低质量和低数量肿瘤活检丰枯台过程的集成优化了有针对性的下一代测序

Summary

描述了一种用于肿瘤标本靶向下一代测序的集成系统。该跨平台系统针对低质量和低数量肿瘤活检进行了优化，可容纳低 DNA 起始量，包括特征明确的多变体对照，并具有由定量分析前质量控制措施提供信息的新型变体调用方。

Abstract

全新一代测序（NGS）程序包括在实验台上进行的试验（"湿板凳"）和数据分析利用生物信息学管道（"枯坐板凳"）进行。两个元件是必不可少的，以产生精确可靠的结果，这是对临床实验室尤为关键。有针对性的NGS技术已经越来越多地发现，有助于肿瘤的应用，以帮助推进精密医学的目标，但这些方法往往涉及断开和可变干湿替补的工作流程和不协调的试剂组。在本报告中，我们描述了用于测序挑战癌症标本用21基因面板作为综合目标NGS系统的一个例子的方法。该系统集成了采用解析验证，单一来源的试剂与生物信息学的独立功能套件DNA定量和资格，单管多重PCR富集和库净化和正常化。其结果，准确变体从调用低质量和低量的福尔马林固定，石蜡包埋（FFPE）的并且可以实现细针穿刺（FNA）肿瘤活检。该方法可常规从400可扩增DNA拷贝输入评估癌症相关的变体，和采用模块化设计，以适应新的基因的内容。两种不同类型的解析自定义控制提供质量保证和帮助保护呼叫准确性临床相关样本。灵活的"标签"PCR步骤嵌入特定于平台的适配器和索引代码，使样品条形码和普通台式NGS仪器的兼容性。重要的是，该协议是流线型的，并且能够产生在一天24序列就绪库。最后，该方法通过直接将预分析样品的质量控制结果纳入变量调用算法，提高突变检测的准确性和区分假阴性和indeterm链接湿法和干法工艺替补inate电话。此靶向NGS方法使用两个湿件和软件，以实现高深度，多路复用测序和异质癌症样品用于诊断应用的敏感分析的进步。

Introduction

精度药物依赖的患者的诊断和治疗方法的个体。的定制处理的承诺是疾病途径，可以告知分子诊断和靶向治疗的连杆的改进的理解的直接后果。例如，采用分子靶向治疗，从11％上升至46％2003至13年^1，以及诸如vemurafenib和crizotinib抗癌药物与同伴诊断测试FDA批准。用其横跨高度多路复用样本集，以精确地恢复低丰度序列目标的能力，新一代测序（NGS）已成为选择用于评估与癌症相关的遗传畸变和识别用于精密医药分子靶的方法。

最常见的实体肿瘤活检进行分子检测包括福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）和细针穿刺（FNA）SPECIMENS。这些样品都是充满了低数量和/或低质量的核酸挑战准确评估NGS ^2-5。目前商业NGS对这些样品的分析方法是基于不同的试剂，协议和信息学工具，代表的持续性改进移动目标的拼凑。例如，在分析化学和/或软件发生改变每1-2个月为最常用的有针对性的NGS包^6。这种不稳定性反映在构建和验证的统一NGS系统有挑战性标本类型，特别是用于癌症的检测缺乏连贯性，并提出了不适当的负担上实验室开发出从样品到结果的优化内聚协议。事实上，最近的一项NGS用户的调查强调了这些"瞬息万变"的技术困难，为建立，医学上可操作的内容，根深蒂固的生物信息学的专业知识，一个solidifi要求沿ED和可以迅速实施综合性的过程，简化的工作流程和简化的协议，它们劳工教育⁷方便。在这篇文章中，进行有针对性的NGS全面系统介绍，解决这些差距。

