利用视频成像与时空图分析小鼠胃肠道运动功能

摘要

本文介绍了一种视频成像技术及高分辨率时空图谱方法，用于识别成年小鼠结肠运动神经调控的变化。利用该方法在离体组织样本中可检测胃肠道（GI）功能的细微影响，从而增进对胃肠道疾病的理解。

摘要

肠神经系统（ENS）在调节胃肠道（GI）运动功能中起着重要作用，且可独立于中枢神经系统运作。ENS功能的改变是胃肠道症状和疾病的主要原因，也可能导致包括自闭症在内的神经精神疾病中所报告的胃肠道症状。已有充分证据表明，离体结肠节段能够产生称为结肠移行性运动复合波（Colonic Migrating Motor Complexes, CMMCs）的自发性节律性收缩。一种用于分析肠神经对CMMCs调控作用的实验方法 离体 描述了小鼠结肠的制备方法。将结肠从动物体内解剖取出，冲洗以清除粪便内容物，随后在器官浴中进行插管。通过位于器官浴上方的视频摄像机采集数据，并利用自主研发的软件包将其转换为高分辨率时空图。利用该技术，可在3–4小时内比较结肠节段的基础收缩模式以及药物对肠神经系统（ENS）功能的影响。此外，还可记录周期性移行性肌电复合波（CMMCs）的传播长度和速度，以及肠道直径和收缩频率的变化。该技术适用于在转基因小鼠模型（以及其他物种，包括大鼠和豚鼠）中表征胃肠道运动模式。通过该方法，可在野生型小鼠及Neuroligin-3小鼠中记录药物诱导的CMMCs变化^R451C 自闭症小鼠模型。此外，该技术还可应用于小鼠胃肠道的其他区域，包括十二指肠、空肠和回肠，并可用于不同发育阶段的小鼠。

引言

肠神经系统（ENS）是胃肠道内在的神经网络，可调节多种功能，如肠道内容物的消化、营养物质的吸收以及液体的分泌和重吸收。ENS的神经元位于肌间神经丛和黏膜下神经丛中。肌间神经丛在调节胃肠道运动功能中起主要作用¹，而黏膜下神经丛则主要参与分泌活动的调控^2,3。肌间神经丛位于胃肠道壁的纵行肌层与环形肌层之间。肠壁平滑肌层的收缩活动通过混合和推进肠内容物沿肠道移动，从而促进胃肠道的主要功能³。尽管中枢神经系统（CNS）对胃肠道的外来神经支配在体内（in vivo）对胃肠道功能有所贡献，但ENS能够独立调控胃肠道功能。这一独特特性使得在离体（ex vivo）条件下对肠神经回路的功能及其对胃肠道运动的贡献进行研究成为可能。

结肠移行性运动复合波（CMMCs）是一种自发的神经源性事件，在无粪便颗粒存在的情况下，是离体小鼠结肠中最主要的运动模式^4-9。CMMCs被定义为沿水平方向传播的节律性收缩，其传播距离至少达到结肠总长度的一半（即 从盲肠至直肠）¹⁰。目前，CMMCs与推动粪便颗粒的收缩模式之间的关系尚不明确，但已有研究报道了二者在药理学上的某些差异¹¹。尽管如此，肠神经系统（ENS）在不依赖中枢神经系统（CNS）的情况下仍具备功能，且离体结肠中存在神经介导的运动模式，这为研究由潜在ENS功能障....

方案

所有实验前的动物操作及颈椎脱位均严格遵循墨尔本大学动物实验委员会批准的方案进行（伦理编号：1212494.7）

1. 组织采集与解剖

1. 通过颈椎脱位处死成年小鼠。若可能，应避免使用麻醉，以防通过目标神经元群体上的受体影响肠道功能。
2. 记录动物的总体重，使用皮下注射针头（规格：20 G）通过四肢将动物腹部朝上固定于解剖板上。
3. 使用解剖镊和剪刀，在覆盖下腹部肌肉层的表皮上做一切口。继续使用镊子和剪刀沿腹部中线切开腹腔，直至胸骨。
4. 为防止组织脱水，加入生理盐水（克雷布斯溶液：118 NaCl，4.6 KCl，2.5 CaCl₂）₂，1.2 MgSO₄₄, 1 NaH₂PO₄，25 NaHCO₃₃，11 毫摩尔 D-葡萄糖——在室温下用碳氧混合气体（95% O₂）饱和₂ 和5% CO₂ 至少 20 分钟）定期作用于腹腔内容物（即， 在解剖过程中，每隔30-60秒进行一次。
5. 在分离与盲肠和直肠相连的结肠时，用解剖镊轻轻夹住盲肠（位于结肠近端附近），位置约在动物体上方4-5 cm处，同时使用精细解剖剪修剪肠系膜。
6. 去除相邻的肠系膜时，注意不要触碰、拉伸或切割胃肠道组织。
7. 去除多余组....

