诱导青光眼的实验操作步骤 体内 大鼠模型与视网膜整体装片制备

摘要

青光眼的特征是视网膜神经节细胞受损。在动物模型中诱导青光眼可为研究该疾病提供重要线索。本文概述了一种在动物模型中诱导视网膜神经节细胞（RGCs）丢失的实验方法 体内 大鼠模型及用于分析的全层视网膜制备方法

摘要

青光眼是一种影响视网膜神经节细胞（RGCs）的中枢神经系统疾病。构成视神经的RGC轴突负责将视觉信号传递至大脑以实现视觉感知。RGC及其轴突的损伤可导致视力丧失和/或失明。尽管青光眼的具体病因尚不明确，但其主要危险因素是眼内压升高。在动物模型中诱导青光眼的实验方法，为研究RGC死亡机制的科研人员提供了重要工具。此类研究信息有助于开发有效的神经保护疗法，从而预防视力丧失。本文所述方案介绍了一种在动物模型中诱导类似青光眼状况的方法 体内 大鼠模型中，向巩膜上静脉丛注射 50 µl 2 M 高渗盐水。血管变白表明注射成功。该操作可导致视网膜神经节细胞（RGC）丢失，以模拟青光眼。注射后一个月处死动物并摘除眼球。随后去除角膜、晶状体和玻璃体，制备眼杯。接着用仙人掌针将视网膜从眼球后部剥离并固定在硅胶培养皿上。此时可对视网膜中的神经元进行染色分析。本实验室结果显示，与内部对照相比，术后一个月内约有 25% 的 RGC 丢失。该方法可实现对青光眼样条件下视网膜神经节细胞死亡的定量分析 体内 大鼠青光眼模型

引言

青光眼是一组影响视网膜神经元的疾病，特别是视网膜神经节细胞^1-2。这些细胞的轴突汇聚形成视神经，将视觉信息传递至大脑，从而产生视觉感知。因此，视网膜神经节细胞及其轴突的损伤会导致视觉功能缺陷。

与青光眼疾病相关的主要特征包括视网膜神经节细胞（RGC）的退化与死亡、眼内压（IOP）升高以及视盘凹陷和萎缩。这些特征可导致视野缺损或完全且不可逆的失明。目前，青光眼已在全球范围内导致3亿人失明³。因此，它是全球第三大失明原因⁴。

青光眼中视网膜神经节细胞（RGC）死亡的确切机制尚不明确。目前已有大量研究致力于揭示这一谜题。然而已知的是，青光眼的主要危险因素是由于眼前房中房水（AH）循环异常导致的眼内压升高。房水在无血管的眼前房中起到透明无色的血液替代作用，可为周围细胞提供营养，清除代谢过程中产生的废物，运输神经递质，并在病理状态下允许药物和炎性细胞在眼内循环¹。

房水循环的维持涉及睫状体和小梁网。房水由睫状体产生，随后流入前房，以维持眼内组织的整体健康。当液体流经睫状肌内的三层海绵状组织时，75%至80%的房水通过非色素性睫状上皮主动分泌排出。液体经小梁网和施莱姆管排出，后者将房水导入血液循环⁵。其余20%至25%的房水绕过小梁网，通过葡萄膜-巩膜途径以超滤和扩散方式被动排出。该途径似乎相对独立于眼内压¹。

当房水的生成与流出失去平衡时，眼内压力会升高。如前所述，眼内压升高是青光眼发生的主要危险因素。这种压力会损伤眼球后部视网膜中复杂的神经元层次结构。视神经中视网膜神经节细胞轴突的损伤会导致大脑无法再接收到准确的视觉信息。因此，视觉感知逐渐丧失，最终可能导致完全失明。