所提出的方法集成了解析前到后的分析在湿法和干法台的所有程序步骤，以提高精度，灵敏度和目标量化和检测的可靠性为临床相关癌基因位点的NGS。这种做法与"功能"DNA ⁴的量化开始，评估DNA的质量，引导投入PCR富集步骤，防范，可以从非常低模板拷贝的审讯出现假阳性的电话。单管多重PCR那么丰富了只用400扩增DNA拷贝46个位点在21个癌症基因，其次是全光照NGS平台特定的序列掺入摹常见的桌面测序仪器。库是使用一个简单的磁珠程序纯化，并用一个新的，免校准qPCR分析定量。一个独立的生物信息学套件，通过DNA样本QC成果告知提高通话性能，提供以下NGS序列分析。我们目前使用这种系统方法的数据进行有针对性的NGS揭示基地替代突变，插入/缺失（插入缺失），和拷贝数变异（CNV的）在低质量和低量的肿瘤活检，如FFPE和FNA样品，并运行控制。

Protocol

注意:此协议描述了使用MiSeq NGS系统的样品的同时处理，而是可以适用于个人基因组机（PGM）的仪器。对于400扩增模板份建议的最低DNA输入，分析能够产生至少平均3,000倍覆盖每一个每NGS运行96个样品，和等效覆盖深度使用PGM一个318芯片上的24个样品。该方法还需要使用实时PCR仪器。

1. DNA定量的功能和质量控制（QC）

1. 解冻试剂:2倍主混合物，引物探针混合物，抑制引物探针混合物，6-羧基-X-罗丹明（ROX），稀释剂，和四个人类基因组DNA的校准曲线的标准（DNA标准（50纳克/微升），DNA的标准（10纳克/微升），DNA标准（2纳克/微升），和DNA标准（0.4毫微克/微升））（ 表1）。旋涡以最大速度为10秒所有试剂，持续10秒，离心收集内容。保持冰的2倍母液。
2. 制备主混合物的足够量的样品的总数进行测试和包括10％体积，以避免由于移液短缺。使用每样以下几卷，准备在离心管的主结构:5微升2X预混液，0.5微升引物探针混合，0.5微升抑制引物探针混合，0.05微升ROX和2.95微升稀释剂。涡旋10秒和离心机以最大速度为10秒，收集内容。
3. 添加9微升主混合物到96孔板的孔中。
4. 加入1微升的DNA标准的一式两份，以产生校准曲线。移液器向上和向下的5倍混合。
5. 确保核酸样品在使用前充分混合。 1微升样品添加到主结构和吹打混淆和向下的5倍。
6. 密封10秒，离心平板，涡旋在最大速度为10秒，收集内容。
7. 放置板进入PCR系统。分配两个FAM（功能量化）和VIC（功能抑制）根据制造商的说明对每个样品检测器。在95℃（在95℃下，在60℃下1分15秒）进行10分钟的PCR循环，和40个循环。
8. 通过产生一个线性回归曲线图对于每个使用软件协议的重复DNA的标准分析定量PCR数据。
9. 积的拷贝数的对数₁₀为在x轴各DNA标准和在y轴上的相应_FAMÇQ值。
10. 确认从核酸样品落在该DNA标准校正曲线的动态范围内的结果，然后从参考标准曲线上的对应位置计算未知DNA的浓度在"功能性"或可扩增拷贝数每微升。 图1显示了通过和失败校准曲线的例子。
11. 确定是否在每个反应发生通过检查非人类靶扩增子中的VIC通道中存在的扩增。
    注意:作为阳性对照，在抑制引物探针混合物包含特异于非人类外源目标和相应的模板的引物。的抑制引物探针混合物是被加入到每个反应，包括无模板对照（NTC）的主混合物的成分。在缺乏抑制剂，对非人类的目标PCR产物应始终在VIC通道检测。在VIC通道一个样本的"未检测到"C _Q表示可从样品之前进一步处理之后清理受益PCR抑制剂的存在。

2.文库制备:基因特异性（GS）PCR

1. 制备主混合物的足够量为待测试的样品的总数，并包括10％的体积，以避免由于pipett短缺ING。使用每样本下面的卷准备在微量离心管在GS PCR主混合物:5微升2×扩增主混合物（ 表1）和1μl泛癌症底漆面板（ 表1）。移液器向上和向下，涡旋10秒和离心机以最大速度为10秒，收集内容混合。
2. 分装6微升的GS PCR主混合物到96孔板的孔中。加入4微升各核酸样品放入单独的井。到其它孔， ​​加入4微升FFPE控制的（ 表1），4微升多变量控制（ 表1）的，和4微升不含核酸酶的水用于一个程序的NTC。对于每个另外，通过吹打向上和向下5次混合。
3. 密封10秒，离心平板，涡旋在最大速度为10秒，收集内容。
4. 放置在热循环仪的板用于以下PCR循环:5分钟95℃，2个周期（15秒95℃，在60℃下4分钟），23个循环（在95℃下，在72℃4分15秒），和10分钟，在72℃最终延伸。保持在4℃。
   注意:步骤2.4的结束后，将板将作为对GS PCR板被引用。

