本文描述了一种用于肿瘤学样本靶向二代测序的集成系统。该跨平台系统针对质量差、数量少的肿瘤活检样本进行了优化，可兼容低量DNA输入，包含经过充分表征的多变异对照，并采用一种新型变异检出算法，该算法结合了定量的分析前质量控制指标。
本文内容
摘要
摘要
所有新一代测序（NGS）流程均包括在实验台（"湿实验台"）上进行的实验操作以及使用生物信息学流程（"干实验台"）进行的数据分析。这两个环节对于获得准确可靠的结果至关重要，尤其在临床实验室中更为关键。靶向NGS技术在肿瘤学应用中日益受到青睐，有助于推动精准医疗目标的实现，但这些方法通常涉及相互脱节且可变性较大的湿实验台和干实验台工作流程，以及不配套的试剂体系。本报告中，我们以一个21基因 panel 对具有挑战性的癌症样本进行测序为例，介绍一种综合性靶向NGS系统。该系统整合了经过分析验证的单一来源试剂，涵盖功能性DNA定量与质量评估、单管多重PCR富集、文库纯化与标准化，并配备独立的生物信息学分析套件。因此，即使对于质量差、数量少的福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）和细针穿刺抽吸（FNA）肿瘤活检样本，也能实现准确的变异检测。该方法常规可在仅输入400个可扩增DNA拷贝的情况下评估癌症相关变异，并采用模块化设计，便于扩展新的基因内容。两种不同类型、经分析定义的对照提供了质量保证，有助于保障临床相关样本中变异 calling 的准确性。一个灵活的"标签"PCR步骤嵌入了平台特异性的接头和索引编码，支持样本条形码标记，并兼容常见的台式NGS仪器。重要的是，该方案流程简化，可在一天内完成24个测序就绪文库的制备。最后，该方法通过将预分析阶段的样本质量控制结果直接整合到变异 calling 算法中，实现了湿实验台与干实验台流程的衔接，从而提高突变检测的准确性，并区分假阴性和不确定性的 calling 结果。这种靶向NGS方法结合了湿实验技术和软件方面的进步，实现了高深度、多重测序及对异质性癌症样本的高灵敏度分析，适用于诊断应用。
引言
精准医疗依赖于为患者量身定制诊断和治疗方案。个性化治疗的前景直接源于人们对疾病通路的理解不断加深，从而能够将分子诊断与靶向治疗有效关联。例如，2003年至2013年间，分子靶向疗法的使用比例从11%上升至46%1，而维莫非尼（vemurafenib）和克唑替尼（crizotinib）等抗癌药物已获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准，并配有伴随诊断检测。由于下一代测序技术（NGS）能够在高度多重化的样本集中准确富集低丰度的序列目标，该技术已成为评估癌症相关遗传异常并识别精准医疗分子靶点的首选方法。
用于分子检测的最常见实体瘤活检样本包括福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE）和细针穿刺抽吸（FNA）标本。这些样本通常存在核酸含量低和/或质量差的问题，给准确的二代测序（NGS）评估带来挑战2-5。目前用于分析此类标本的商业化NGS方法依赖于多种不同试剂、实验流程和生物信息学工具的组合，而这些工具和流程本身处于持续改进中的动态变化状态。例如，最常用的靶向NGS试剂盒每隔1-2个月就会发生检测化学体系和/或软件的更新6。这种不稳定性反映出在构建和验证统一的NGS系统方面缺乏协调性，尤其是在应对具有挑战性的标本类型（特别是癌症检测）时，给实验室带来了额外负担，要求其自行开发从样本到结果全流程优化的连贯性实验方案。事实上，最近一项针对NGS使用者的调查显示，这些"快速变化"的技术带来了诸多困难，同时用户还要求检测内容具备临床可操作性、拥有成熟的生物信息学专业技术支持、建立稳定且整合的检测流程以实现快速部署，并需要简化的操作流程和标准化的实验方案，以便于在岗培训7。本文介绍了一种全面的靶向NGS系统，旨在弥补上述不足。
