本文介绍了一种视频成像技术及高分辨率时空图谱方法，用于识别成年小鼠结肠运动神经调控的变化。利用该方法在离体组织样本中可检测胃肠道（GI）功能的细微影响，从而增进对胃肠道疾病的理解。
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摘要
摘要
肠神经系统（ENS）在调节胃肠道（GI）运动功能中起着重要作用，且可独立于中枢神经系统运作。ENS功能的改变是胃肠道症状和疾病的主要原因，也可能导致包括自闭症在内的神经精神疾病中所报告的胃肠道症状。已有充分证据表明，离体结肠节段能够产生称为结肠移行性运动复合波（Colonic Migrating Motor Complexes, CMMCs）的自发性节律性收缩。一种用于分析肠神经对CMMCs调控作用的实验方法 离体 描述了小鼠结肠的制备方法。将结肠从动物体内解剖取出，冲洗以清除粪便内容物，随后在器官浴中进行插管。通过位于器官浴上方的视频摄像机采集数据，并利用自主研发的软件包将其转换为高分辨率时空图。利用该技术，可在3–4小时内比较结肠节段的基础收缩模式以及药物对肠神经系统（ENS）功能的影响。此外，还可记录周期性移行性肌电复合波（CMMCs）的传播长度和速度，以及肠道直径和收缩频率的变化。该技术适用于在转基因小鼠模型（以及其他物种，包括大鼠和豚鼠）中表征胃肠道运动模式。通过该方法，可在野生型小鼠及Neuroligin-3小鼠中记录药物诱导的CMMCs变化R451C 自闭症小鼠模型。此外，该技术还可应用于小鼠胃肠道的其他区域，包括十二指肠、空肠和回肠，并可用于不同发育阶段的小鼠。
引言
肠神经系统（ENS）是胃肠道内在的神经网络，可调节多种功能，如肠道内容物的消化、营养物质的吸收以及液体的分泌和重吸收。ENS的神经元位于肌间神经丛和黏膜下神经丛中。肌间神经丛在调节胃肠道运动功能中起主要作用1，而黏膜下神经丛则主要参与分泌活动的调控2,3。肌间神经丛位于胃肠道壁的纵行肌层与环形肌层之间。肠壁平滑肌层的收缩活动通过混合和推进肠内容物沿肠道移动，从而促进胃肠道的主要功能3。尽管中枢神经系统（CNS）对胃肠道的外来神经支配在体内（in vivo）对胃肠道功能有所贡献，但ENS能够独立调控胃肠道功能。这一独特特性使得在离体（ex vivo）条件下对肠神经回路的功能及其对胃肠道运动的贡献进行研究成为可能。
结肠移行性运动复合波（CMMCs）是一种自发的神经源性事件，在无粪便颗粒存在的情况下，是离体小鼠结肠中最主要的运动模式4-9。CMMCs被定义为沿水平方向传播的节律性收缩，其传播距离至少达到结肠总长度的一半（即 从盲肠至直肠）10。目前，CMMCs与推动粪便颗粒的收缩模式之间的关系尚不明确，但已有研究报道了二者在药理学上的某些差异11。尽管如此，肠神经系统（ENS）在不依赖中枢神经系统（CNS）的情况下仍具备功能，且离体结肠中存在神经介导的运动模式，这为研究由潜在ENS功能障碍引起的运动异常提供了一个理想的检测系统。胃肠道运动模式的自发性使得研究人员能够评估其对药理学刺激所产生功能变化的反应。
视频成像与时空图谱技术最初被开发用于定量研究豚鼠小肠的蠕动12。本文描述了一种离体技术，该技术通过视频成像记录小鼠结肠运动模式，并对这些录像进行分析，以构建结肠直径随结肠位置和时间变化的高分辨率（约100 µm，33 msec）图谱（即时空图谱）。利用自主研发的边缘检测软件（Analyse2；可应要求提供），对实时收缩的全长结肠节段数据进行处理，为每次实验生成相应的时空图谱。在此步骤中，视频（AVI）文件被汇总并通过Analyse2转换为时空图谱。时空图谱（图2）可直观显示随时间变化的收缩活动，并可用于测量多种参数，包括传播速度、收缩幅度、长度和持续时间。在整个实验过程中，肠道直径也被持续记录，作为评估组织节段整体收缩活性的指标。该方法可用于识别收缩复合波起始点的差异，从而提示肠神经系统连接可能发生改变。
