本文描述了一种简单且可重复的小鼠脑内小动脉（包括实质小动脉、穿支小动脉和毛细血管前小动脉的一类血管）分离方案，可用于压力肌图分析、免疫荧光、生物化学及分子生物学研究。
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摘要
摘要
脑实质内小动脉（PAs），包括脑实质小动脉、穿支小动脉和毛细血管前小动脉，是从软脑膜动脉和小动脉分支并深入脑实质的高阻力血管。每条PAs灌注一个独立的圆柱形脑实质区域及其包含的神经元。这些小动脉在脑血流的全局调节（脑血管自身调节）和局部调节（功能性充血）中起核心作用。PAs是神经血管单元的一部分，该结构通过匹配脑内局部血流与代谢活动，将神经元、中间神经元和星形胶质细胞整合在一起。PAs的灌注直接与特定区域内神经元的活动相关，神经元代谢增加会引发供血小动脉扩张，从而导致局部灌注增强。PAs的调节机制不同于特征更明确的软脑膜动脉。PAs中的压力诱导性血管收缩更强，且舒张机制也有所不同。此外，PAs不接受来自血管周围神经的外源性神经支配——其神经支配为内在性且通过星形胶质细胞终足的间接接触实现。因此，利用软脑膜动脉研究获得的收缩调节数据无法直接用于理解PAs的功能。此外，目前尚不清楚高血压和糖尿病等病理状态如何影响PAs的结构和反应性。这一知识空白部分源于PAs分离与插管的技术困难。本文中，我们提供了一种啮齿类动物PAs分离与插管的操作方案。此外，我们展示了可利用这些小动脉进行的实验示例，包括激动剂诱导的收缩和肌源性反应。尽管本文重点在于PAs插管与压力肌图技术，但分离的PAs也可用于生化、生物物理、分子及成像研究。
引言
脑循环具有独特的组织结构，可满足中枢神经元的代谢需求。神经元的能量储备有限，因此对氧分压和必需营养物质供应的变化高度敏感。当执行特定任务时，特定的神经元亚群会被激活，此时血管系统会促进局部灌注量高度局限性地增加，以防止局部缺氧和营养物质耗竭1。这种功能性充血被称为神经血管耦合，依赖于神经血管单元的正常运作，该单元由活跃的神经元、星形胶质细胞和脑动脉组成2。脑实质内微动脉（包括实质内、穿支和毛细血管前微动脉的一类血管）在这一反应中起核心作用，因此，对这些微动脉进行单独研究对于探讨神经血管耦合机制至关重要3。
实质小动脉是直径较小（20–70 µm）的高阻力血管，负责为大脑内特定的神经元群提供血液灌注。它们从脑表面的软脑膜动脉分支而出，以接近90ᵒ的角度深入脑实质，为皮层下微循环供血（图1）。这些小动脉在维持适当的灌注压方面起着关键作用，因为它们是含有平滑肌的最远端血管，能够保护毛细血管。与表面的软脑膜循环不同，实质小动脉缺乏侧支血管和吻合支，因此是脑循环中的"瓶颈"4。正因如此，实质小动脉功能障碍可导致脑血管疾病的发生，例如血管性认知障碍和小面积缺血性卒中（也称为静默性卒中或腔隙性卒中）。研究表明，高血压5和慢性应激6可诱发实质小动脉功能障碍，并且该现象是小血管病遗传小鼠模型中早期出现的事件7。此外，在大鼠中实验性地阻塞单个穿支小动脉足以引发呈圆柱形的小面积缺血性卒中，其形态与老年人中观察到的卒中相似8。
除了这些解剖学差异外，调节软脑膜动脉和脑实质小动脉收缩功能的机制也有所不同。脑实质小动脉的肌源性血管收缩更强9，这可能归因于缺乏外在神经支配10、不同的机械传导模式11，以及血管平滑肌细胞内Ca2+信号传导的差异12,13。有证据表明，这些血管节段之间的内皮依赖性血管舒张机制也存在差异，脑实质小动脉更依赖于血管壁内Ca2+激活的K+通道和电紧张耦联机制，而非一氧化氮和前列环素等可扩散因子14。因此，利用软脑膜动脉实验所获得的数据未必适用于脑实质小动脉，导致我们对脑血流局部调控机制的认识仍存在空白。
