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方法文章

体内 碱性彗星试验及酶修饰碱性彗星试验用于检测大鼠肝脏中的DNA链断裂和氧化性DNA损伤

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DOI：

10.3791/53833

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2016年5月4日

 ,  ,  ,  , 
1Division of Genetic and Molecular Toxicology, US FDA/National Center for Toxicological Research, 2Toxicologic Pathology Associates, US FDA/National Center for Toxicological Research

本文内容

摘要

碱性彗星实验用于检测真核细胞中的DNA链断裂。通过添加内切核酸酶III或人8-氧代鸟嘌呤-DNA-糖基化酶消化步骤，该实验可有效检测氧化性DNA损伤。本文描述了利用这些实验方法检测大鼠肝脏中DNA损伤的技术流程。

摘要

未修复的DNA损伤可导致基因组不稳定，进而可能促进癌症的发生。因此，识别潜在的DNA损伤剂对于保护公众健康具有重要意义。 体内 碱性彗星试验，通过检测DNA链断裂来评估DNA损伤，对于评价外源性化学物质的遗传毒性危害尤为相关，因为其反应结果反映了 体内 吸收、组织分布、代谢和排泄（ADME）以及DNA修复过程。与其他方法相比 体内 DNA损伤检测，该检测方法快速、灵敏、直观且成本低廉；通过使用特异性修复酶将氧化性DNA损伤转化为链断裂，该方法能够高效且相对无假象地检测氧化性DNA损伤. 通过急性与亚慢性毒理学研究设计均可开展彗星试验以检测DNA损伤，将彗星试验与其他毒理学评估方法相结合，可最大限度地利用实验动物资源，从而满足动物福利要求。该试验的另一主要优势在于仅需少量细胞，且细胞来源无需局限于增殖细胞群体。此外，该试验还可应用于临床上或职业暴露个体所获取的多种人体样本。

引言

碱性彗星试验在单细胞水平上检测DNA链断裂。将单细胞悬液包埋于载玻片上的琼脂糖中，裂解细胞以形成含有超螺旋DNA环的核样结构。在pH条件下进行电泳>13 导致含有链断裂的 DNA 环中超级螺旋结构的丧失，游离的 DNA 链向阳极迁移，形成可通过荧光显微镜观察到的彗星样结构。断裂的 DNA 从 "头部" 彗星进入 "尾部" 根据片段大小，以及彗星尾部荧光强度相对于总强度（头部和尾部）的比例，可用于定量DNA断裂程度1,2该检测方法简单、灵敏、通用、快速，且相对经济。1由DNA损伤剂引起的DNA断裂检测被用作一种检测方法，用于量化经潜在遗传毒性物质处理的动物各组织中单个细胞或分离细胞核内的DNA损伤。由于其具有诸多优势，该方法 体内 彗星试验被推荐作为第二 体内 遗传毒性检测（与 体内 微核试验）用于在现行国际人用药品注册技术协调会（ICH）中进行产品安全性评价3 欧洲食品安全局（EFSA）4 监管指南。在我们的实验室中，我们已采用该检测方法用于评估 体内 由食品成分、药物和纳米材料引起的DNA损伤5-10本方案以大鼠肝脏为例，但只要能从组织中分离出完整的单细胞，彗星试验也可应用于实验动物的其他组织或器官。

某些类型的DNA损伤若不改进基本的碱性彗星实验，则难以作为DNA链断裂进行检测。对于氧化性DNA损伤，可通过使用修复酶（如人8-氧代鸟嘌呤-DNA-N-糖苷酶1（hOGG1））消化，在DNA的氧化损伤位点处产生链断裂，hOGG1可在8-氧代鸟嘌呤（8-oxoGua）和甲基-fapy-鸟嘌呤位点引入断裂11。此外，内切酶III（Endo III）主要在氧化的嘧啶位点产生断裂1。因此，增加酶消化步骤后，该实验成为一种特异且灵敏的体内氧化性DNA损伤检测方法in vivo12。利用这些实验方法，我们已证实外源毒性物质可诱导大鼠和小鼠肝脏中的氧化性DNA损伤6-8，以及大鼠心脏中的氧化性DNA损伤10。