已有研究报道了一种类似的视频成像方案，用于评估豚鼠的粪丸推进功能13，但本文中我们概述了该视频成像方法在定量分析自发性结肠运动（即，无粪丸存在情况下）中的应用。我们还提供了详细的说明，以协助进行胃肠道组织的解剖与视频成像前的样本制备。本方案为研究人员提供了一种易于获取且可重复性高的工具，可用于在疾病动物模型（包括基因工程小鼠模型）中分析肠神经系统对胃肠道功能的调控作用。
视频成像技术可实现对结肠运动功能在不同药理学试剂作用下的分析。药物可通过肠腔或结肠标本外部的器官浴进行给药。小鼠胃肠道的不同区域表现出特定的运动模式，例如小肠的分节运动以及结肠中的集簇性多点收缩（CMMCs）。
该技术已用于鉴定小肠功能的品系差异以及对5-HT的差异性敏感度3 和 5-HT4 由于Balb/c和C57/Bl6小鼠中该基因的多态性性质，在其空肠中观察到了拮抗剂的存在 tph2 两种菌株中表达的基因65-羟色胺抑制对运动功能的影响仍存在争议，因为关于内源性5-羟色胺在结肠蠕动和周期性移行性收缩波（CMMCs）中作用的研究报道结果相互矛盾。14,15发育过程中产前与产后运动能力的变化7以及基因突变在疾病动物模型中对胃肠道动力的影响10 也可以通过视频成像技术进行观察。本文以NL3结肠运动功能研究为例，说明该方法的应用。R451C 自闭症小鼠模型，该模型在 Nlgn3 编码突触黏附蛋白Neuroligin-3的基因16该突变最初在被诊断为自闭症谱系障碍（ASD）的患者中发现。17，这与胃肠道功能障碍密切相关18-22我们利用视频成像技术，探究NL3 R451C突触突变是否影响肠道神经系统（ENS）中的神经输出。本文展示了在基础状态下及对5-羟色胺能激动剂5HT的反应中，结肠微区运动复合波（CMMCs）特征的数据。3/4 受体拮抗剂托烷司琼 在NL3中R451C 自闭症小鼠模型
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方案
所有实验前的动物操作及颈椎脱位均严格遵循墨尔本大学动物实验委员会批准的方案进行（伦理编号：1212494.7）
1. 组织采集与解剖
- 通过颈椎脱位处死成年小鼠。若可能，应避免使用麻醉，以防通过目标神经元群体上的受体影响肠道功能。
- 记录动物的总体重，使用皮下注射针头（规格：20 G）通过四肢将动物腹部朝上固定于解剖板上。
- 使用解剖镊和剪刀，在覆盖下腹部肌肉层的表皮上做一切口。继续使用镊子和剪刀沿腹部中线切开腹腔，直至胸骨。
- 为防止组织脱水，加入生理盐水（克雷布斯溶液：118 NaCl，4.6 KCl，2.5 CaCl₂）2，1.2 MgSO₄4, 1 NaH2PO4，25 NaHCO₃3，11 毫摩尔 D-葡萄糖——在室温下用碳氧混合气体（95% O₂）饱和2 和5% CO2 至少 20 分钟）定期作用于腹腔内容物（即， 在解剖过程中，每隔30-60秒进行一次。
- 在分离与盲肠和直肠相连的结肠时，用解剖镊轻轻夹住盲肠（位于结肠近端附近），位置约在动物体上方4-5 cm处，同时使用精细解剖剪修剪肠系膜。
- 去除相邻的肠系膜时，注意不要触碰、拉伸或切割胃肠道组织。
- 去除多余组织（即，膀胱和睾丸）。使用粗剪刀，进行两处垂直切口（即， 距正中线约 0.5 cm 处切断结肠两侧的骨盆骨。
- 使用精细剪刀将直肠与邻近的盆腔组织分离，并修剪结肠周围的肌肉。
- 将全长结肠（从盲肠到直肠）放入盛有生理盐水（先前用碳氧混合气预氧合）的烧杯中，并在室温下持续通氧。使用精细解剖剪切除盲肠和直肠，随后放回烧杯中。