所提出的方法整合了从分析前到分析后的全部操作步骤 湿式和干式实验台 以提高临床相关癌症基因位点NGS检测中靶标定量与检测的准确性、灵敏度和可靠性。该方法首先从定量开始 "功能的" DNA4 为评估DNA质量、指导PCR富集步骤的输入量，并防止因检测极低拷贝数模板而产生的假阳性结果，采用单管多重PCR方法，仅需400个可扩增的DNA拷贝即可富集21个癌症基因中的46个位点，随后通过常规台式测序仪引入适用于平台的NGS接头序列。文库通过简单的磁珠纯化程序进行纯化，并使用一种新型的无需校准的qPCR检测方法进行定量。一个独立的生物信息学分析套件结合样本DNA的质量控制结果，以提升变异检出性能，可在NGS后提供序列分析结果。本文展示了采用该系统化方法进行靶向NGS的应用数据，可在低质量、低起始量的肿瘤活检样本（如FFPE和FNA样本）及对照样本中检测出碱基替换突变、插入/缺失（indels）以及拷贝数变异（CNVs）。
方案
注意：本方案描述了使用 MiSeq NGS 系统对样本进行同步处理的过程，但也可适配于 Personal Genome Machine（PGM）仪器。当每个样本的推荐最低 DNA 输入量为 400 个可扩增模板拷贝时，每次 NGS 运行可对 96 个样本实现每个样本至少 3,000x 的中位覆盖深度，使用 PGM 配合 318 芯片处理 24 个样本时可达到相当的覆盖深度。本方法还需使用实时荧光定量 PCR 仪器。
1. DNA 功能性定量与质量控制（QC）
- 解冻试剂：2x主混合液、引物探针混合液、抑制引物探针混合液、6-羧基-X-罗丹明（ROX）、稀释液，以及四种人基因组DNA校准曲线标准品（DNA标准品（50 ng/μL））。µl)，DNA标准品（10 ng/µ升），DNA标准品（2 纳克/微升）µl）和DNA标准品（0.4 ng/µl)) (表 1). 将所有试剂涡旋振荡10秒，并以最大速度离心10秒以收集管内液体。将2x主混合液置于冰上保存。
- 为待测样本的总数准备足量的混合液，并额外增加10%的体积，以避免因移液造成液体不足。在微量离心管中配制混合液，每份样本使用以下体积：5 µl 2x主混合液，0.5 µl 引物探针混合液，0.5 µl 抑制引物探针混合液，0.05 µl ROX 和 2.95 µl 稀释液。涡旋振荡10秒，然后以最大速度离心10秒，以收集管壁液体。
- 加入9 µl 将混合液加入96孔板的各孔中。
- 加入1 µl 对DNA标准品进行重复测定以生成标准曲线。通过上下吹吸5次混匀。
- 使用前确保核酸样本充分混匀。加入1 µl 将样本加入主混合液中，用移液器上下吹打5次混匀。
- 密封培养板，涡旋振荡10秒，并以最大转速离心10秒以收集液体。
- 将反应板放入PCR仪中。根据制造商说明书，为每个样本设置FAM（功能性定量）和VIC（功能性抑制）检测通道。执行PCR循环程序：95℃预变性10分钟， °C，以及40个循环（95℃下15秒） °C，60℃下1分钟 °C）。
- 使用软件程序对每个重复的DNA标准品生成线性回归曲线图，以分析qPCR数据。
- 绘制 Log10 x轴上各DNA标准品的拷贝数与相应的FAM Cq y轴上的数值