3.文库制备:PCR标记

1. 解冻试剂:2X指数预混液（ 表1），指数代码（ 表1）。涡旋10秒和离心机以最大速度为10秒，收集内容。
   注意:索引代码预混，以提供一组唯一的成对指数（条码）每个样品的。
2. 在96孔板，加入2倍指数预混的7.5微升和指数代码的5.5微升到指定的井和吹打混淆和向下的5倍。
3. 小心打开GS PCR板，加入2μLGS PCR产物与预混新盘。移液器向上和向下的5倍混合。对于每个样品，记录样品标识和相应的配对指数代码。密封10秒，离心平板，涡旋在最大速度为10秒，收集内容。
4. 放置在热循环仪和PCR 5分钟的板在95℃下，10个循环（30秒95℃，55℃，72℃1分30秒），和10分钟，在72最后延伸C。保持在4℃。
   注意:步骤3.4的结束后，将板将作为标记PCR板被引用。

4.图书馆纯化和大小选择

1. 从2-8℃，取出库纯准备磁珠（ 表1）和洗脱缓冲液（ 表1），并允许平衡至室温30分钟。 9.6毫升100％乙醇添加至洗涤缓冲液（ 见表1）的容器中，盖和颠倒瓶子几次混匀。
2. 涡旋10秒磁珠，并添加11微升到9的分开的孔6孔板中。
3. 打开标签PCR板加入10微升标记PCR产物的珠和吸管搭配5倍。孵育混合物在RT 4分钟。
4. 放置在磁性支架（ 见表1）的96孔板于4分钟。随着仍是96孔板上的立场，删除和丢弃用吸管取上清液。
5. 从磁性支架取出96孔板，并添加100μl的含有乙醇的洗涤缓冲液到每个孔中，并通过移液混合向上和向下的5倍。孵育2分钟。
6. 放置在磁性支架2分钟的96孔板，然后取出并丢弃用吸管将上清液。
7. 重复步骤4.5，为总共2乙醇洗涤后，第二次洗涤后，除去尽可能多的洗涤液成为可能。
8. 与在磁性支架上的96孔平板，干燥珠粒在室温下2分钟，然后从支架移除板。
9. 通过加入20微升洗脱缓冲液，以每逢重悬珠子升和吸管向上和向下的5倍。
10. 在室温下孵育2分钟。
11. 放置96孔板背面上的磁性支架4分钟，并小心地取出并转移18微升上层清液，以一个新井。
    注意:程序可以安全地停止在这一步和样品储存在-15至-30℃。要重新启动，继续操作前在冰上解冻冷冻样品。

5.图书馆量化

1. 解冻库定量（LQ）试剂:2倍LQ主混合物，LQ引物/探针混合，LQ标准，LQ阳性对照，LQ稀释剂，和LQ ROX（ 表1）。涡旋10秒和离心机以最大速度为10秒，收集内容。
2. 使用纯化的文库的产品，执行LQ稀释剂每个单独样品的系列稀释。
   1. 加入2微升（库纯化产品），以198微升LQ稀释剂及混合向上和向下用吸管10倍。
   2. 加入2微升（1:100稀释）至198微升LQ稀释剂及混合使用吸管10次向上和向下。
3. 制备LQ主混合物的足够量的样品的总数进行测试和包括10％体积，以避免由于移液短缺。使用每样本下面的卷准备LQ主混合物在微量离心管中:5微升2X LQ预混，2微升LQ引物/探针混合，0.5微升LQ标准和0.5微升LQ ROX。移液器向上和向下，涡旋10秒和离心机以最大速度为10秒，收集内容混合。
4. 添加8微升LQ主结构的光学96孔板的孔中。
5. 在单独的孔中，加入2微升稀释文库，2微升LQ阳性对照和2μlLQ稀释剂（NTC）和移液器向上和向下5次混合。密封用光学粘合剂膜，涡流板10秒和离心机在400×g离心10秒收集内容。
6. 同时将与FAM和VIC DETECTORS每个样品。在95℃（在95℃下，在60℃下1分15秒）执行使用5分钟的循环条件进行PCR扩增，和40个循环。
7. 确定使用比例C _Q滤波方法各样品（纳米）的浓度。计算已知LQ标准（C _q VIC）未知库（C _q FAM）的区别。稀释样品（PM）的浓度，使用下式计算:
   [ 浓度_{LIB] 纳米} = ^{12.5×2ΔCq的}
   如果使用超过10,000之外的稀释因子，计算目标稀释因子的比率至10,000，并通过在5.7的等式的结果乘以该因子。