碱性彗星试验在遗传毒理学和人类生物监测中具有多种应用：1）作为后续检测手段 体内 由敏感性检测鉴定的基因毒素检测方法 体外 测试3,13，2）评估外源性物质在多种组织中诱导DNA损伤的机制14，3）研究致癌物是否通过基因毒性或非基因毒性作用模式（MOA）发挥作用7，4）评估DNA损伤修复15，5）以研究人类疾病和职业暴露 16，以及作为器官特异性遗传毒性潜在的高通量筛选实验方法6）17.

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方案

伦理声明：涉及动物的实验程序已获得美国食品药品监督管理局/国家毒理学研究中心机构动物照护与使用委员会（IACUC）的批准。

注意：此处所述的研究设计基于日本替代方法验证中心（JaCVAM）为其验证工作所制定的方案 在体 啮齿类动物碱性彗星试验18，并根据经合组织指南TG489中的建议进行了进一步修改19.

1. 准备

  1. 载玻片制备
    1. 将普通熔点琼脂糖用磷酸盐缓冲液（不含 Ca2+、Mg2+ 和酚红）配制成 1%（w/v）溶液，在微波炉中加热溶解。
    2. 将熔化的 1% 标准琼脂糖溶液置于 55 °C 水浴中，使其温度与水浴平衡。将玻璃载玻片浸入琼脂糖溶液中，取出后沥去多余琼脂糖，并用纸巾擦净载玻片背面。将载玻片垂直放置于平坦表面上，在室温下干燥；干燥后储存于干燥处。
  2. 彗星试验溶液的制备
    1. 制备 0.5% 低熔点琼脂糖溶液。将低熔点琼脂糖用磷酸盐缓冲液（不含 Ca2+、Mg2+ 和酚红）在微波炉中加热溶解。在制备彗星载玻片期间，保持溶液温度在 37–45 °C；使用后废弃剩余琼脂糖溶液。
    2. 配制裂解缓冲液。将乙二胺四乙酸二钠盐（EDTA 二钠，Mr 372.24 g/mol）配制成 100 mM 溶液，加入氯化钠（NaCl，Mr 58.44 g/mol）至终浓度 2.5 M，三羟甲基氨基甲烷（Tris 碱，Mr 121.14 g/mol）至终浓度 10 mM，溶于纯水中，并用 10 N 氢氧化钠溶液（NaOH，Mr 40 g/mol）调节 pH 至 10。在使用当天，向溶液中加入 Triton X-100 和二甲基亚砜（DMSO，Mr 78.13 g/mol），使其终浓度分别为 1% 和 10%，并在 4–10 °C 下搅拌至少 30 分钟后使用。
    3. 在使用当天新鲜配制酶反应缓冲液。将 2-[4-(2-羟乙基)哌嗪-1-基]乙磺酸（HEPES，Mr 238.3 g/mol）配制成 40 mM 溶液，加入氯化钾（KCl，Mr 74.55 g/mol）至终浓度 100 mM，EDTA 二钠至终浓度 0.5 mM，牛血清白蛋白（BSA，Mr 66,463 g/mol）至终浓度 0.2%，溶于纯水中。用 10 N 氢氧化钾溶液（KOH，56.1 g/mol）调节 pH 至 8.0。在室温下搅拌，并在使用前确认所有成分完全溶解。
    4. 配制碱性缓冲液：将氢氧化钠（NaOH）配制成 300 mM 溶液，EDTA 二钠配制成 1 mM 溶液，溶于纯水中。在使用前于 4–10 °C 下搅拌至少 30 分钟。使用前测量溶液 pH，确保 pH >13。
    5. 将 Tris 碱配制成 0.4 M 溶液，溶于纯水中，用盐酸（HCl，Mr 36.46）调节 pH 至 7.5。将溶液储存于 4–10 °C。此为中和缓冲液。
    6. 在使用当天新鲜配制剪切缓冲液。将 EDTA 二钠配制成 20 mM 溶液，DMSO 至终浓度 10%，溶于汉克氏平衡盐溶液（HBSS，不含 Ca2+、Mg2+ 和酚红）中。使用前置于冰上保存。
    7. 配制染色液时，将核酸荧光染料原液用 Tris-硼酸-EDTA 缓冲液（TBE 缓冲液）按 1:10,000（v/v）稀释。用铝箔包裹避光保存。储存于 2–8 °C，并在 24 小时内使用。