尽管它们具有重要性，但实质小动脉的研究却严重不足，主要原因是分离和安装以进行研究存在技术上的挑战 离体 本研究中，我们描述了一种分离并插管脑实质小动脉的方法，该方法可用于压力肌动图检测，或用于分离组织以进行免疫标记、电生理学、分子生物学及生物化学分析。
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方案
1. 套管和腔室的制备
- 将洁净的硼硅酸盐玻璃毛细管（外径：1.2 mm；内径：0.69 mm；长度：10 mm）插入带有铂丝（直径：100 µm）的拉针仪凹槽中。
- 使用适当的参数，利用微电极拉制仪将毛细管拉制成具有细长尖端的套管（图2）。所用参数为：加热温度 - 700，拉力 - 100，速度 - 50，时间 - 10。
- 将套管插入压力肌动图腔室的固定夹中，并正确对齐套管位置。
- 在解剖显微镜下使用镊子小心折断套管尖端，使其达到所需直径。此处展示的是尖端直径为10 µm的套管（图2）。
- 用含1.8 mM Ca2+的人工脑脊液（aCSF）填充两个套管；腔室中则填充不含Ca2+并添加1%牛血清白蛋白（BSA）和10 µM Diltiazem的人工脑脊液（所有溶液均应在实验开始前新鲜配制）。根据腔室大小，调节aCSF体积至5至20 ml之间。在准备进行插管前，将腔室保存于4 ᵒC环境中。
注：Diltiazem是一种可逆的L型电压门控钙通道抑制剂，可引起小动脉扩张，从而有助于插管操作
2. 实质小动脉的分离
- 在解剖前，立即采用经机构动物护理委员会批准的实验室标准方案对动物实施安乐死。首选使用巴比妥类药物或二氧化碳，因为其他常用麻醉剂可能对脑循环具有血管扩张作用。 15所有动物实验操作均已获得内华达大学医学院机构动物护理和使用委员会批准，并符合美国国立卫生研究院的规定。 "实验动物护理与使用的指导原则".
- 使用二氧化碳对动物实施安乐死。在断头前，需确认动物已停止呼吸，并且在捏其足爪时无任何反应。
- 使用锋利的剪刀（小鼠）或断头器（大鼠）将动物断头。去除头部皮肤，用尖头剪刀沿颅骨中线缝合线剪开。用钝头镊子（小鼠）或骨钳小心移除颅骨，暴露大脑半球。缓慢而仔细地取出脑组织，避免损伤表面软脑膜动脉。将脑组织放入盛有 20 ml Ca2+含1% BSA的冰上预冷aCSF
- 将含有垫片的解剖皿中加入含1% BSA的冰冻无Ca2+人工脑脊液（aCSF），并将脑组织腹面朝上转移至该皿中（图2A）。将培养皿置于解剖显微镜下（图3A）。使用27号针头将脑组织固定在垫片上，注意避免将针头置于大脑中动脉（MCA）附近。
- 定位大脑Willis环及其发出的中 cerebral 动脉（MCA）。使用锋利且对齐的Vannas弹簧剪，在MCA周围剪出一个小矩形。确保该矩形沿MCA全长的宽度接近5 mm。矩形的上部应超过Willis环的分支点（即位于Willis环近端）。 图2B，箭头）。
- 使用 Vannas 弹簧剪，在组织深处进行约 2 - 3 mm 的 undercut 操作。
注意：此步骤对于成功分离实质小动脉至关重要，可能需要经过数次尝试才能掌握。如果切口不够深，分离出的实质小动脉会较短；如果切口过深，在移除已解剖组织时，小动脉会在分支处断裂。 - 用昆虫针将脑片最远端固定在解剖皿中，使大脑中动脉朝上（远离威尔氏环）。在针附近的软脑膜处做浅切口，注意不要过深切割至下方的大脑皮层（否则针无法固定）。
- 用小镊子小心夹住软脑膜的两侧，开始从大脑皮层剥离软脑膜。如有必要，可夹持大脑中动脉，确保周围软脑膜不被损伤。
- 继续剥离，直至包含大脑中动脉（MCA）的软脑膜从皮层完全游离。注意，在靠近Willis环的区域，剥离时的阻力会增大。此时需格外小心，因为该区域存在较长的脑实质小动脉。
- 一旦软脑膜游离，将其小心放置在解剖皿垫片上，使朝向脑实质小动脉的表面朝下图2B).