6.图书馆规范化和样本池

1. 确定平均浓度（NM）在所有样本（每片含独特的配对指数），以统筹。
2. 确定个体样品volumE（微升）由5在所有样本中位数乘以浓度，然后由它的个体浓度（NM）除以汇集。轮所得到的值到最接近的整数。圆卷带值<2微升至2微升，和卷> 15微升至15微升。
3. 每个样品的归一化体积（微升）添加到单个的离心管以形成样品池。
4. 计算使用圆整数值每个样品的新浓度并记录结果。
5. 确定样品池的浓度，计算所有个体浓度的总和，并记录所得到的值（nm）的。
6. 稀释样品池使用排序稀释液（ 表1）1.25纳米。
   注意:程序可以安全地停止在这一步和样品储存在-15至-30℃。要重新启动，继续操作前在冰上解冻冷冻样品。

7.测序

1. 代纳URE加入以下的PhiX控制V3（ 表1）存在的样品池:15微升1.25 nm样品池，3微升0.5纳米PhiX和2微升的1N NaOH的。短暂涡旋后短暂的离心和在室温下孵育5分钟。
2. 广场上冰的变性样品池。
3. 添加8微升变性库到992微升预冷HT1-HYB缓冲到一个离心管中。短暂涡旋混合，随后简要介绍离心收集内容。置于冰上。
4. 加入600微升变性及摊薄库来定位试剂盒＃17。
5. 解冻读取1测序引物（ 表1），索引读测序引物（ 表1），并阅读2测序引物（ 表1）。在离心管，分别与稀释636微升HT1-HYB缓冲4微升测序引物。注:HT1-HYB缓冲区是提供智慧小时测序试剂盒（ 表1）。
6. 通过以最大速度涡旋10秒并离心10秒，收集内容混合。加入600微升稀释读1测序引物的定位测序试剂盒＃18，600微升稀释指数读取引物定位＃19，和600微升稀释读2测序引物的定位＃20。
7. 根据制造商的说明上加载的NGS仪器（ 表1）和序列的试剂。执行配对末端2×150循环测序运行。

8.数据分析

注:NGS仪器软件集群图像转换到基本通话和质量评分，解复用两两指标产生个别gzip压缩FASTQ（* .fastq.gz）文件对每个样品。之前分析所述解复用后的文件，读者必须下载并安装相关的生物信息学软件（ 表1）。该软件可以在消费级的Windows PC上安装，并不需要专门的计算机硬件或网络连接进行数据分析。

1. 双击软件桌面图标。
2. 登录使用在软件手册中提供的用户名和密码登入系统。
3. 打开该项目的仪表板，然后单击"新建项目"。
   1. 命名该项目，并提供一个可选的项目描述。选择有针对性的NGS面板类型和NGS仪器类型。点击"保存并继续"。
   2. 上传前压缩文件FASTQ和反向读取。不要上传"未分配"FASTQs，其中包含读取未能解复用。点击"保存并继续"。
   3. 输入的作为由该DNA官能定量测定（见上述步骤1）测定的以制备每个库功能的输入拷贝数。手动从价差中添加值或复制和粘贴值片成注释表。点击"保存并继续"。
   4. 查看上传用于分析的注释库，并点击"提交分析"启动的分析。
4. 监测通过项目仪表盘显示的分析的进度。
   注:当结果准备好审查提出了一个完整的分析状态指示。
5. 复查样品质控指标分析结果，包括每个库全覆盖，百分比读取路过滤器，扩增覆盖的深度和均匀性。查看变种呼吁与dbSNP数据库，COSMIC，1000基因组和功能和人口级别的注释其他来源的每个测序库。
6. 导出的原始结果总结电子数据表的表，* .bam文件和* .vc​​f文件用于长期贮存或下游分析互补信息学工具。