2. 大鼠肝脏单细胞悬液的制备

  1. 按照《美国兽医协会动物安乐死指南：2013年版》20 推荐的方法，使用 CO2 气体对大鼠实施安乐死。
    1. 将 CO2 气体流速设定为 2.75。将大鼠放入安乐死舱（例如，干燥器罐、带通气盖的鼠笼），打开气瓶阀门通入 CO2。等待 1.5 至 2.5 分钟，直至大鼠失去意识。随后将 CO2 流速调至最大。在呼吸停止后，继续将大鼠留在舱内约 1 分钟，以确保安乐死完成。通过触诊确认大鼠无心跳，并通过夹捏脚趾观察其是否出现肢体回缩，以验证安乐死效果。
  2. 用 70% 乙醇对带毛皮肤进行消毒。切开腹腔，用手术剪完整取出肝脏。取出肝脏后，再用手术剪从剩余肝脏上分离出左侧叶。将左侧叶置于切板上，使用一次性单刃剃须刀片切割出两个相邻的、厚度为 3–4 mm 的横切面。
  3. 将其中一个横切面放置于滤纸上（防止切面卷曲），然后将其浸入 10% 中性缓冲福尔马林（NBF）中。确保 10% NBF 与组织的体积比达到 10:1 或更高。固定时间至少 72 小时后，进行组织病理学处理（见下文第 7 节）。
  4. 将第二个肝脏横切面放入盛有 5 ml 冰冷剪碎缓冲液（见第 1.2.6 节）的 6 cm 培养皿中，清洗 3 次以去除残留血液。
  5. 将肝脏切片转移至含有 1 ml 冰冷剪碎缓冲液的新 2 ml 离心管中。用精细剪刀充分剪碎已清洗过的肝脏组织以释放细胞。将细胞悬液通过 40 µm 细胞滤网过滤，去除组织团块。
  6. 将单细胞悬液置于冰上，并在 1 小时内用于制片。通过细胞计数（例如，使用血细胞计数板或电子细胞计数器）确认细胞浓度，确保其浓度约为 2 × 106 个细胞/ml。

3. 凝胶电泳载玻片的制备

  1. 取一份体积的单细胞悬液与十份体积的熔融状态、37 °C、0.5%低熔点琼脂糖溶液（见第1.2.1节）混合。立即吸取100 µl混合液滴加至预先涂有普通熔点琼脂糖的载玻片上（见第1.1节）。立即在细胞-琼脂糖混合物上加盖盖玻片。每个样本至少制备8张载玻片。
    注意：所有载玻片均应以数字或类似编码标识，并记录其对应信息，以便后续进行盲法分析（见下文6.2.2节）。
  2. 将载玻片平放，于4 °C冷却30分钟。
  3. 待凝胶完全凝固后，轻轻移去盖玻片，将载玻片浸入预冷的裂解缓冲液中（见第1.2.2节）。避光保存，并于4 °C在裂解缓冲液中孵育1小时（最短时间）至过夜（最长时间）。