- 使用 Vannas 弹簧剪刀将解剖出的微动脉从大脑中动脉（MCA）上完全剪下，确保血管两端平直剪切。
- 收集的微动脉可用于压力肌图、分子分析或原代平滑肌细胞及内皮细胞的分离。
3. 压力血管造影术
- 提前准备好缝合线。将深绿色尼龙线剪成5 mm长的小段，放置在培养皿中双面胶带的粘性面上。在解剖显微镜下，用精细镊子将每一段线分离成单根纤维，并将纤维一端穿过另一端形成松散的简单半结。
- 使用镊子从双面胶带上取下一个结，注意不要用力过猛。将缝线拉入浴槽溶液中，将结滑至套管上，并在距离套管尖端一定位置处扎紧。重复此操作，使每个套管上均有两条缝线。
- 用10% BSA溶液包被玻璃微量移液管，然后用Ca洗去多余溶液2+含1% BSA的无钙人工脑脊液
- 用玻璃微量移液器吸取50 µl溶液，吸取一条实质小动脉，转移至压力肌电图检测室。推动活塞，以连续动作将实质小动脉排入检测室，防止其黏附在玻璃微量移液器内壁。
- 使用两把超细镊子打开肺动脉（PA）管腔，注意仅接触血管的最末端。
- 用镊子夹住实质小动脉的边缘，小心地将血管拉至套管上。将血管拉至套管足够深处，使其不位于套管最尖端的锥形末端图3A).
- 松开套管上的2根缝线，并将其收紧固定在血管上（图3B缝合时，将缝线在血管上适当分开，边收紧边向操作者方向牵拉。在关闭实质小动脉对侧端之前，务必结扎所有分支。
- 将灌流 chamber 转向，将实质小动脉的对侧末端结扎为盲端。操作时，松开对侧套管上的结扎线，将套管插入动脉。缓慢收紧结扎线，使实质小动脉侧向固定于套管壁上，避免对小动脉产生纵向牵拉。图3C).
注意：如果研究目的是通过管腔灌注药物，则应插管另一端，而不是将实质小动脉结扎在插管侧壁。确保插管内部无盐晶体或任何积聚物阻碍管腔内流动。适当调节流速，以维持生理性剪切应力水平。一项由 Shih 进行的研究表明 等 显示大鼠穿支小动脉内的血流速率 8可作为初步研究的初始指导。 - 小心地将灌流 chamber 转移至用于记录血管直径的显微镜载物台上。将 chamber 固定在显微镜载物台上，并将温度探头以及灌流的进液口和出液口连接至相应的管路。使用实验室现有的加压系统（如水柱装置、与压力传感器相连的蠕动泵），将小动脉加压至腔内压力为 40 mmHg（小鼠实质小动脉）或 50 mmHg（大鼠小动脉）。 等等.). 图4D 显示了一个蠕动泵与压力传感器相连以对插管的微动脉加压的示例。
- 打开用于检测直径变化的系统图3E). 调整显微镜的设置（如照明和对比度），以获得最佳的检测效果。理想情况下，微动脉的管壁应呈暗色，管腔应呈半透明状。当检测效果达到合适状态后，开始记录实验。
- 启动 superfusion 系统。用预热（37℃）的溶液冲洗插管并加压的实质小动脉。 ᵒC) 含 1.8 mM Ca 的 aCSF2+ 在3-5 ml/min的流速下持续15至20分钟。此aCSF不应含有Diltiazem或BSA。
- 用60 mM KCl aCSF替换常规aCSF，以评估制备样本的活性。此时，微动脉应表现出10–20%的收缩。如果微动脉未达到该程度的收缩，应移除并重新插管另一支微动脉。
- 用普通aCSF洗去60 mM KCl。等待自发性肌源性张力的形成，此过程可能需要长达一小时。若此时微动脉仍未产生肌源性张力，则更换另一根微动脉。
注意：肌源性张力表现为血管管腔直径的逐渐（有时较为缓慢）减小，此过程无需收缩性激动剂或高浓度KCl溶液刺激。肌源性张力按以下公式计算：(1 - (活动状态管腔直径/静息状态管腔直径)) × 100 5适当的肌源性张力可能因处理方式、品系、物种和转基因情况而异， 等等生理性的肌源性张力通常在15%至30%之间5.