- 确认核酸样本的结果是否符合要求 在DNA标准品校准曲线的动态范围内，然后计算未知DNA的浓度 "功能的" 或每份可扩增拷贝数 µl 从参考标准曲线上的相应位置。 图1 显示了通过和未通过的校准曲线示例。
- 通过检测VIC通道中是否存在非人源靶标扩增子来确定每个反应中是否发生扩增。
注意：作为阳性对照，抑制引物探针混合液包含针对非人类外源性目标的特异性引物及其相应的模板。抑制引物探针混合液是主混合液的一个组分，需加入每个反应体系中，包括无模板对照（NTC）。在不存在抑制物的情况下，非人类目标的PCR产物应始终在VIC通道中被检测到。若未检测到扩增信号，则提示可能存在PCR抑制物。 "未检出" Cq VIC通道中样本的信号表明存在PCR抑制物，可能需要在进一步处理前对样本进行后续纯化。
2. 文库构建： 基因特异性（GS）PCR
- 准备足够量的主混合液，以满足待测样本总数的需要，并额外增加10%的体积，以避免因移液造成的液体不足。在微量离心管中配制GS PCR主混合液，每份样本使用以下体积：5 µl 2x 扩增主混合液（表1） 和1 µl 泛癌引物组（表1）。通过上下吹打混匀，涡旋振荡10秒，然后以最高速度离心10秒以收集管壁液体。
- 将6 µl GS PCR主混合液分装至96孔板的各孔中。向各个孔中分别加入4 µl 核酸样本。向其他孔中分别加入4 µl FFPE对照（表1）、4 µl 多变异对照（表1）以及4 µl 无核酸酶水作为操作阴性对照（NTC）。每次加样后，通过上下吹打5次混匀。
- 密封反应板，涡旋振荡10秒，然后以最高速度离心10秒以收集液体。
- 将反应板放入热循环仪中，进行以下PCR循环：95 °C预变性5分钟；2个循环（95 °C变性15秒，60 °C退火4分钟）；23个循环（95 °C变性15秒，72 °C延伸4分钟）；最后在72 °C延伸10分钟。反应结束后置于4 °C保存。
注意：完成步骤2.4后，该反应板将被称为GS PCR板。
3. 文库制备： 标签PCR
- 解冻试剂：2x Index Master Mix（表1）和 Index Codes（表1）。 涡旋振荡10秒，然后以最大速度离心10秒，使内容物沉降至管底。
注意：Index Codes 已预先混合，为每个样本提供一组独特的成对索引（条形码）。 - 在96孔板中，向指定孔加入7.5 µl 2x Index Master Mix 和5.5 µl Index Code，通过上下吹打5次混匀。
- 小心打开GS PCR板，将2 µL GS PCR产物加入含有主混合液的新板中，通过上下吹打5次混匀。对每个样本，记录样本编号（Sample ID）及相应的成对Index Codes。密封板子，涡旋振荡10秒，然后以最大速度离心10秒，使内容物沉降至管底。
- 将板放入热循环仪中，进行PCR扩增：95 °C 5分钟，10个循环（95 °C 30秒，55 °C 30秒，72 °C 1分钟），最后在72 °C延伸10分钟。4 °C保存。
注意：完成步骤3.4后，该板将被称为Tag PCR板。
4. 文库纯化与片段大小筛选
- 从 2-8 °C 环境中取出 Library Pure Prep 磁珠（表 1）和洗脱缓冲液（表 1），室温平衡 30 分钟。向洗涤缓冲液（表 1）容器中加入 9.6 ml 100% 乙醇，盖紧瓶盖后通过反复倒置数次充分混匀。
- 涡旋振荡磁珠 10 秒，然后向 96 孔板的各个孔中分别加入 11 µl 磁珠悬液。
- 打开标签 PCR 板，将 10 µl 标签 PCR 产物加入磁珠中，用移液器吹打混匀 5 次。室温孵育 4 分钟。