Results

共有90个样品（74唯一）表示阳性和阴性对照，以前表征的细胞系，和残余临床FFPE肿瘤活组织检查进行评估扩增的DNA，输入到多重PCR富集，具有标记序列适配器，条形码，并且在一个单一的分析所产生19.1中号的台式仪器NGS运行（ 图2）读取通过过滤器。摩尔样品池导致高深度测序（3,692x读取），并均匀覆盖（覆盖的中位数阅读深度的5倍之内的扩增97.8％）。离群值包括无模板对照，1个细胞系DNA具有大拷贝数的扩增，并且这是由预分析QC测定标记用于PCR抑制1 FFPE的DNA（ 图3）。横跨46的扩增子的覆盖均匀性使用三种不同的操作符（ 图4A），并且对于不同的低质量FFPE DNA样品（保持图4B和插入表中的"FFPE3"）的输入。此外，12个合成的DNA模板，每个代表一个已知的"驱动器"碱基置换突变，混合物揭示了预期的突变在9的预期范围- 17％平均等位基因频率（ 见表2）。细胞系和FFPE DNA样品与拷贝数扩增的稀释展示了在EGFR和KRAS，分别（ 图5）的变体剂量依赖性。重要的是，FFPE的DNA输入可以减少到少至50可扩增拷贝或1.2纳克散装的DNA，同时保持已知突变的检测，而不假阳性呼叫（ 图6）。 DNA输入被安置在一个100倍的范围可达至少50,000份扩增（ 表3）。在这个和有关的实验中，变体调用22 FFPE和报告了与共享突变覆盖率（ 表4）独立的方法的协议20 FNA样品。

对于该测定法的灵敏度和阳性预测值是从97样品，包括FFPE，FNA，新鲜冷冻，和细胞系的DNA，和一个总的195测序结果进行分析来确定。结果显示365真阳性变种电话，4假阴性呼叫和1假阳性呼叫的98.9％的敏感性（95％CI:97.1-99.7％）的99.7％（95％CI和阳性预测值（PPV） :98.2-99.99％）。在33样品运行两种常见​​的EGFR变体（p.E746_A750delELREA和p.V769_D770insASV）进行插入和缺失的分析，展示了93.9％的敏感性（95％CI:78.4-98.9％）和100％（95％CI一个PPV:86.3-100％）与变体检测的范围内的2.4-84.8％。

图1:DNA定量校准曲线的合格和不合格QC标准 （A）通过标准曲线的例子 。 （B）发生故障的标准曲线。在这种情况下，该故障是由最低输入DNA标准重复的移液引起的。 请点击此处查看该图的放大版本。

图2:肿瘤学应用的全面而有针对性NGS系统概述了集成预解析人，分析和分析后的工作流程。 请点击此处查看该图的放大版本。

图3:读取范围和均匀性为相比于完整细胞系DNA和控制低质量的FFPE DNA肿瘤基因靶向NGS共90个样品，其中包括剩余临床FFPE（实心圆），细胞系（空心圆。 ），以及使用单管，21基因的多重PCR富集了处理合成的模板DNA（正符号）。每个扩增子库标记为NGS乐器适配器序列，具有鲜明的双指数代码，纯化，定量，标准化为2.5纳米的浓度有条形码。通过同伴生物信息学软件的DNA文库测序和分析。样品德维ations包含系列稀释的MDA-MB-468细胞系DNA的轴承大的EGFR拷贝数扩增（顶部，虚线圆内开放的矩形），该失真的覆盖均匀性和一种黑素瘤FFPE样品未能产生可观的读取次数因从DNA提取PCR抑制剂的结转。黑素瘤样品失败（底部，虚线圆），通过预分析定量PCR的DNA的QC分析预测。 NTC，无模板控制（X符号）。 请点击此处查看该图的放大版本。