4. 压力血管造影实验示例：激动剂诱导的收缩与肌源性反应性
- 使用适当浓度的 aCSF 配制所选激动剂的一系列稀释液。本实验以血栓素 A2 受体激动剂 U46619 为例。配制 1 ml 浓度为 1 mM 的 U46619 储备液。取 100 µl 1 mM 溶液加入含有 900 µl aCSF 的新离心管中，制成药物的 10 倍稀释液，得到含 100 µM U46619 的溶液。重复此操作共进行 6 次稀释，浓度范围从 1 mM 至 100 nM，用于绘制浓度-反应收缩曲线。
- 将含激动剂的溶液全部体积（首次剂量为 1 ml，后续各剂量为 900 µl）加入 100 ml 正在灌流的 aCSF 中，这将使激动剂进一步稀释 100 倍。因此，浴槽中激动剂的最终浓度范围为 10 pM 至 10 µM。每种浓度下孵育微动脉约 10 分钟，直至管腔直径达到稳态。
- 用不含任何药物的 aCSF 对穿行微动脉（PA）进行灌流洗脱，直至 PA 直径恢复至初始值。随后将实质微动脉孵育于含 10 µM 地尔硫卓（Diltiazem）和 2 mM EGTA 的无 Ca2+ aCSF（不含 BSA）中，以诱导最大舒张，并记录微动脉的被动直径。
- 通过轻轻牵拉结扎线末端，将实质微动脉从套管上取下。用双蒸去离子水清洗血管腔室，以去除碎片和过量激动剂。用含 BSA 的无 Ca2+ aCSF 填充腔室，并套管另一条微动脉。不建议对同一条微动脉进行多次实验。
- 进行肌源性反应性实验时，使实质微动脉在 40 mmHg 管腔内压下平衡，直至产生自发性肌源性张力（如上所述）。将管腔内压降低至 5 mmHg，并让 PA 平衡约 5–10 分钟，直至管腔直径达到稳态。随后以选定的梯度逐步升高管腔内压（例如以 20 mmHg 为增量，从 5 mmHg 升至 140 mmHg）。
- 避免将微动脉暴露于低于 5 mmHg 的管腔内压，因为这可能导致血管塌陷并损伤内皮细胞，从而改变实验结果。
- 压力曲线实验结束后，用含 10 µM 地尔硫卓（Diltiazem）和 2 mM EGTA 的无 Ca2+ aCSF（不含 BSA）对实质微动脉进行灌流，并从最低压力开始重复压力梯度步骤。
注：此步骤可获得 PA 的被动直径，用于计算 % 肌源性张力，计算公式为：% 张力 = (1 - (主动直径 / 被动直径)) × 100。
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结果
图5A 显示了小鼠肺动脉在60 mM KCl aCSF作用下的典型收缩情况，用于评估血管制备的完整性。在60 mM KCl存在下，肺动脉应收缩15–30%。如果收缩幅度低于15%，则应弃用该肺动脉并重新插管另一条血管，因为这表明在分离和插管过程中微动脉可能已受损。
图5B展示了肺动脉在灌流液中暴露于血栓素A2类似物U-46619（浓度从10 pM至1 µM）后发生的收缩反应。每次加入不同浓度的U-46619后，通过观察管腔直径的减小来评估收缩程度。每次浓度下均允许肺动脉平衡10分钟。这些数据可表示为管径变化（Δ管径），也可表示为相对于60 mM KCl所引起的最大收缩的百分比血管收缩（%血管收缩），后者将管径变化归一化处理。
图...
