脑实质小动脉的分离与套管插管

摘要

本文描述了一种简单且可重复的小鼠脑内小动脉（包括实质小动脉、穿支小动脉和毛细血管前小动脉的一类血管）分离方案，可用于压力肌图分析、免疫荧光、生物化学及分子生物学研究。

摘要

脑实质内小动脉（PAs），包括脑实质小动脉、穿支小动脉和毛细血管前小动脉，是从软脑膜动脉和小动脉分支并深入脑实质的高阻力血管。每条PAs灌注一个独立的圆柱形脑实质区域及其包含的神经元。这些小动脉在脑血流的全局调节（脑血管自身调节）和局部调节（功能性充血）中起核心作用。PAs是神经血管单元的一部分，该结构通过匹配脑内局部血流与代谢活动，将神经元、中间神经元和星形胶质细胞整合在一起。PAs的灌注直接与特定区域内神经元的活动相关，神经元代谢增加会引发供血小动脉扩张，从而导致局部灌注增强。PAs的调节机制不同于特征更明确的软脑膜动脉。PAs中的压力诱导性血管收缩更强，且舒张机制也有所不同。此外，PAs不接受来自血管周围神经的外源性神经支配——其神经支配为内在性且通过星形胶质细胞终足的间接接触实现。因此，利用软脑膜动脉研究获得的收缩调节数据无法直接用于理解PAs的功能。此外，目前尚不清楚高血压和糖尿病等病理状态如何影响PAs的结构和反应性。这一知识空白部分源于PAs分离与插管的技术困难。本文中，我们提供了一种啮齿类动物PAs分离与插管的操作方案。此外，我们展示了可利用这些小动脉进行的实验示例，包括激动剂诱导的收缩和肌源性反应。尽管本文重点在于PAs插管与压力肌图技术，但分离的PAs也可用于生化、生物物理、分子及成像研究。

引言

脑循环具有独特的组织结构，可满足中枢神经元的代谢需求。神经元的能量储备有限，因此对氧分压和必需营养物质供应的变化高度敏感。当执行特定任务时，特定的神经元亚群会被激活，此时血管系统会促进局部灌注量高度局限性地增加，以防止局部缺氧和营养物质耗竭¹。这种功能性充血被称为神经血管耦合，依赖于神经血管单元的正常运作，该单元由活跃的神经元、星形胶质细胞和脑动脉组成²。脑实质内微动脉（包括实质内、穿支和毛细血管前微动脉的一类血管）在这一反应中起核心作用，因此，对这些微动脉进行单独研究对于探讨神经血管耦合机制至关重要³。

实质小动脉是直径较小（20–70 µm）的高阻力血管，负责为大脑内特定的神经元群提供血液灌注。它们从脑表面的软脑膜动脉分支而出，以接近90^ᵒ的角度深入脑实质，为皮层下微循环供血（图1）。这些小动脉在维持适当的灌注压方面起着关键作用，因为它们是含有平滑肌的最远端血管，能够保护毛细血管。与表面的软脑膜循环不同，实质小动脉缺乏侧支血管和吻合支，因此是脑循环中的"瓶颈"⁴。正因如此，实质小动脉功能障碍可导致脑血管疾病的发生，例如血管性认知障碍和小面积缺血性卒中（也称为静默性卒中或腔隙性卒中）。研究表明，高血压⁵和慢性应激⁶可诱发实质小动脉功能障碍，并且该现象是小血....

方案

1. 套管和腔室的制备

1. 将洁净的硼硅酸盐玻璃毛细管（外径：1.2 mm；内径：0.69 mm；长度：10 mm）插入带有铂丝（直径：100 µm）的拉针仪凹槽中。
2. 使用适当的参数，利用微电极拉制仪将毛细管拉制成具有细长尖端的套管（图2）。所用参数为：加热温度 - 700，拉力 - 100，速度 - 50，时间 - 10。
3. 将套管插入压力肌动图腔室的固定夹中，并正确对齐套管位置。
4. 在解剖显微镜下使用镊子小心折断套管尖端，使其达到所需直径。此处展示的是尖端直径为10 µm的套管（图2）。
5. 用含1.8 mM Ca²⁺的人工脑脊液（aCSF）填充两个套管；腔室中则填充不含Ca²⁺并添加1%牛血清白蛋白（BSA）和10 µM Diltiazem的人工脑脊液（所有溶液均应在实验开始前新鲜配制）。根据腔室大小，调节aCSF体积至5至20 ml之间。在准备进行插管前，将腔室保存于4 ^ᵒC环境中。
   注：Diltiazem是一种可逆的L型电压门控钙通道抑制剂，可引起小动脉扩张，从而有助于插管操作

