC亚群的膨胀，从而大大增加了这些细胞可被分离用于随后的实验的收率植入一个协议。我们一贯发现，在10 - 皮下IM14天在FLT-3分泌肿瘤的种植，小鼠树突状明显富集脾肿大发展构成40 - 总脾细胞的60％。从这些脾脏，不同的DC亚群可以使用标准的高纯度雇用特定子集，表型标记市售的细胞纯化试剂盒进行隔离。

Protocol

动物实验是根据从体制动物护理和使用委员会（IACUC）批准的指导方针进行。所有需要无菌过程在生物安全柜进行。

1.小鼠黑色素瘤B16.Flt3L植入

1. 培养的Flt-3的表达B16黑色素瘤细胞中的T25组织培养瓶中以0.5×10 ⁶细胞/ ml，在完全DMEM培养基中10％的CO ₂的密度，在37℃线。生长，直到细胞达到〜90％汇合（约20小时）。
2. 由胰酶消化收获细胞。抽吸细胞培养基和洗涤贴壁细胞用PBS。添加5毫升0.05％胰蛋白酶并在37℃下孵育5分钟。添加冷20毫升完全DMEM培养基含有胎牛血清（FCS）（4℃）以猝灭蛋白酶消化。轻轻抬起关闭单元的割胶随后向下轻轻吹打起来。
3. 通过在300离心收集细胞xg离心在4℃下10分钟。算使用血球或自动化细胞存活率计数器细胞。悬浮于PBS中10 ^8个细胞/ ml的密度。
4. 通过皮下注射植入小鼠（C57BL / 6或另一组织相容性菌株）与肿瘤细胞如Machholz 等人 ¹⁹在用100μl细胞悬浮液（10 ⁷个细胞）的颈部的底部说明。
5. 让肿瘤生长，直到扪或可见牺牲动物器官收获前（2 - 1天 - 直径10毫米，一般为7）。

从荷瘤小鼠的脾单细胞悬液的2.准备工作

1. 麻醉小鼠异氟醚过量的（调整异氟醚的流量> 5％，并继续呼吸停止暴露后至少2分钟）。根据安乐死的机构的指导方针颈椎脱臼牺牲FLT-3黑色素瘤轴承鼠标。
2. 迪sinfect使用无菌技术，用无菌剪刀²⁰的辅助下，用70％的乙醇和收获脾皮肤。
3. 将脾脏进入无菌培养皿运输生物安全柜。在执行无菌条件下从这里的所有步骤。
4. 脾脏转移到一个新的培养皿中，并用RPMI培养基清洗。切脾为使用手术刀小（大约需要0.2 ^平方厘米）件。用10ml胶原酶/ DNA酶溶液温育30分钟，在37℃。
5. 倾脾组织的部分消化悬浮到70微米的细胞滤网。通过使用5毫升注射器柱塞过滤器的网眼压缩剩余组织碎片。
6. 用10ml新鲜培养基冲洗网状过滤器并丢弃滤波器。离心该悬浮液在300×g离心10分钟，在4℃以沉淀细胞。
7. 吸出上清液，重悬细胞沉淀在2ml RBC裂解缓冲液中。孵育RT˚F或10分钟。通过加入10ml的完全RPMI培养基猝灭RBC裂解缓冲液中。
8. 离心300 xg离心沉淀细胞在4℃5分钟。悬浮在适当体积以实现在含有20微克/毫升的Fc-块抗体（2.4G2）的细胞分选缓冲液（ 例如，MACS）的10 ^8个细胞/ ml的细胞密度。

从脾单细胞悬液浆的DC，CD8α ^波什 DC和CD8α ^负极性的DC 3.净化

注意:从单细胞悬液脾DC亚群的分离是如在图1中所示的多步方法，用预冷却的缓冲液和冰水浴维持在4个温度下进行所有步骤- 8°C。在该协议的以下部分中的所有试剂体积计算为200微升脾细胞悬浮液以10 ⁸细胞/ ml）的初始输入。这可以扩大或通过改变细胞悬浮液的体积（总是在1×10 ^8个细胞/ ml的密度）和其他试剂比例在初始步骤（3.1.1和3.2.1）向下根据你的需要。调整试剂卷因此以后所有步骤。例如，如果开始以1×10 ⁸ / ml的100μl的脾细胞悬浮液，使用一半的所有步骤的所述试剂的卷。