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讨论
脑实质小动脉是高阻力的小动脉，吻合支和分支较少，负责灌注特定的神经元群。这些特化血管通过星形胶质细胞介导的血管舒张，在脑血管自身调节和神经血管耦合中起核心作用1。约50年前，Miller Fisher博士的开创性研究首次揭示了这些特化血管在脑血管疾病中的重要性，他描述了高血压患者脑内腔隙性梗死区域的脑实质小动脉存在结构改变（post-mortem16）。这些结构改变伴随功能障碍，可导致深部白质灌注不足，是血管性痴呆发生的主要危险因素之一17。脑实质小动脉在功能上不同于颅内大动脉、软脑膜动脉以及表面小动脉，因此利用脑血管树中其他血管段获得的研究数据难以直接外推至脑实质微循环。尽管这些小动脉在维持脑内稳态中具有明确的重要性，但针对其生理特性和功能反应的研究直到近年来才逐渐增多，主要原因在于其分离与操作存在技术上的困难。
在本论文中，我们描述了一种简单且可重复的技术，用于分离和套管 parenchymal 小动脉，以进行压力血管成像研究、分子分析，或制备原代平滑肌细胞和内皮细胞。此外，我们展示了利用该技术...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
由NHLBI R01HL091905（SE）、联合白质营养不良基金会CADASIL研究基金（FD）和美国心脏协会15POST247200（PWP）资助。作者感谢Samantha P. Ahchay提供图1的图像，以及Gerry Herrera博士对稿件提出的宝贵意见。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 人工脑脊液 | |||
| NaCl | Fisher Scientific | S-640 | |
| KCl | Fisher Scientific | P217 | |
| MgCl 无水 | Sigma-Aldrich | M-8266 | |
| NaHCO3 | Fisher Scientific | S233 | |
| NaH2PO4 | Sigma-Aldrich | S9638 | |
| D-(+)-葡萄糖 | Sigma-Aldrich | G2870 | |
| CaCl2 | Sigma-Aldrich | C4901 | |
| 牛血清白蛋白 | Sigma-Aldrich | A9647 | |
| 分离/插管 | |||
| 体视显微镜 | Olympus | SZX7 | |
| 超细镊子 | Fine Science Tools | 11252-00 | |
| Vannas 弹簧剪 | Fine Science Tools | 15000-00 | |
| Wiretrol 50 μl | VWR Scientific | 5-000-1050 | |
| 0.2 μm 无菌注射器滤器 | VWR Scientific | 28145-477 | |
| 微电极拉制仪 | Sutter Instruments | P-97 | |
| 硼硅酸盐玻璃，外径：1.2 mm，内径：0.68 mm | Sutter Instruments | B120-69-10 | |
| 深绿色尼龙缝合线 | Living Systems Instrumentation | THR-G | |
| 线性对准单血管腔室 | Living Systems Instrumentation | CH-1-LIN | |
| 带蠕动泵的压力伺服控制器 | Living Systems Instrumentation | PS-200 | |
| 视频尺寸分析仪 | Living Systems Instrumentation | VDA-10 | |
| 四通道记录仪，配备 LabScribe 3 记录与分析软件 | Living Systems Instrumentation | DAQ-IWORX-404 | |
| 加热装置 | Warner Instruments | 64-0102 | |
| 自动温度控制器 | Warner Instruments | TC-324B |
参考文献
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