图4:扩增子逐扩增读取范围，均匀性及变异检测残留临床肿瘤FFPE DNA。 （A）横跨测量有代表性的FFPE DNA样本中的所有丰富的座位阅读报道在三个不同的运营商。操作员1，OP1（蓝条）;操作2，符Op2（绿柱线）;运营商3，OP​​3（黑网吧）。 （B）覆盖均匀和变异的呼叫使用三个FFPE肿瘤样本进行评估，包括控制混合物（FFPE3，灰色条和文字）由一个已知的5％的BRAF c.1799T> A突变。 FFPE1（蓝条和文本），FFPE2（橙色条和文本）。 请点击此处查看该图的放大版本。

图5:在细胞系和石蜡包埋的DNA的MDA-MB-468细胞系的DNA与充分表征的EGFR拷贝数扩增拷贝数变体的剂量依赖性检测的参考非突变细胞的背景下被逐渐稀释直插DNA来说明拷贝数变化为下降稀释的功能。每个细胞系的DNA样品的百分比示出具有鲜明的线（0，12.5，25，50，和100％）。卵巢肿瘤的FFPE样品与已知KRAS放大透露稀释使用相同的滴定系列相似的轮廓，但100％FFPE DNA的两个顶级线路重复。 请点击此处查看该图的放大版本。

图6:精确的突变检测和定量50扩增的FFPE DNA拷贝，或1.2纳克散装DNA结肠癌FFPE DNA是由基于定量PCR-QC法测定的扩增拷贝数，从400稀释到25份作为。输入之前测序多重PCR富集。生物信息学管道正确调用这两个已知的瓦里安TS下降到50份，或10〜突变模板的等价物。 请点击此处查看该图的放大版本。

材料/材料的名称	公司	目录编号
2X Quantidex预混	Asuragen公司	145345
定量引物探针混合	Asuragen公司	145336
抑制引物探针混合	Asuragen公司	145344
ROX	Asuragen公司	145346
冲淡	Asuragen公司	145339
DNA的标准（50）	Asuragen公司	145340
DNA的标准（10）	Asuragen公司	145341
DNA的标准（2）	Asuragen公司	145342
DNA标准（0.4）	Asuragen公司	145343
2倍放大预混	Asuragen公司	145348
潘癌症底漆面板	Asuragen公司	145347
潘癌症FFPE控制	Asuragen公司	145349
泛癌症多变量控制	Asuragen公司	145350
图书馆纯准备珠	Asuragen公司	145351
洗涤液	Asuragen公司	145352
洗脱缓冲液	Asuragen公司	145353
2X LQ预混	Asuragen公司	145358
LQ稀释剂	Asuragen公司	145354
LQ正控制	Asuragen公司	145355
LQ标准	Asuragen公司	145356
LQ底漆/探针混合物（ILMN）	Asuragen公司	145357
LQ ROX	Asuragen公司	145359
指数代码（ILMN） - 设置A	Asuragen公司	150004
AIL001 - AIL048（48）
指数代码（ILMN） - 设置B	Asuragen公司	150005
AIL049 - AIL096（48）
2X指数预混	Asuragen公司	145361
阅读1测序引物	Asuragen公司	150001
指数读测序引物	Asuragen公司	150002
阅读2测序引物	Asuragen公司	150003
测序稀释剂	Asuragen公司	145365
Illumina的MiSeq	Illumina公司
MiSeq试剂盒v3的（600周）	Illumina公司	MS-102-3003
MiSeq试剂盒纳米V2（300周）	Illumina公司	MS-103-1001
PhiX控制V3	Illumina公司	FC-110-3001
磁力架-96（或同等设备）	Ambion公司	AM10027
Quantidex Reporter软件	Asuragen公司