迄今为止，青光眼尚无治愈方法。现有的不同治疗手段主要旨在降低眼内压。这些方法包括局部用药，如β1-肾上腺素能受体阻滞剂或局部前列腺素类似物。β受体阻滞剂通过减少房水的生成来降低眼内压⁷。前列腺素通过增加房水外流来降低眼压^8-14。α-肾上腺素能激动剂和碳酸酐酶抑制剂也作为辅助治疗手段使用。α-肾上腺素能激动剂通过葡萄膜巩膜途径增加房水外流^15-17。碳酸酐酶抑制剂通过酶抑制作用减少房水生成¹⁸。此外，也有更为侵入性的治疗方法用于青光眼的治疗。激光小梁成形术可用于增加房水外流¹⁹。另一种手术疗法称为小梁切除术，在传统的小梁通路受阻时，创建替代的引流部位以滤过房水^20-21。

这些治疗方案已知可有效降低眼内压（IOP）。然而，高达40%的青光眼患者眼内压水平正常，表明需要更全面的治疗方法^22,23。此外，青光眼中观察到的视网膜神经节细胞死亡一旦开始即不可逆，而目前的治疗方法无法阻止疾病进展^24-28。这凸显了开发有效神经保护疗法的迫切需求，此类疗法应直接针对神经元自身的存活。青光眼模型的建立对于实现这一目标至关重要。

本研究展示了一种利用Morrison最初提出的改良方法在成年Long Evans大鼠中诱导类似青光眼效应的技术²⁹。该方法通过向巩膜上静脉丛注射2 M高渗盐水，造成组织瘢痕化，从而减少小梁网中房水的流出，导致眼内压升高，并在手术后一个月内引起视网膜神经节细胞（RGCs）的显著丢失^30-31。此类诱导青光眼的实验操作可能是推动青光眼治疗新进展的关键。

方案

所有使用动物受试者的操作均符合美国西密歇根大学动物护理与使用委员会（IACUC）的标准。

1. 动物

1. 本研究使用三个月龄的雄性和雌性大鼠。
2. 将动物饲养在12小时光照/12小时黑暗的循环环境中，自由获取食物和饮水。

2. 动物麻醉用KAX混合液的制备

1. 将50 mg的赛拉嗪（20 mg/ml）溶于5 ml的氯胺酮（100 mg/ml）中，加入1 ml的乙酰丙嗪（10 mg/ml）和3 ml蒸馏水，充分混匀。
2. 使用注射器滤器灭菌，并将此溶液储存于10 ml血清瓶中。

3. KAX 注射

1. 称量动物体重（g），然后放回笼中，待准备注射时取出。
2. 注射 0.1 ml KAX/100 g 动物体重，使用带 28 G 针头的 1 ml 胰岛素注射器腹腔注射 针
3. 待动物完全失去意识后，通过捏压其足部和尾部检查反射反应。
4. 手术期间将所有动物安全地安置在实验室中。
5. 术后，将动物放回笼中，并在室温下保持其舒适状态 直至意识恢复。只有当动物苏醒并恢复至正常行为后，方可将其送回动物房。

4. 手术准备与微针组装

1. 制备无菌的 2 M NaCl 溶液。
2. 使用微电极拉制仪（图 1C）将一根内径为 0.86 mm 的重抛光标准薄壁硼硅酸盐玻璃管拉制成两根精细锥形的玻璃微针（图 1D、图 1E）。
3. 使用后填充注射针和 1 ml 注射器（图 1B）将上一步中的一根微针用 2 M 盐水从尾端填充。轻敲电极尖端以排出气泡。
4. 用 2 M NaCl 溶液填充第二个 1 ml 注射器。连接一根 18 G 针头，然后接上一段聚乙烯管（长约 10 英寸）（图 1A）。使用注射器活塞通过针头将盐水充满聚乙烯管。
5. 当微针和管道均充满盐水后，小心地将两者连接。排除连接处之间的任何空气（图 2）。
6. 通过将微针尖端轻轻刮擦粗糙的纸巾表面，对其进行精细斜面处理。
7. 通过轻推注射器活塞，使液体在纸巾上形成细流，以此检测微针的阻抗。液流宽度不应超过 0.5 mm。