1. 浆的DC隔离（PDC）
   1. 加入300微升的浆细胞DC隔离套件提供给200微升脾细胞悬液，生物素标记的抗体混合物。
   2. 调匀并在冰水浴孵育15分钟。轻按管每3分钟，以保持悬浮细胞，以最大限度地提高抗体结合。
   3. 离心在300×g下上加12 ml的细胞分拣缓冲液和沉淀细胞5分钟，在4℃。吸去上清液，以除去未结合的生物素化的抗体。
   4. 悬浮细胞沉淀在500微升细胞分选缓冲。添加300微升抗生物素抗体共轭珠。重复步骤3.1.2和3.1.3。
   5. 弃上清，重悬细胞沉淀在2毫升细胞分选缓冲。执行使用预冷却缓冲器从这点上在RT的所有步骤。
   6. 将新鲜的磁性细胞在磁力架排序LS列。洗并用5毫升细胞分拣​​缓冲液平衡柱。
   7. 吸取细胞悬浮液上柱，轻轻将其应用于柱床的表面的中心。收集通过的流动。
   8. 用10毫升细胞分拣​​缓冲液洗柱。通过收集该流并与流通过从步骤3.1.7结合。该pDC细胞富集通过（FT1）此列流动。
   9. 在300 xg离心沉淀从FT1的细胞离心5分钟，在4℃下，悬浮在2ml细胞分拣缓冲液，并通过一个新鲜的LS柱通过细胞重复步骤3.1.6 - 3.1.8。这种使用两个连续列的产生分离细胞的纯度提高。
   10. 沉淀细胞，在300×g离心5分钟，离心在4℃下，并重新悬浮用2ml完全RPMI。直到需要置于冰上。
2. ^CD8αPOS和CD8α ^负极性的DC隔离
   注意:在此过程中的第一步骤为B，PDC，T和NK细胞的耗竭。
   1. 与整个脾细胞悬浮液（1毫升在步骤2.8获得的10 ^8个细胞/ ml）开始，加入100微升的CD8α ^方位直流隔离试剂盒中提供的生物素缀合的抗体混合物。
   2. 拌匀并在冰水浴孵育15分钟。挖掘管轻轻每3分钟以生物素标记的抗体的结合最大化其靶细胞。
   3. 离心300 XG上加12 ml的细胞分拣缓冲液和沉淀细胞5分钟，在4℃。超级吸游泳除去未结合的生物素化抗体。
   4. 添加细胞分拣缓冲液150微升和100微升在CD8α ^方位直流分离试剂盒提供抗生物素珠。拌匀并在冰水浴孵育15分钟。
   5. 离心300 XG加入10 ml的细胞分拣缓冲液和沉淀细胞5分钟，在4℃。
   6. 悬浮细胞在1ml细胞分拣缓冲，并根据在步骤3.1.6至3.1.8程序越过一个新鲜的LS柱。
   7. 收集通过2（FT2）的未标记的流并丢弃柱滞留。此无标签部分富集了^CD8αPOS和CD8α ^负片的DC。
   8. 在300 xg离心沉淀在FT2细胞离心在4℃下5分钟。
   9. 重悬在1ml的细胞分选缓冲液中的细胞，并添加200微升的在CD8α ^方位直流分离试剂盒提供抗CD8α偶联的磁珠。
   10. 众议员吃步骤3.2.2通过3.2.6。通过柱的流动被富集CD8α ^负片 DC和贫为CD8α ^方位的DC。这是通过图3（FT3）标记的流动。
   11. 为了洗脱CD8α ^方位的DCs保留在柱中，从磁体取出柱，加入5 ml的细胞分拣缓冲液中，使用提供与LS柱柱塞吹扫柱基质。
   12. 离心300 xg离心沉淀细胞在4℃5分钟。抽吸上清，重悬在1ml的细胞分选缓冲液中。为了提高纯度，通过一个新的LS列重复步骤3.1.6再次运行洗脱细胞3.1.8，除了放弃通过流量和收集留存细胞在3.2.11。
   13. 从FT3悬浮液净化CD8α ^负片的DC，沉淀通过离心FT3在300×g离心5分钟，在4℃下，并在300微升细胞分拣缓冲液中重悬。
   14. 加入100微升抗CD11c MAG的NETIC珠。拌匀并在冰水浴孵育15分钟。
   15. 离心300 XG加入10 ml的细胞分拣缓冲液和沉淀物的细胞5分钟，在4℃。
   16. 重复步骤3.1.5至3.1.8。所述CD8α ^负片的DC具有正的CD11c微珠选择并结合到柱上。流体通过可被丢弃。
   17. 洗脱保留在柱中的细胞作为在步骤3.2.11收集纯化的CD8α ^负片的DC说明。