- 使用连接有200 µl移液器吸头（内含生理盐水）的5 ml注射器，在结肠标本的口端施加轻柔的正压，以清除粪便颗粒或肠内容物。为便于后续组织定位，可用昆虫针在结肠最近端（黏膜条纹可见处）做标记。
- 使用剃刀切掉塑料移液枪头最宽端（近端）约1厘米，以使其适配5 ml注射器。为提高流速，使用剃刀以约45 °C的角度切割远端（较小端）以扩大孔径。
- 用解剖镊轻轻夹住结肠组织的近端，将移液器吸头插入结肠腔内，通过腔内冲洗生理盐水。
2. 结肠组织的制备及用于视频成像的实验设置
- 使用连接至200 µl移液器吸头的注射器，将生理盐水冲洗通过连接于双室器官浴装置的所有管道（图1和图3），以清除管道内可能阻碍溶液流动的任何碎屑。有关管道规格，请参见材料表。
- 确保器官浴的两个腔室持续灌流经碳合气（95% O2 和 5% CO2，流速为5 ml min-1）饱和的生理盐水。定期使用温度探针检测，确保浴液温度维持在33 °C–37 °C之间。
- 使用50 ml注射器，将约20–30 ml生理盐水注入通过三通旋塞连接至进液管的进液储液瓶中。
- 实验过程中，使用带有中心穿过的玻璃管（内径5 mm）的橡胶塞来维持进液储液瓶内的压力。确保进液储液瓶的上端开口被严密封闭（玻璃管内部保持开放）。
- 将结肠（长度5–7 cm）放入器官浴腔室中，确保其完全浸没于生理盐水中。
- 使用标准棉线缝合线，将结肠段的两端分别套接至浴槽中两个浸没的进/出液管（可根据组织管腔大小更换不同直径的进/出液管，例如新生组织、成年小鼠或豚鼠组织）。将结肠近端连接至进液管，远端连接至出液管（通过三通旋塞连接至一根垂直出液管，高度为6 cm）。套管后应确保组织既不过度拉伸也不过于松弛，以避免干扰后续测量与分析。
- 使用15 cm直尺测量近端与远端套管之间的距离，记录结肠长度。该数据对解释收缩长度变化、推进速度及收缩起始点具有重要意义。
- 实验开始前，确保建立稳定的基线管腔压力（cm H2O）。通过测量组织至进液储液瓶玻璃管内生理盐水弯月面（口腔端）以及垂直出液管（肛门端）之间的垂直距离，计算管腔压力。
- 通过保持进液端塞子密封压力恒定，并确保装置中无堵塞，使组织标本维持在恒定的腔内压力（例如，1–2 cm H2O）。
- 在记录肠道运动前，让结肠在生理盐水中平衡30分钟。检查进液或出液管是否出现堵塞，并通过向进液储液瓶加压或重新套接管腔的口端和肛端来清除堵塞。
3. 图像采集与实验方案
- 使用位于器官浴上方 10–15 cm 处的标准实验室铁架台上的摄像机（30 帧/秒，640 × 840 像素）将肠道运动记录为视频文件（图 1）。
- 从桌面图标打开 Virtual Dub（视频采集软件）。在“文件”选项卡中，选择“捕获 AVI”以查看摄像机图像。在“音频”选项卡中取消选中“启用音频捕获”，以关闭声音。
- 在视频选项卡中，选择“压缩”和“DivX6.9.2. Codec”，以压缩视频文件，减少存储空间占用。安装压缩软件“DivX”后，此功能将可用。
- 通过视频采集软件窗口手动调整摄像机位置，确保整个插管结肠段均可见（插管区域紧邻视频帧的垂直边缘）（见 图 1）。为提高图像质量并减少反光，可在摄像机支架上附加纸板或纸制遮光罩，以阻挡外部光线照射到器官浴。通过摄像机软件界面调节亮度、对比度和曝光设置，以优化视频质量。
- 开始录制前，在“文件”选项卡中设置特定文件名：选择“设置捕获文件”，并为视频指定唯一名称。
- 点击“捕获”工具栏中的“捕获文件”按钮开始录制视频。如需停止录制，请点击“停止捕获”按钮或按键盘上的“Esc”键。
- 每 30 分钟更换一次流入储液器中的生理盐水，使用新鲜的生理盐水替换原有液体。