4. 星状胶质细胞电泳载玻片的酶处理

  1. 从每份组织样本制备的8张载玻片中取出6张，移出裂解缓冲液，然后在室温下用酶缓冲液（见1.2.3节）清洗3次，每次5分钟。剩余的2张载玻片用于不加酶处理的碱性彗星实验（见下文5.1节）。清洗后，通过倾倒并用纸巾轻压载玻片以去除多余液体。
  2. 将hOGG1和Endo III酶贮存液用酶缓冲液按1:1,000（v/v）稀释，置于冰上保存，待用。
  3. 向每个处理组制备的载玻片分别加入200 µl以下溶液：仅200 µl酶缓冲液（使用2张载玻片作为对照载玻片）、200 µl hOGG1溶液（2张载玻片）或200 µl Endo III溶液（2张载玻片）。
  4. 将载玻片放入铺有湿润滤纸的培养皿中，用Parafilm封盖，37 °C孵育：Endo III处理组和对照组载玻片孵育45分钟，hOGG1处理组载玻片孵育30分钟。
  5. 孵育后，用蒸馏水冲洗载玻片，并按照下文5.2所述继续处理。

5. 解链与电泳

  1. 对于未用酶处理的载玻片，从裂解缓冲液中取出载玻片，沥干后用冷中和缓冲液（第1.2.5节）冲洗一次，5分钟，以去除残留的去污剂和盐分。
  2. 将步骤4.5和5.1中的载玻片随机放入水平凝胶电泳槽中，避免留有空隙。用新配制的pH > 13的电泳缓冲液（第1.2.4节）充满电泳槽，直至液面刚好覆盖载玻片（避免在琼脂糖上产生气泡，并确保电泳槽水平）。记录DNA解旋开始时的缓冲液pH值和温度。
  3. 让载玻片在碱性缓冲液中静置20分钟，以使DNA解旋并暴露碱性不稳定的损伤位点。
  4. 在解旋过程中，设置电源输出，使电泳槽内达到0.7 V/cm的电压（V/cm = 电压除以正负电极之间的距离，单位为cm）。
  5. 解旋结束后，按下电源的运行按钮。如有需要，通过调节缓冲液液面高度将电流调整至300 mA。保持缓冲液液面略高于载玻片表面。在4 °C条件下进行电泳20分钟。记录电泳开始和结束时载玻片的位置、缓冲液温度和电流（安培）。
    注意：缓冲液过多会导致电压降低，可能影响DNA迁移。
  6. 电泳结束后，轻轻将载玻片从电泳槽中取出，浸入中和缓冲液（第1.2.5节）中5分钟，以中和多余的碱。沥干载玻片，并重复此步骤两次。
  7. 将载玻片浸入冷的100%乙醇中固定5分钟。让载玻片自然晾干，并置于干燥处保存。

6. DNA 染色、彗星图像观察与分析

  1. DNA 染色
    1. 将载玻片放置在纸板或金属托盘上，向每张载玻片加入 200 µl 核酸荧光染色工作液（见第 1.2.7 节），并加盖玻璃盖玻片。避光放置，使载玻片与染色液接触至少 30 分钟后再进行评分。每次染色最多处理 20 张载玻片。
    2. 在读取每张载玻片前，轻轻吸去多余的染色液，注意不要扰动盖玻片。
  2. 彗星图像观察与评分
    1. 将连接于荧光显微镜的摄像机用于在计算机显示器上观察彗星载玻片的实时图像。
    2. 随机选择一个含有细胞的显微镜视野。使用鼠标点击选中一个细胞，用鼠标左键点击"彗星头部"的中心。
      注意：计算机软件将自动计算该细胞的所有测量参数，并将数据添加至数据文件中。
    3. 对当前视野中的所有细胞进行评分（见步骤 6.2.4），然后使用显微镜载物台控制装置及屏幕上的视频图像寻找下一组细胞。按照 6.2.2 中所述方法对这些细胞进行评分。
    4. 从右至左、从下至上对载玻片进行评分。随机选择约 10 个视野。在此过程中，任何出现在视野中的合适彗星细胞均应无偏倚地进行评分。
      注意：若出现以下任一情况，则不应对此彗星进行评分：1）位于载玻片任一边缘；2）两个或多个彗星重叠；3）尾部存在碎片；4）软件无法区分头部与尾部；或 5）细胞核和/或尾部的染色强度与载玻片上其他彗星存在显著差异。
      注意：几乎所有 DNA 荧光信号均位于尾部的彗星常被称为“刺猬状”（hedgehog）彗星。此类刺猬状彗星不应参与评分，但在载玻片评分过程中应记录所发现的刺猬状彗星数量，并以占总彗星数的百分比形式报告。
    5. 每张载玻片至少分析 75 个彗星，每种器官/组织阅读两张载玻片，以确保每个样本总共获得至少 150 个彗星细胞。当一张载玻片所需的细胞数量评分完成后，结果将保存为电子表格文件，供后续数据分析使用。