结果

高达90%的自闭症谱系障碍（ASD）患者会出现各种胃肠道紊乱，包括腹泻和便秘^18,24,25。然而，这些胃肠道问题的根本原因尚不清楚。在ASD患者中发现的许多突变均与突触蛋白相关，这些蛋白的异常可导致突触传递或功能的改变与紊乱。其中一个突变位于编码细胞黏附分子神经连接蛋白-3（NL3 R451C）的基因，在两名患有ASD的兄弟中被发现¹⁷。该突变导致神经连接蛋白第451位的精氨酸残基被半胱氨酸取代。携带此突变的NL3^R451C小鼠在体感皮层中表现出GABA介导的神经传递增强^16,26，同时海马区的AMPA受体和NMDA受体介导的活性也有所增加^25,27。

神经连接蛋白存在于肠神经元中^28-30。由于肠神经系统在调控胃肠道功能中起重要作用，我们推测R451C突变会影响肠道蠕动。因此，为了研究突触异常可能导致的胃肠道功能改变，.......

讨论

利用该视频成像技术，测量野生型和NL3小鼠的结肠移行性肌电复合波（CMMC）频率，以评估结肠运动功能^R451C 小鼠，自闭症谱系障碍的小鼠模型¹⁷我们的结果表明，突变型NL3中CMMCs的数量减少^R451C 与野生型小鼠相比，在存在5HT的情况下，小鼠_3/4 受体拮抗剂托匹司琼表明NL3^R451C 小鼠对托匹司琼的敏感性增加。因此，我们提出，neuroligin-3 R451C突变可改变5-羟色胺通路，可能是通过调控5HT₃ 或5HT₄ 肠神经元、黏膜或两者中的受体功能。这凸显了该方法在识别不同基因型之间表型差异以及确定后续研究特定靶点方面的价值。

通过使用配备相机支架的体视显微镜采集视频，可对该方法进行改进以提高空间分辨率。该方法能够对胚胎发育早期（最早至E12.5）的胃肠道小样本进行记录³¹。神经调节物质可通过肠腔或结肠样本外部的器官浴施加。此外，该方法适用于多种物种（包括小鼠、大鼠和豚鼠）的大小肠运动功.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
试剂
NaCl (MW: 58.44)	Sigma-Aldrich	S7653-250G
KCl (MW: 74.55)	Sigma-Aldrich	P9333-500G
NaH2PO4.2H2O (MW: 156.01)	Chem Supply	471-500G
MgSO4.7H20 (MW: 246.48)	Chem Supply	MA048
CaCl2.2H2O (MW: 147.02)	Chem Supply	CA033
D-葡萄糖无水物 (MW: 180.16)	Chem Supply	GA018-500G
NaHCO3 (MW: 84.01)	Chem Supply	GA018-500G
名称	公司	目录编号	备注
材料
双室器官浴槽 尺寸：14 cm x 8 cm x 3 cm	定制		直接联系实验室
732 多用途透明密封胶	Dow Corning Australia Pty Ltd	1890573
SYLGARD 184 硅橡胶弹性体套件	Dow Corning Australia Pty Ltd	1064291
三通旋塞阀，雌-雄，带锁，S型	Terumo Medical Corporation	0912-2006
带鲁尔锁头的注射器，50 ml、20 ml、10 ml	Terumo Medical Corporation	N/A
1.57 mm (内径) x 3.16 mm (外径) - 硅橡胶管	Masterflex	508-008
1.02 mm (内径) x 2.16 mm (外径) - 硅橡胶管	Masterflex	508-005
1.50 mm (内径) x 2.50 mm (外径) - 硅橡胶管	Masterflex	508-007
1.60 mm (内径) - 铂固化硅胶管	Masterflex	96410 - 14
4.40 mm (内径) - 铂固化硅胶管	Masterflex	96410 - 15
3.10 mm (内径) - 铂固化硅胶管	Masterflex	96410 -16
带刻度实验室玻璃瓶 - 500 ml	赛默飞世尔科技	100-400
化学橡胶塞 57 x 65 mm
化学橡胶塞 29 mm x 32 mm
水浴加热器 （温度调节器）	Ratek	TH7000
罗技网络摄像头	Logitech
名称	公司	目录编号	备注
软件
Virtual Dub - 1.9.11	virtualdub.org
MATLAB R2012a	Graph Pad
罗技网络摄像头软件	Logitech