- 记录管腔压力（见 2.9），并使用温度探头记录器官浴的温度。在整个实验过程中重复此步骤（即 每 30 分钟一次），以确保这些变量保持恒定。
- 总共记录 3 小时的结肠活动（包括药物应用和洗脱时间）。为便于数据存储，以 15 分钟为一段进行视频记录。一个完整的实验通常包含 12 段 15 分钟的视频记录。
- 在对照条件下（生理盐水）记录 1 小时的活动。
- 将药物施加 30 分钟至 1 小时（可通过浴槽灌流或经由流入储液器注入管腔）。
注意：不同的给药途径可能产生不同的效应23。 - 在 1 小时的洗脱期间，向浴槽或管腔中施加新鲜的生理盐水。
4. 数据处理与时空图谱的生成
- 使用自行开发的 MATLAB 软件（R2012a，版本 7.4；可应要求提供）对每个视频记录进行离线处理，以生成显示结肠运动功能的时空图。
- 从桌面图标打开分析软件。
- 在命令窗口中输入 "分析2" 以打开分析控制面板。
- 利用边缘检测功能，通过点击生成时空图 ".avi 文件的边缘检测" 在控制面板窗口中。此功能将使分析软件能够读取以音频视频交错格式（AVI）录制的视频。
- 依次执行以下步骤，使用自适应边缘检测算法生成时空图。
- 通过选择打开录制的视频文件 "添加文件" 标签页，选择“打开视频”并选择视频文件的位置。
- 从分析软件列出的视频文件中，选择目标文件。
- 在视频帧内选择一个矩形感兴趣区域， 例如， 结肠的全长，从口腔插管处至肛门插管处。确保近端和远端插管位置紧邻感兴趣区域的垂直边界。边缘检测线（红色和绿色）将自动叠加显示在实时图像上。
- 确保边缘检测阈值线紧邻结肠组织图像的上下边界处的结肠边缘（可通过控制面板调整检测阈值参数，针对每段视频进行优化）。通过控制面板调节对比度和亮度，确保边缘检测线在结肠图像的整个长度方向上连续完整。
- 将结肠的全长（mm）输入到宽度对话框中（如步骤 2.7 中记录的）。然后选择 "生成热图".
- 在弹出窗口中，选择文件的保存位置，并为时空图指定文件名。
- 选择“.su2”格式，然后选择“添加到队列”。
注意：.su2 格式可将数据压缩为更小的文件大小，并且可将多个视频文件添加到队列中。 - 选择“开始检测”以生成时空图。
5. 时空图分析
- 利用时空图估算CMMCs的频率、传播速度、长度和持续时间、肠道直径以及收缩起始点和传播方向等参数。
- 要开始分析时空图，在命令窗口中输入“analyse2”，具体操作如前一节所述。而不是 "边缘检测"，选择 "热图分析" 按钮
- 通过选择“添加文件”选项卡并指定先前获取的 .su2 文件的位置，打开时空地图文件（.su2 文件）。
- 当时空图在屏幕上可见后，在控制面板上指定一个颜色范围，确保最小值设置为1。
请注意，最大值可根据组织的收缩力在5到10之间变化。 - 选择“锁定颜色范围”，以确保同一实验中的所有图像在相同条件下进行分析。
- 确保同一实验中所有时空图的时间范围设置保持一致。
- 为确定CMMC频率，需手动计数那些行进距离超过结肠长度50%的收缩波。这些收缩波在时空图上可表现为红色/橙色条纹（标准HSV颜色索引）（参见 图2 例如）。其他较短或无法传播的收缩事件也可被识别和量化。
- 如有需要，可基于这些图谱进行更高分辨率的进一步分析。例如，可详细分析每次收缩的速度和持续时间等特性。
- 为了测量速度和持续时间，选择 "标注收缩波" 热图分析控制面板上的按钮
- 接下来，通过单击每个CMMC来放大查看 "缩放" 按钮并选择感兴趣的区域。然后选择 "手动标注" 使用鼠标从每次收缩的起始位置画线至其末端，以标注每一次收缩。该方法可用于测量表观上传播性扩张的传播速度和持续时间 例如， 见图谱的肛端 图2A, 2B).