4.脉动装甲运兵车与抗原和细胞转移

1. 使用计数台盼蓝²¹提纯区分活的和死细胞后活细胞。
2. 孵育选择的抗原的细胞。在100nM的浓度¹³使用糖脂抗原称为阿尔法半乳糖神经酰胺（αGalCer）类似物。通常，使用超低ATTAC板10 ⁶活细胞/孔在完全RPMI培养基中hment U底96孔板，以尽量减少细胞附着。孵育在5％ _的 CO ₂气氛中的细胞在37℃，1 - 4小时。
3. 收获细胞轻轻吹打数次。使用大口径的枪头，以尽量减少剪切力细胞损伤。用PBS洗井，集中这些洗涤以最大限度地提高电池的收获。
4. 沉淀细胞，在300×g离心5分钟，在4℃下重悬在PBS中期望的密度。通常情况下，注射1万个细胞中每个收件人动物200微升。保持冰的细胞给药前活力最大限度地发挥到​​宿主动物。
5. 注入细胞静脉内到小鼠无论是通过横向尾静脉或眶后静脉丛^19。使用上的1ml注射器一个27克的针，并注入0.1ml的每只小鼠的最大体积。

Results

此程序的结果依赖于鼠的Flt-3L膨胀DC亚群由植入的黑色素瘤细胞中表达。该B16.Flt3L肿瘤是从C57BL / 6小鼠衍生的，而应该注入到动物与菌株背景中，以避免由于拒绝成为建立的肿瘤的故障。在某些情况下，可能需要使用转基因小鼠来推导在信号传导途径或感兴趣的受体与公知的缺陷的DC。重要的是要记住，肿瘤可能与在这些动物不同动力学发展是很重要的，所以根据外观和触诊在接种部位监测肿瘤生长是重要的。根据我们的经验，一旦肿瘤是显而易见的，在B16.Flt3L荷瘤小鼠一直显示在所有的DC亚群（ 图2A）的扩张相关的细胞结构脾明显增加。我们通常看到一个2到3倍，人口增加E在从相比幼稚动物B16.Flt3L黑素瘤携带小鼠获得的总脾细胞的数目。直流的部分数量的增加有助于B细胞的频率明显降低，而很少有在B细胞的绝对数量没有变化。有趣的是，当一个大的扩展（〜15中的绝对数量20倍的增加）被用于在这些小鼠中常规的DC观察到的，只有在浆细胞DC子集观察的适度增加（约4倍）。

Discussion

树突细胞接受是主要的专业抗原呈递参与T细胞应答的引发细胞。它们的主要功能是通过吸收和处理抗原呈现给T细胞来调查组织微环境。为了研究特定DC亚群的功能，这些需要使用保持其正常的表型和功能的方法在足够数量的分离。大多数协议依赖于特定DC亚群，从天真的小鼠隔离。因为这些细胞是罕见的，所述分离步骤是效率不高，并产生细胞的数量低。例如，一种脾将产生仅约0.5 -百万CD8 ^POS的DC，而用转移研究进行大多数实验至少使用这个号码每只动物的细胞。因此，现有的方法的一个主要局限性是不能在不使用供体小鼠和大量体积的非常大的数字来分离足够的细胞数量的试剂。我们的方法基本上克服了使用具有的Flt-3L分泌肿瘤植入到大大扩大的DC小鼠中，使用了一系列的免疫纯化步骤允许三种公认的DC子集的更大数量的纯化这些问题。这里所描述的协议，因此通过至少数倍提供在收率方面优于现有方法的重大改进。