7. 组织病理学分析

  1. 在10%中性缓冲福尔马林中固定至少72小时后，进行组织修整21常规处理样本的左侧肝叶，并将其包埋于石蜡介质中22将样本切片至约5微米厚度，并收集于载玻片上。
  2. 用苏木精对切片进行染色 & 伊红（H&E)
    1. 将带有石蜡包埋组织切片的载玻片置于60 °C烘箱中加热2小时，然后再进行染色操作。
    2. 使用二甲苯对切片进行脱蜡。用梯度乙醇（EtOH）水化切片，最后用流水冲洗。
    3. 将切片置于450 ml苏木精中染色2分40秒。随后用酸液（2 ml冰醋酸加入450 ml去离子水中）冲洗4秒，再用流动的自来水冲洗5分钟。
    4. 将切片置于含有1 ml氢氧化铵的450 ml 70%乙醇中处理2分钟，随后用流水冲洗2分30秒，再用70%乙醇冲洗1分钟。
    5. 将载玻片置于含4 ml冰醋酸的450 ml伊红Y溶液中染色3分钟。
    6. 用梯度乙醇脱水切片。用二甲苯透明切片（每次1分钟，共三次），并在加盖盖玻片前将切片置于二甲苯中保存。
  3. 在光学显微镜下观察切片，记录结果，并根据严重程度对非肿瘤性病变进行分级：1级（极轻度）、2级（轻度）、3级（中度）或4级（显著）。
    注意：特定病变的严重程度分级依据是肝脏中该病变所占的相对比例（轻度 = <轻度 = 1–15%；轻度 = 16–35%；中度 = 36–60%；显著 = 61–100%。

8. 数据分析

  1. 动物被视为统计分析的实验单位。DNA损伤以尾部DNA百分比（% DNA in tail）表示。
  2. 氧化性DNA损伤的计算方法如下：对照组切片（未进行酶处理）可估算背景DNA链断裂（SB）水平。
    注意：经酶处理的切片可测量链断裂和氧化碱基的总量（SB + OX）。假设尾部DNA百分比随DNA损伤呈线性剂量反应关系，则从SB + OX中减去SB，即可估算由氧化嘧啶/修饰嘌呤引起的DNA链断裂23。
  3. 采用单因素方差分析（one-way ANOVA）分析不同剂量下尾部DNA百分比与剂量的关系，随后使用Dunnett检验将处理组动物的反应与溶剂对照组进行成对比较。
    注意：所有检验均为单侧检验，设定p值小于0.05作为统计学显著性的判断标准。

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结果

的 体内 碱性彗星实验与酶修饰彗星实验联合用于检测醋酸环丙孕酮（CPA）处理大鼠肝脏中的直接和氧化性DNA损伤5CPA 是一种合成激素类药物，能以性别特异性的方式诱导大鼠肝肿瘤，其中诱导雄性大鼠肝肿瘤所需的剂量是雌性大鼠的五倍。24我们发现，环磷酰胺（CPA）在雄性和雌性大鼠肝脏中产生的直接DNA损伤与其肝肿瘤发生性具有相同的性别特异性模式：与雌性大鼠相比，雄性大鼠需要高出五倍剂量的CPA才能诱导肝脏DNA损伤出现显著增加图1).