5. 动物准备

1. 在角膜上滴加 1 - 2 滴局部麻醉剂（盐酸丙帕卡因滴眼液，USP，0.5%），等待直至无眼部反射出现。
2. 用剪刀修剪胡须。
3. 用棉签蘸取聚维酮碘溶液，擦拭实验眼周围区域。
4. 在显微镜下，使用止血钳夹住下眼睑，使眼球突出，暴露巩膜静脉并限制眼球运动。（图 3，箭头所示）

6. 诱导青光眼的盐水注射

1. 当微针组件和动物准备就绪后，开始注射。
2. 当确认动物对足部/尾部夹捏无反应时，以与静脉呈10至20度的低角度小心刺入巩膜上静脉（图3，白色箭头）。当血液进入微针尖端时，表明已成功穿刺入静脉（图3，黑色箭头）。
3. 手动缓慢地向静脉内注射约50 µl生理盐水。此过程应持续约10秒。随着盐溶液在血管系统中循环，静脉将变为苍白色（图4，箭头）。部分区域可能仍保持鲜红色（图4，箭头）。
   1. 在与第一次注射位置相对的一侧再次向静脉注射一次，以确保视网膜整体受损，累及全部视网膜神经节细胞层。
      注意：数分钟内，随着盐溶液在血管系统中循环，应可通过瞳孔观察到明显浑浊的外观。
4. 对侧眼不做处理，作为内部对照使用。

7. 动物恢复

1. 移除止血钳。
2. 使用棉签将三重抗生素软膏（杆菌肽锌、硫酸新霉素、硫酸多黏菌素B） 涂抹于止血钳夹住的部位及注射部位。使用止血钳不会导致眼部周围组织损伤。
3. >将麻醉后的动物置于配备循环温水毯的笼子中，以防止低体温。 持续观察动物，直至其恢复意识和正常行为。将已清醒的动物送回动物饲养群。动物将在饲养群中饲养至处死时间点。

8. 动物安乐死与视网膜摘除

1. 在诱导青光眼手术后一个月，通过 CO₂ 窒息法处死动物₂ 窒息及继发性胸腔穿刺。 
   1. 将动物放入舱内，并牢固盖上盖子。
   2. 打开 CO₂ 以及允许20%体积/分钟CO的气体调节阀₂ 移位 腔室中的氧气。
   3. 让动物存留 4 到 5 分钟以确保死亡。
   4. 关闭两个阀门。
   5. 将动物从舱中取出，使用无菌手术刀进行二次胸腔穿刺。
2. 安乐死后，使用解剖刀小心切开眼球周围眼眶内的结缔组织，注意不要切到眼球本身。
3. 使用弯头剪刀小心剪断视神经及任何残留组织，以完整摘出眼球。将摘出的眼球置于含有新鲜PBS的无菌60 mm × 15 mm一次性培养皿中。
4. 从眼球制备眼杯。操作时，在虹膜与巩膜交界处稍靠后的位置用手术刀做一小切口，随后用小型弹簧剪沿眼球周缘继续剪开，以移除角膜半球，保留与视神经相连的半球部分。
5. 从安乐死动物的眼杯中找到内部极薄的粉红色/米色视网膜。用钝头镊子夹住视网膜的色素层以固定眼杯。用另一对闭合的镊子轻轻剥离整个完整的视网膜，使其脱离眼球后壁。避免直接夹捏、牵拉或拽动视网膜。
6. 使用小型弹簧剪刀剪下视神经仍与视网膜相连的区域。
7. 务必从视网膜上切除任何残留的色素上皮或巩膜组织。
8. 使用移液管将分离的视网膜极其轻柔地转移至洁净的、涂有硅胶的35 mm × 10 mm培养皿中，培养皿内含新鲜的PBS。