几个注意事项此处描述的隔离协议存在。主要的限制是，用于分离这些细胞可能会无意中改变其表型的过程。 DC是内毒素污染和机械刺激，可能导致在它们的表型和功能的变化非常敏感。这种技术的另一个限制是对的Flt-...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.05% 胰蛋白酶-EDTA	Life Technologies， Gibco	25300-054
异氟醚	Sigma-Aldrich	CDS019936-250MG
胶原酶 D	Roche Diagnostics	11088858001
DNase I （干粉）	QIAGEN	79254
200 级乙醇	Thermo Fisher Scientific	9-6705-004-220	用于制备 70% 乙醇
RBC 裂解缓冲液	Sigma-Aldrich	R7757
RPMI-1640 培养基与 L-谷氨酰胺	Life Technologies， 含 L	11875-119
DMEM 培养基	Life Technologies， Gibco	11995-073
200 mM L-谷氨酰胺	Life Technologies	25030081
MEM 非必需氨基酸	Life Technologies， Gibco	11140-050
MEM 必需氨基酸	Life Technologies	11130-051
&β;-巯基乙醇	Life Technologies， Invitrogen	21985-023
丙酮酸钠	Life Technologies	11360-070
HEPES	Life Technologies， Invitrogen	15630
磷酸盐缓冲盐水 （PBS Ca2+ 和 Mg2+ free pH 7.2）	Life Technologies， Invitrogen	20012-050
Dulbecco's PBS（含 Ca2+ 和 Mg2+）	Life Technologies，Gibco	14040-182
0.5 M 乙二胺四乙酸酯 （EDTA） 溶液	Life Technologies	15575-020
牛血清白蛋白 （BSA）	Sigma-Aldrich	A2153
胎牛血清	Atlanta Biologicals	S11050
青霉素/链霉素	Life Technologies， Invitrogen	15140-163
台盼蓝（干粉）	Sigma-Aldrich	T6146-5G	用 PBS 制备 0.08%
浆细胞样树突状细胞分离试剂盒 II，小鼠	Miltenyi Biotech	130-092-786
与抗小鼠 CD11c 偶联的磁珠	Miltenyi Biotech	130-152-001
CD8αPos 鼠标直流隔离套件	Miltenyi Biotech	130-091-169
Fc-γ受体阻断抗体（克隆2.4G2）	BD Biosciences	553141
抗小鼠CD11c-FITC	BD Biosciences 553801
抗小鼠CD8&α;-PerCP	BD Biosciences 553036
抗小鼠 B220-PE	BD Biosciences	553090
1 ml 注射器	BD	26048
23 G1 针	BD	305145
100 mm 培养皿	Thermo Fisher Scientific	875712
手术器械	Kent Scientific	INSMOUSEKIT
细胞过滤器 （70 µm）	BD	352350
大培养皿	Thermo Fisher Scientific	FB0875712
真空过滤系统（500 ml（0.22 µm））康	宁	431097
LS 色谱柱	Miltenyi	130-042-401
磁力架 MACS 分离器	Miltenyi Biotec	130-042-302
宽口径 200 &μ;l 移液器吸头	PerkinElmer	111623
Corning 超低吸附 96 孔板	康宁	CLS3474-24EA
6-8 周龄雌性 C57BL/6 小鼠	杰克逊研究实验室，Mach
小鼠 B16.Flt3L 黑色素瘤细胞系			，2000
无血清 DMEM 和 RPMI 培养基 500 ml DMEM 与 L-谷氨酰胺，或 500 ml RPMI-1640 与 L-谷氨酰胺 5 ml MEM 非必需氨基酸（100x， 10 mM） 5 ml HEPES 缓冲液 （1 M） 5 ml L-谷氨酰胺 （200 mM） 0.5 ml 2-巯基乙醇 （5.5 x 10-2）			需要，将生物安全柜中的所有成分与 DMEM 或 RPMI 培养基混合。过滤器通过一个 0.22 µm 真空过滤系统。
complete RPMI 和 DMEM 培养基			将 50 ml 热灭活的胎牛血清添加到无血清 RPMI 或 DMEM 培养基中，以获得完全培养基。
MACS 缓冲液			将 2 ml 0.5 M EDTA 和 10 ml 热灭活胎牛血清加入 500 ml 磷酸盐缓冲盐水（PBS，Ca2+ 和 Mg2+ Free，pH 7.2）和 2 &微;g/ml 2.4G2 （Fc-Block 抗体）。
<强>FACS 染色缓冲液			MACS 缓冲液中将叠氮化钠溶解至 0.05%（每 500 ml 0.25 g），得到 FACS 染色缓冲液
10x 胶原酶 D 和 DNase 1 储备液 将 1 g 胶原酶 D 和 0.2 ml DNase 1 原液（1 mg/ml，100x）溶于 20 ml 含有 Ca2+ 和 Mg2+ 的 PBS 中，以获得每毫升约 1,000-2,000 单位胶原酶活性的溶液。			这种 10x 储备溶液可以提前制备并储存在 -20 °C 几周。临用前立即用 9 ml 无血清 RPMI 稀释 1 ml。