表1:试剂和试剂盒在首次使用ROX的，储存在2-8°C的小瓶。不要再次冷冻。软件可以在www.asuragen.com下载。

G烯	COSMIC变种	COSMIC氨基酸	％变异
NRAS	c.182A"G	p.Q61R	13.3
NRAS	c.35G>一个	p.G12D	15.2
HRAS	c.182A"G	p.Q61R	17.8
HRAS	c.35G>一个	p.G12D	9.2
KRAS	c.182A"G	p.Q61R	13.5
KRAS	c.35G>一个	p.G12D	19.1
PIK3CA	c.1633G>一个	p.E545K	9.3
PIK3CA	c.3140A"G	p.H1047R	9.1
KIT	c.2447A> T	p.D816V	14.6
EGFR	c.2369C> T	p.T790M	11.3
EGFR	c.2573T"G	p.L858R	14.9
BRAF	c.1799T>一个	p.V600E	17.3

表2:一个共用的综合治理是一个由12个"驱动程序"癌症基因变异的是在9-17％丰度量化的12个不同的双链合成模板轴承12个不同的基因突变的混合物评估下列顺序。所有的变种已被正确调用没有误报。

样品编号	实用 CPS	基因	COSMIC变种	COSMIC氨基酸	>％变异	平均阅读深度	％中位数的5倍以内
BCPAP	400	BRAF	c.1799T>一个	p.V600E	99.5	3289	96％
BCPAP	万	BRAF	c.1799T>一个	p.V600E	99.7	4040	98％
BCPAP	25000	BRAF	c.1799T>一个	p.V600E	99.4	3687	96％
BCPAP	50000	BRAF	c.1799T>一个	p.V600E	99.7	4611	93％

表3:覆盖和变体呼叫将被保留在DNA输入的> 100倍的范围内。

表4:变异召唤在22 FFPE和20 FNA肿瘤活检同意由独立突变测试结果一组22 FFPE肿瘤DNA与先前由正交针对性的NGS实验，检测突变状态是投入在400至2,928扩增拷贝到PCR富集。步骤，并使用21基因泛癌症面板测序。此外，20个活检DNA样品队列先前使用液体珠阵列突变试验⁸是使用156至36080输入扩增拷贝并测序PCR扩增为特征。泛癌症NGS面板和参考，之间的所有通话重叠NCE方法是一致的。 请点击此处查看该图的放大版本。

Discussion

NGS技术已经重新定义了询问肿瘤活检的分子分布在临床设置⁹预期。许多靶向NGS面板已经开发了作为研究的技术，实验室开发的测试，并且可商购的产品和定制面板用于评估多种类型临床标本^3,5,10-15的。从多项研究报告表明NGS的值作为一个敏感和特异的临床工具，用于检测基因组改变^3,10-12,14的。还研究也表明工件可引起从有挑战性癌活检的假阳性结果，如FFPE标本^2-5,12,14的风险。此外，最近的出版物都强调高故障率，使用肿瘤标本NGS ¹⁶和假阳性与商业目标NGS面板调用，通过采用低输入DNA ¹²的恶化。其结果是，一些labora保守党要么修改或添加额外的制衡措施，以市售的有针对性的NGS技术来提高性能，往往以确保准确性或证实其结果从生物信息学分析^5,10,11。

21-基因面板（ 图2）被开发作为用于全面NGS系统询问循证，可操作的突变具有挑战性的标本类型如FFPE和FNA肿瘤活组织检查目标内容。工作流有许多优点:1）通过提供均匀的扩增子的覆盖（ 图3和4， 表3）一致; 2）易于使用通过提供预配制，优化的试剂组，并简化了生物信息学的要求; 3）效率通过简化工作流程并减少相比，其他商业NGS方法吸移步骤的数目;和4）通过掺入的DNA的QC测定用于评估amplifi精度能够DNA拷贝数，以确保可接受的模板多样性和避免变异检测⁴的随机波动。与生物信息学分析的分析前质量控制数据的集成允许FFPE DNA的低投入。这是通过使用跨400 FFPE样品DNA输入的不同功能副本真理的独立措施培养了决策树算法，并纳入该算法进入生物信息学软件来实现的。其结果是，在400可扩增拷贝，通常相当于〜5-20纳克FFPE DNA的建议输入，逊色到FFPE的DNA〜250毫微克建议^17,18的其他方法^10-12，包括基于杂交的富集。虽然该技术被用于在MiSeq平台使用说明，但可以通过使用标记的PCR引物用仪器专用适配器以能在其他的NGS平台序列分析进行修改。