9. 视网膜全层铺片制备

1. 将视网膜置于Sylgard培养皿中后，使用镊子和一根仙人掌针将其固定。保持视网膜神经节细胞层朝上，视神经朝下。即使经过固定，视网膜的半球形结构仍清晰可见；当视网膜神经节细胞层处于理想方向时，其曲率会向上（朝向天花板）卷曲。
2. 使用小型剪刀从视神经乳头处开始，将视网膜切成四个象限，形成类似四叶草的放射状结构。
3. 用额外的仙人掌针将视网膜的四个象限固定，尽可能展平视网膜，但避免拉伸（图5）。
4. 在室温下，用3 ml的4%多聚甲醛固定Sylgard培养皿中已固定的视网膜，过夜 。

10. 视网膜抗体染色

注意：使用一抗和二抗对固定后的视网膜进行染色，以观察视网膜中的神经元（图6）。

1. 用 PBS 将固定后的平铺视网膜冲洗三次，每次 2 分钟。
2. 用含1% Triton X-100和1%胎牛血清的PBS溶液对视网膜进行通透处理，持续60分钟。
3. 用 PBS 冲洗视网膜三次，每次 2 分钟。
4. 用含0.1% Triton X-100的PBS冲洗两次，每次5分钟。
5. 用 PBS 洗涤两次，每次 5 分钟。
6. 在 PBS 中加入 1% Triton X-100 和 1% 胎牛血清，室温孵育 45 分钟。
7. 用含0.1% Triton X-100的PBS缓冲液冲洗两次，每次5分钟。
8. 用 PBS 洗涤两次，每次 5 分钟。
9. 将每片视网膜在含有3 ml 1%胎牛血清的PBS中，加入纯化的鼠抗大鼠CD90/小鼠CD90.1抗体（1:300稀释），于室温孵育过夜。
10. 用含 0.1% Triton X-100 的 PBS 冲洗视网膜一次，5 分钟。
11. 用 PBS 冲洗两次，每次 5 分钟。
12. 将每片视网膜在含有3 ml PBS（不含FBS）的溶液中孵育，加入Alexa Fluor 594标记的山羊抗小鼠IgG（1:300），4℃过夜。
13. 用 PBS 充分清洗视网膜。
14. 在解剖显微镜下，小心地从视网膜上移除仙人掌针。
15. 用移液管将视网膜轻柔转移至载玻片上。确保保持视网膜节细胞层朝向天花板的方向。即使在固定后，视网膜仍明显呈半球形；当视网膜节细胞层处于正确朝向时，视网膜的曲率会向上方（朝向天花板）卷曲。
16. 用 KimWipe 或其他吸水材料吸去多余的 PBS，注意不要吸到视网膜。
17. 加入5滴 ½ 甘油和 ½ 以 PBS 按重量配制作为封片介质。
18. 用盖玻片覆盖视网膜，避免产生气泡。
19. 使用透明指甲油、胶水或其他粘合剂固定盖玻片。

结果

本部分介绍了用于诱导青光眼样病变的装置组件及操作步骤 体内 大鼠青光眼模型。我们展示了用于进行高渗盐水注射的各类工具与设备，该注射可导致眼内压升高。我们展示了向巩膜上静脉丛注射时出现的特征性褪色现象以及随之产生的前房混浊外观。我们还描述了视网膜剥离与平铺制备的过程，以便分析丢失的视网膜神经节细胞（RGCs）。最后，我们展示了注射对视网膜神经节细胞存活的影响。由于RGCs在大鼠视网膜不同区域的分布不均，图像从四个 200 µm² 视网膜上每个区域位于视神经乳头中心外4 mm处。对实验组和对照组视网膜切片中Thy 1.1标记的视网膜神经节细胞（RGCs）总数进行计数、取平均值并比较 ³¹采用该方法，视网膜神经节细胞计数从对照未处理条件下每张图像平均225个，下降至诱导青光眼样条件后一个月的168个（N = 30）。综上所述，本文所述步骤可按顺序操作，用于分析视网膜神经节细胞胞体及其轴突的死亡情况。