- 将 96 孔板置于磁力架（表 1）上静置 4 分钟。保持 96 孔板在磁力架上，用移液器小心吸除并弃去上清液。
- 从磁力架上取下 96 孔板，向每孔中加入 100 µl 含乙醇的洗涤缓冲液，通过上下吹打 5 次混匀。孵育 2 分钟。
- 将 96 孔板放回磁力架上静置 2 分钟，然后用移液器吸除并弃去上清液。
- 重复步骤 4.5，共进行 2 次乙醇洗涤，在第二次洗涤后尽可能彻底去除洗涤液。
- 将 96 孔板置于磁力架上，室温干燥磁珠 2 分钟 ，然后从磁力架上取下 96 孔板。
- 向每孔中加入 20 µl 洗脱缓冲液重悬磁珠，并通过上下吹打 5 次混匀。
- 室温孵育 2 分钟。
- 将 96 孔板再次放回磁力架上静置 4 分钟，小心吸出 18 µl 澄清上清液并转移至新孔。
注意：本步骤可安全暂停，样品可在 -15 至 -30°C 条件下储存。如需继续操作，将冷冻样品置于冰上解冻后再进行后续步骤。
5. 文库定量
- 解冻文库定量（LQ）试剂：2× LQ 预混液、LQ 引物/探针混合液、LQ 标准品、LQ 阳性对照、LQ 稀释液和 LQ ROX表1涡旋振荡10秒，然后以最大速度离心10秒，以收集管内液体。
- 使用纯化的文库产物，在低浓度稀释液（LQ Diluent）中对每个样本进行梯度稀释。
- 加入2 µl （经纯化后的文库产物）至198 µl LQ稀释液，并用移液器上下吹打10次混匀。
- 加入2 µl (1:100 稀释) 至 198 µl LQ稀释液，并用移液器上下吹打混匀10次。
- 为待测样本总数准备足量的LQ预混液，并额外增加10%的体积，以避免因移液操作导致的液体不足。在微量离心管中配制LQ预混液，每份样本使用以下体积：5 µl 2X LQ预混液，2 µl LQ 引物/探针混合液，0.5 µl LQ 标准品和 0.5 µl LQ ROX。用移液器吹打混匀，涡旋振荡10秒，然后以最大速度离心10秒以收集管内液体。
- 加入8 µl 将LQ主混合液加入光学96孔板的一个孔中。
- 在不同的孔中，加入 2 µl 稀释文库，2 µl 低质量阳性对照和2 µl LQ稀释液（NTC）中，通过上下吹吸5次混匀。用光学粘性封膜密封板，涡旋振荡10秒，然后在400 × g离心10秒以收集液体。
- 为每个样本分配FAM和VIC检测器。使用以下循环条件进行PCR扩增：95℃预变性5分钟 °C，以及40个循环（95 °C下15秒） °C，60℃下1分钟 °C)。
- 使用比较 C 法测定每个样本的浓度（nM）q 方法。计算已知低质量标准品（LQ标准品）的Cq VIC）与未知文库（Cq FAM）。稀释样品的浓度（pM）按以下公式计算：
[浓缩文库]nM = 12.5 × 2ΔCq
若使用的稀释倍数不是10,000，需计算目标稀释倍数与10,000的比值，并将该比值乘以步骤5.7中方程的计算结果。
6. 文库标准化与样本混合
- 确定所有待混合样本（每个样本含有独特的成对索引）的中位浓度（nM）。
- 确定单个样本体积（µl) 按以下方法进行均一化混合：将所有样本中位浓度的5倍除以各样本的自身浓度（nM），然后将所得数值四舍五入至最接近的整数。体积数值按四舍五入处理。 <2 µ1 到 2 µ升，和体积 >15 µl 至 15 µ1.
- 加入归一化体积（µl) 将每个样本加入同一支微量离心管中，以制备样本混合液。
- 使用四舍五入的整数值计算每个样本的新浓度，并记录结果。
- 为确定样本池的浓度，计算所有单个样本浓度的总和，并记录所得数值（nM）。
- 使用测序稀释液将样本池稀释至 1.25 nM表 1).