注意：速度和持续时间的数据将显示在结果窗口下方。通过选择可将这些数值转移至感兴趣的电子表格中 "导出数据" 点击可删除不需要的注释 "移除选定的注释" 按钮。
- 如有需要，可利用时空图的 x 和 y 坐标（分别表示时间与沿结肠的位置）来确定小收缩或CMMCs起始的位置。
- 同样，为了确定收缩之间的时间间隔，使用 "注释" 用于测量收缩之间的持续时间。与之前相同，可通过选择将这些结果导出至电子表格 "导出数据" 表。
- 为了测量静息状态下的肠道宽度，选择 "取横截面" 热图分析面板上的按钮
- 在时间横截面面板中选择“添加”。在地图内的任意位置双击，生成一条叠加在热图上的水平线。此时，肠道直径数据将在新窗口中显示。
- 为测量肠道直径，将光标置于波峰及其相邻的波谷处，以获得特定实验条件下的平均肠道宽度。可在不同实验条件之间比较肠道直径的变化。
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结果
高达90%的自闭症谱系障碍（ASD）患者会出现各种胃肠道紊乱，包括腹泻和便秘18,24,25。然而，这些胃肠道问题的根本原因尚不清楚。在ASD患者中发现的许多突变均与突触蛋白相关，这些蛋白的异常可导致突触传递或功能的改变与紊乱。其中一个突变位于编码细胞黏附分子神经连接蛋白-3（NL3 R451C）的基因，在两名患有ASD的兄弟中被发现17。该突变导致神经连接蛋白第451位的精氨酸残基被半胱氨酸取代。携带此突变的NL3R451C小鼠在体感皮层中表现出GABA介导的神经传递增强16,26，同时海马区的AMPA受体和NMDA受体介导的活性也有所增加25,27。
神经连接蛋白存在于肠神经元中28-30。由于肠神经系统在调控胃肠道功能中起重要作用，我们推测R451C突变会影响肠道蠕动。因此，为了研究突触异常可能导致的胃肠道功能改变，...
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讨论
利用该视频成像技术，测量野生型和NL3小鼠的结肠移行性肌电复合波（CMMC）频率，以评估结肠运动功能R451C 小鼠，自闭症谱系障碍的小鼠模型17我们的结果表明，突变型NL3中CMMCs的数量减少R451C 与野生型小鼠相比，在存在5HT的情况下，小鼠3/4 受体拮抗剂托匹司琼表明NL3R451C 小鼠对托匹司琼的敏感性增加。因此，我们提出，neuroligin-3 R451C突变可改变5-羟色胺通路，可能是通过调控5HT3 或5HT4 肠神经元、黏膜或两者中的受体功能。这凸显了该方法在识别不同基因型之间表型差异以及确定后续研究特定靶点方面的价值。
通过使用配备相机支架的体视显微镜采集视频，可对该方法进行改进以提高空间分辨率。该方法能够对胚胎发育早期（最早至E12.5）的胃肠道小样本进行记录31。神经调节物质可通过肠腔或结肠样本外部的器官浴施加。此外，该方法适用于多种物种（包括小鼠、大鼠和豚鼠）的大小肠运动功...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露
致谢
JCB 和 ELH-Y 获得了美国国防部 CDMRP 自闭症研究计划（AR11034）的支持。ELH-Y 还获得了澳大利亚国家健康与医学研究委员会（NHMRC，项目号 1047674）的资助。MS 获得了墨尔本大学 May Stewart 奖学金信托的资助。我们感谢 Ali Taher、Fátima Ramalhosa 和 Gracia Seger 在技术方面所做的贡献。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 试剂 | |||
| NaCl (MW: 58.44) | Sigma-Aldrich | S7653-250G | |
| KCl (MW: 74.55) | Sigma-Aldrich | P9333-500G | |
| NaH2PO4.2H2O (MW: 156.01) | Chem Supply | 471-500G | |
| MgSO4.7H20 (MW: 246.48) | Chem Supply | MA048 | |
| CaCl2.2H2O (MW: 147.02) | Chem Supply | CA033 | |
| D-葡萄糖无水物 (MW: 180.16) | Chem Supply | GA018-500G | |
| NaHCO3 (MW: 84.01) | Chem Supply | GA018-500G | |
| 名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| 材料 | |||
| 双室器官浴槽 尺寸：14 cm x 8 cm x 3 cm | 定制 | 直接联系实验室 | |
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| 1.02 mm (内径) x 2.16 mm (外径) - 硅橡胶管 | Masterflex | 508-005 | |
| 1.50 mm (内径) x 2.50 mm (外径) - 硅橡胶管 | Masterflex | 508-007 | |
| 1.60 mm (内径) - 铂固化硅胶管 | Masterflex | 96410 - 14 | |
| 4.40 mm (内径) - 铂固化硅胶管 | Masterflex | 96410 - 15 | |
| 3.10 mm (内径) - 铂固化硅胶管 | Masterflex | 96410 -16 | |
| 带刻度实验室玻璃瓶 - 500 ml | 赛默飞世尔科技 | 100-400 | |
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| 名称 | 公司 | 目录编号 | 备注 |
| 软件 | |||
| Virtual Dub - 1.9.11 | virtualdub.org | ||
| MATLAB R2012a | Graph Pad | ||
| 罗技网络摄像头软件 | Logitech |
参考文献
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