2. 实质小动脉的分离

1. 在解剖前，立即采用经机构动物护理委员会批准的实验室标准方案对动物实施安乐死。首选使用巴比妥类....

结果

图5A 显示了小鼠肺动脉在60 mM KCl aCSF作用下的典型收缩情况，用于评估血管制备的完整性。在60 mM KCl存在下，肺动脉应收缩15–30%。如果收缩幅度低于15%，则应弃用该肺动脉并重新插管另一条血管，因为这表明在分离和插管过程中微动脉可能已受损。

图5B展示了肺动脉在灌流液中暴露于血栓素A₂类似物U-46619（浓度从10 pM至1 µM）后发生的收缩反应。每次加入不同浓度的U-46619后，通过观察管腔直径的减小来评估收缩程度。每次浓度下均允许肺动脉平衡10分钟。这些数据可表示为管径变化（Δ管径），也可表示为相对于60 mM KCl所引起的最大收缩的百分比血管收缩（%血管收缩），后者将管径变化归一化处理。

图.......

讨论

脑实质小动脉是高阻力的小动脉，吻合支和分支较少，负责灌注特定的神经元群。这些特化血管通过星形胶质细胞介导的血管舒张，在脑血管自身调节和神经血管耦合中起核心作用¹。约50年前，Miller Fisher博士的开创性研究首次揭示了这些特化血管在脑血管疾病中的重要性，他描述了高血压患者脑内腔隙性梗死区域的脑实质小动脉存在结构改变（post-mortem¹⁶）。这些结构改变伴随功能障碍，可导致深部白质灌注不足，是血管性痴呆发生的主要危险因素之一¹⁷。脑实质小动脉在功能上不同于颅内大动脉、软脑膜动脉以及表面小动脉，因此利用脑血管树中其他血管段获得的研究数据难以直接外推至脑实质微循环。尽管这些小动脉在维持脑内稳态中具有明确的重要性，但针对其生理特性和功能反应的研究直到近年来才逐渐增多，主要原因在于其分离与操作存在技术上的困难。

在本论文中，我们描述了一种简单且可重复的技术，用于分离和套管 parenchymal 小动脉，以进行压力血管成像研究、分子分析，或制备原代平滑肌细胞和内皮细胞。此外，我们展示了利用该技术.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
人工脑脊液
NaCl	Fisher Scientific	S-640
KCl	Fisher Scientific	P217
MgCl 无水	Sigma-Aldrich	M-8266
NaHCO3	Fisher Scientific	S233
NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S9638
D-(+)-葡萄糖	Sigma-Aldrich	G2870
CaCl2	Sigma-Aldrich	C4901
牛血清白蛋白	Sigma-Aldrich	A9647
分离/插管
体视显微镜	Olympus	SZX7
超细镊子	Fine Science Tools	11252-00
Vannas 弹簧剪	Fine Science Tools	15000-00
Wiretrol 50 μl	VWR Scientific	5-000-1050
0.2 μm 无菌注射器滤器	VWR Scientific	28145-477
微电极拉制仪	Sutter Instruments	P-97
硼硅酸盐玻璃，外径：1.2 mm，内径：0.68 mm	Sutter Instruments	B120-69-10
深绿色尼龙缝合线	Living Systems Instrumentation	THR-G
线性对准单血管腔室	Living Systems Instrumentation	CH-1-LIN
带蠕动泵的压力伺服控制器	Living Systems Instrumentation	PS-200
视频尺寸分析仪	Living Systems Instrumentation	VDA-10
四通道记录仪，配备 LabScribe 3 记录与分析软件	Living Systems Instrumentation	DAQ-IWORX-404
加热装置	Warner Instruments	64-0102
自动温度控制器	Warner Instruments	TC-324B