几个步骤是至关重​​要的，以确保成功的过程。在分析前质量控制试验测定DNA和报告功能抑制的扩增拷贝数。然而，如果小于400可扩增的DNA的拷贝在PCR富集步骤使用的，有从样本假阴性呼叫与低丰度的突变（ 图6）的风险增加。此外，必须小心文库纯化期间采取防止在洗涤或洗脱步骤的磁珠过度干燥。此外，成功的图书馆量化是高度依赖于文库DNA的精确稀释。为了获得最佳的结果，定量PCR的不同结果的样本库（CQ FAM）相比LQ标准（CQ VIC）应≤3.3Cq的。如果差值大于3.3 CQ，再稀释和样品的测试被推荐。虽然是很好的相关性已经被这个竞争激烈的定量PCR方法和试剂盒的观察，提供使用标准曲线绝对定量中，该库输入到放大步骤相对于其它方法克隆的偏移可能是必要的，以达到最佳的接种密度。

有些癌症标本特别具有挑战性，因为之后的DNA分离的持续抑制剂进行排序。为了之前文库制备识别这些样品中，定量PCR检测QC还包括作为一个内部控制和功能抑制的哨兵外源性模板检测扩增抑制作用。一个例子示于图3，其中黑素瘤DNA试样未能通过度量测序之前的QC抑制再未能产生可测序文库。故障是可能的黑色素污染，一个已知的PCR抑制剂，从FFPE DNA分离步骤中进行过的结果。由该QC检测鉴定样品是在扩增失败的风险可能通过一个额外的清理步长t打捞Ø去除潜在的抑制剂。

靶向21个基因面板着重于基于证据的基因热点和提供具有优化的试剂和对照用于DNA的QC，由预分析"功能性"DNA的定量结果通知NGS和生物信息学软件的完整系统。该方法准确地检测基取代突变和插入缺失从低投入的DNA，并提供了一​​个NGS系统的一个例子的选项扩大面板的内容，以检测附加的变体，例如拷贝数变异和适于靶向RNA测序。

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
2x Quantidex Master Mix	Asuragen	145345
Quant 引物探针混合物	Asuragen	145336
抑制引物探针混合物	Asuragen	145344
ROX	Asuragen	145346
稀释剂	Asuragen	145339
DNA 标准 品 （50）	Asuragen	145340
DNA 标准品 （10）	Asuragen	145341
DNA 标准品 （2）	Asuragen	145342
DNA 标准品 （0.4）	Asuragen	145343
2X 扩增预混	Asuragen	145348
泛癌引物组合	Asuragen	145347
泛癌 FFPE 对照	Asuragen
Pan Cancer Multi-Variant Control	Asuragen	145350
文库纯制备珠	Asuragen	145351
洗涤缓冲液	Asuragen	145352
脱缓冲液	Asuragen	145353
2X LQ 预混液	Asuragen	145358
LQ 稀释剂	Asuragen
LQ 阳性对照	Asuragen	145355
LQ 标准	Asuragen	145356
LQ 引物/探针混合物 （ILMN）	Asuragen	145357
LQ ROX	Asuragen	145359
索引代码 （ILMN） - 集 A， AIL001 - AIL048 （48）	Asuragen	150004
索引代码 （ILMN） - 集 B， AIL049 - AIL096（48）	Asuragen	150005
2x 索引预混液	Asuragen	145361
Read 1 测序引物	Asuragen	150001
索引读取测序引物	Asuragen	150002
读取 2 测序引物	Asuragen	150003
测序稀释剂	Asuragen	145365
Illumina MiSeq	Illumina
MiSeq Reagent Kit v3（600 次循环）	Illumina	MS-102-3003
MiSeq Reagent Nano Kit v2（300 次循环）	Illumina	MS-103-1001
PhiX Control v3	Illumina	FC-110-3001
磁力架-96（或同等设备）	Ambion	AM10027
Quantidex Reporter 软件	Asuragen