我们假设，彗星试验结果的性别特异性是由于羟基类固醇磺基转移酶（HST）的活性所致，该酶在成年雌性大鼠中的活性比成年雄性高15倍。HST代谢是环磷酰胺（CPA）活化为DNA结合性代谢物的关键限速步骤。25相比之下，CPA诱导的氧化性DNA损伤在雄性大鼠肝脏中通常高于雌性，因此在肿瘤形成过程中较不可能成为限速步骤...

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讨论

本方案描述了在单细胞水平上同时检测大鼠肝脏中直接性和氧化性DNA损伤的方法。该通用方案适用于任何能够分离出单细胞或细胞核且在处理过程中产生最少人为诱导DNA损伤的组织。即，这种DNA损伤并非由测试试剂引起，而是由于动物组织的处理和加工过程所致。在我们的研究中，已对骨髓细胞进行了碱性彗星试验7,9，胃6，肾脏9，膀胱9，肺9心脏10乳腺5子宫5，睾丸5，以及血液5这些检测方法可为研究实验动物多个器官和组织中外源性物质诱导的DNA损伤提供一种快速、简便且经济的手段。此外，该方法还可用于人群生物监测研究，例如对临床或职业暴露个体的外周血、尿道脱落细胞或口腔及鼻腔上皮细胞进行检测。该基本方法也可用于评估培养细胞中的DNA损伤。 体外.

当彗星试验被整合到急性或亚慢性毒理学研究中时，取样时间、 即末次给药至组织采集的时间间...

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披露

所有作者均无竞争利益或利益冲突。本材料中的信息并非美国食品药品监督管理局（FDA）的正式信息发布，不代表该机构的立场或政策。

致谢

本工作由美国食品药品监督管理局资助。我们承认 CPA 研究的原始出版物由爱思唯尔有限公司发表：Ding W, Bishop ME, Peace MG, Davis KJ, White GA, Lyn-Cook LE, Manjanatha MG。醋酸环丙孕酮处理的 F344 大鼠基因毒性性别特异性剂量反应分析。《突变研究》774: 1-7, 2014（PMID: 25440904）

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
盖玻片（1号，24 × 50 mm） Fisher12-544-14
显微镜载玻片Fisher12-550-123
二甲基亚砜（DMSO） Fisher67-68-5
乙二胺四乙酸二钠（EDTA）FisherBP120-1
磷酸盐缓冲液（PBS）FisherICN1860454
1×汉克斯平衡盐溶液（HBSS）（不含 Ca2+、Mg2+）HyCloneSH30588.02
HEPESFisherBP310-1
低熔点琼脂糖（LMP）Lonza50081NuSieve GTG Agarose
普通熔点琼脂糖（NMA） FisherBP1356-100
pH试纸条（pH 7.5–14）FisherM95873
氯化钾Fisher7447-40-7
氢氧化钾Fisher1310-58-3
载玻片标签（0.94 × 0.5 英寸）FisherNC9822036
氯化钠（NaCl） Fisher7647-14-5
氢氧化钠（NaOH） Fisher1310-73-2
SYBR™ Gold InvitrogenS11494
Triton X-100 Fisher9002-93-1
Trizma Base Fisher77-86-1
2.0 ml 微量离心管Fisher05-402-6
细胞滤网（40 µm）Fisher22363547
内切核酸酶III（Nth） New England BiolabsM0268S稀释比例 1:1,000
hOGG1 New England BiolabsM0241S稀释比例 1:1,000

参考文献

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大鼠肝组织单细胞悬液凝胶电泳荧光显微镜hOGG1 和 Endo III 酶CPA 诱导的 DNA 损伤
体内 碱性彗星试验及酶修饰碱性彗星试验用于检测大鼠肝脏中的DNA链断裂和氧化性DNA损伤
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