注意：本步骤可安全暂停，样品可保存在 -15 至 -30 ℃ °C. 若要重新开始，需将冷冻样本置于冰上解冻后再进行后续操作。
7. 测序
- 在PhiX Control v3（表1）存在下对样本池进行变性，加入以下组分：15 µl 1.25 nM样本池、3 µl 0.5 nM PhiX和2 µl 1 N NaOH。短暂涡旋后短暂离心，并在室温下孵育5分钟。
- 将变性后的样本池置于冰上。
- 在微量离心管中，将8 µl 变性文库加入992 µl 预冷的HT1-Hyb缓冲液中。短暂涡旋混匀，随后短暂离心以收集管壁液体。保持在冰上。
- 将600 µl 变性并稀释后的文库加入试剂盒的第#17位。
- 解冻Read 1测序引物（表1）、Index Read测序引物（表1）和Read 2测序引物（表1）。在微量离心管中，分别将4 µl 测序引物用636 µl HT1-Hyb缓冲液稀释。注意：HT1-Hyb缓冲液随测序试剂盒提供（表1）。
- 涡旋混匀10秒，然后以最大速度离心10秒以收集管壁液体。将600 µl 稀释后的Read 1测序引物加入测序试剂盒的第#18位，600 µl 稀释后的Index Read引物加入第#19位，600 µl 稀释后的Read 2测序引物加入第#20位。
- 将试剂加载至NGS仪器（表1）并按照制造商说明进行测序。执行双端2 × 150循环测序运行。
8. 数据分析
注意：NGS 仪器软件会将簇图像转换为碱基识别和质量分数，并对成对索引进行解复用，从而为每个样本生成单独的 gzip 压缩 FASTQ (*.fastq.gz) 文件。在分析解复用后的文件之前，读者必须下载并安装配套的生物信息学软件（表 1）。该软件可在普通商用 Windows 电脑上安装，执行数据分析时无需专用计算硬件或互联网连接。
- 双击软件桌面图标。
- 使用软件手册中提供的用户名和密码登录系统。
- 打开项目仪表板，点击“新建项目”。
- 为项目命名，并可选择性填写项目描述。选择目标 NGS 面板类型和 NGS 仪器类型。点击“保存并继续”。
- 上传正向和反向测序数据的压缩 FASTQ 文件。请勿上传“未分配（unassigned）”的 FASTQ 文件，这些文件包含去多重分析失败的测序读段。点击“保存并继续”。
- 输入根据 DNA 功能定量检测（见上述步骤 1）确定的每个文库制备所用的功能性输入拷贝数。可手动输入数值，或从电子表格中复制粘贴数值至注释表格中。点击“保存并继续”。
- 检查已上传用于分析的文库注释信息，点击“提交分析”以启动分析流程。
- 通过项目仪表板监控分析进度。
注意：当结果显示为分析完成状态时，表示结果已可供审查。 - 查看各样本的质量控制指标分析结果，包括每个文库的总覆盖度、通过过滤的读段百分比、扩增子覆盖深度与均一性。结合 dbSNP、COSMIC、1,000 基因组计划及其他功能和群体水平注释来源，审查每个测序文库的变异检出结果。
- 将原始结果导出为汇总的电子表格表格、*.bam 文件和 *.vcf 文件，用于长期存储或使用其他生物信息学工具进行下游分析。
结果
共评估了90个样本（74个独特样本），包括阳性和阴性对照、先前已表征的细胞系以及残留的临床FFPE肿瘤活检样本。这些样本经过可扩增DNA检测后，输入至多重PCR富集流程，连接测序接头，进行条形码标记，并在一台台式NGS仪器中完成单次运行（图2），共获得1910万条过滤后合格的测序读长。等摩尔样本混合后实现了高深度测序（平均3,692x读长）和均匀的覆盖度（97.8%的扩增子覆盖度在中位数读长深度的5倍范围内）。异常样本包括无模板对照、一个具有大片段拷贝数扩增的细胞系DNA，以及一个在分析前质控检测中被标记为存在PCR抑制的FFPE DNA样本（图3）。在三位不同操作者之间，46个扩增子的覆盖均匀性保持稳定（图4A）；对于不同低质量的FFPE DNA样本，覆盖均匀性也得以维持（图4B）。