讨论

本方案描述了一种在动物模型中诱导青光眼样病变的方法 体内 大鼠模型。该操作通过注射高渗盐水在小梁网中诱导瘢痕形成 ^{29, 32}瘢痕组织的形成会阻塞房水流出，导致前房压力升高。随着房水流出减少和压力积聚，由弹性韧带悬挂的晶状体向后移位进入玻璃体腔。玻璃体腔内的压力继而作用于视网膜，损伤脆弱的视网膜神经元。本实验结果显示，术后2周视网膜神经节细胞数量开始减少，术后1个月出现显著的神经节细胞丢失。

本方案仅是诱导啮齿类动物青光眼的一种方法。目前已有多种实验模型可通过眼内压升高或视神经直接损伤来实现视网膜神经节细胞的损害³⁰。这些方法通常最初在较大的动物中建立，随后经过改良应用于小鼠和大鼠³³。通过眼内注射毒素（如星形孢菌素³⁴和NMDA，即不可水解的谷氨酸类似物³⁵）可诱导视网膜神经节细胞快速死亡。然而研究表明，此类毒素在小鼠中具有剂量-效应关系，且会对非靶向的其他细胞产生影响³⁵。此外，该模型中视网膜神经节细胞的损伤远比人类青光眼的渐进性...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
盐酸赛拉嗪，纯度至少99%	Sigma, Life Science	X1251-1G
盐酸氯胺酮注射液，USP，100 mg/ml	Putney, Inc	NDC 26637-411-01	10 ml 瓶
马来酸乙酰丙嗪，10 mg/ml	Phoenix Pharmaceutical, Inc	NDC 57319-447-04, 670008L-03-0408	50 ml 瓶
血清瓶，10 ml	VWR	16171319	硼硅酸盐玻璃
1 ml 胰岛素注射器	VWR	BD329410	28 G 针头
氯化钠	Sigma	S7653	2 M 溶液
微电极拉制仪	Narishige Group	PP-830
重型抛光标准薄壁硼硅酸盐毛细管	Sutter Instruments	B150-86-10HP	无灯丝，0.86 mm
用于填充微移液管的Microfil注射器针头	World Precision Instruments, Inc	MF28G
18号鲁尔锁针头	Fisher Scientific	1130421	注射器针头
柔性聚乙烯管	Fisher Scientific	22046941	直径0.034英寸，约10英寸
盐酸丙帕他卡因滴眼液，USP，0.5%	Akorn, Inc	NDC 17478-263-12	15 ml 无菌瓶
弯头剪刀	Fine Science Tools	14061-11
显微镜	Leica	StereoZoom 4
止血钳	Fine Science Tools	1310912	弯边
三重抗生素软膏	Fisher Scientific	NC0664481
手术刀柄	Fine Science Tools	10004-13
手术刀片 #11	Fine Science Tools	10011-00
60 mm × 15 mm 一次性培养皿	VWR	351007
磷酸盐缓冲液 10x 浓缩液	Sigma, Life Science	P7059-1L	1x 稀释
弹簧剪刀	Fine Science Tools	15009-08
镊子（2把），Dumont #5	Fine Science Tools	11251-30
3 ml 转移移液管，聚乙烯材质，非无菌	BD Biosciences	357524 或 52947-948	1 ml 和 2 ml 刻度
35 mm × 10 mm 易握培养皿	BD Biosciences	351008
Sylgard 184	VWR	102092-312
仙人掌针
多聚甲醛	EMD Millipore	PX0055-3 或 818715.0100	配制成4%溶液
吐温-100（Triton X-100）	Sigma	T9284-100 ml	分别配制成1%和0.1%溶液
胎牛血清	Atlanta Biological	S11150	500 ml
纯化小鼠抗大鼠CD90/小鼠CD90.1	BD Pharmingen	货号 554892	1:300 稀释
Alexa Fluor 594 山羊抗小鼠抗体	Life Technologies	A11005	1:300 稀释
显微镜载玻片	Corning	2948-75x25
甘油	Sigma	G5516-100 ml	按重量配制成50%甘油与50% PBS混合液
盖玻片	Corning	2975-225	厚度1，22 × 50 mm
共聚焦显微镜	Nikon	C2 Eclipse Ti