一种由残留临床标本混合配制而成的FFPE肿瘤DNA对照样本，其BRAF V600E突变丰度经数字微滴PCR定量为5%，三位操作者在输入400个可扩增拷贝（即仅含20个突变拷贝）的条件下，检测到目标BRAF突变的丰度分别为3.9%、5.3%和6.5%（图4B及插图表格中的“FFPE3”）。此外，由12种合成DNA模板组成的混合物，每种模板代表一种已知的“驱动”碱基替换突变，在预期的9–17%平均等位基因频率范围内准确检出了相应突变（表2）。对具有拷贝数扩增的细胞系和FFPE DNA样本进行梯度稀释，分别显示出EGFR和KRAS变异的剂量依赖性响应（图5）。重要的是，FFPE DNA的输入量可低至50个可扩增拷贝或1.2 ng总DNA，仍能保持对已知突变的检测能力，且无假阳性检出（图6）。该方法可兼容高达50,000个可扩增拷贝、跨越100倍范围的DNA输入量（表3）。在此项及相关的实验中，22个FFPE样本和20个细针穿刺（FNA）样本的变异检出结果与独立检测方法一致，且在共有的突变位点上覆盖一致（表4）。
通过分析97个样本（包括FFPE、FNA、新鲜冷冻组织和细胞系DNA）以及总共195个测序结果，确定了该检测方法的灵敏度和阳性预测值。结果显示，共有365个真阳性变异检出，4个假阴性结果和1个假阳性结果，灵敏度为98.9%（95% CI：97.1–99.7%），阳性预测值（PPV）为99.7%（95% CI：98.2–99.99%）。对33个样本运行中的两个常见EGFR插入缺失变异（p.E746_A750delELREA和p.V769_D770insASV）进行了分析，结果显示其灵敏度为93.9%（95% CI：78.4–98.9%），PPV为100%（95% CI：86.3–100%），变异检测范围为2.4–84.8%。
图1：符合与不符合质量控制标准的DNA定量标准曲线示例。（A）符合标准的标准曲线。（B）不符合标准的标准曲线。本例中，失败的原因是最低输入量DNA标准品的重复加样所致。请点击此处查看该图的放大版本。
图2：整合了分析前、分析中和分析后工作流程的肿瘤学应用综合性靶向NGS系统的概览。 请点击此处查看此图的放大版本。
图3：在低质量FFPE DNA与完整细胞系DNA及对照样本中，癌症基因靶向NGS的测序覆盖度与均一性。 共90个样本，包括剩余的临床FFPE样本（实心圆）、细胞系样本（空心圆）和合成模板DNA（加号），采用单管21基因多重PCR富集方法进行处理。每个扩增子文库均连接了适用于NGS仪器的接头序列，使用独特的双索引编码进行条形码标记，随后纯化、定量，并归一化至2.5 nM浓度。DNA文库经测序后，由配套的生物信息学软件进行分析。样本偏差包括一组MDA-MB-468细胞系DNA的稀释系列（上方，虚线圆内空心矩形），其携带显著的EGFR拷贝数扩增，导致覆盖均一性下降；另有一个黑色素瘤FFPE样本因DNA提取过程中残留PCR抑制物，未能产生足够数量的有效测序读长。该黑色素瘤样本的失败结果（下方，虚线圆内）已被分析前qPCR DNA质控检测所预测。NTC，无模板对照（x符号）。请点击此处查看该图的放大版本。
图 4：残余临床 FFPE 肿瘤 DNA 中逐扩增子的读长覆盖度、均一性及变异检测。（A）在一个代表性 FFPE DNA 样本中，三个不同操作者测得的所有富集位点的读长覆盖度。操作者 1，Op1（蓝色条形）；操作者 2，Op2（绿色条形）；操作者 3，Op3（黑色条形）。（B）使用三个 FFPE 肿瘤样本评估覆盖度均一性及变异检出结果，其中包括一个已知含有 5% BRAF c.1799T>A 突变的对照混合样本（FFPE3，灰色条形和文字）。FFPE1（蓝色条形和文字），FFPE2（橙色条形和文字）。请点击此处查看该图的放大版本。
图5：在细胞系和FFPE DNA中对拷贝数变异的剂量依赖性检测。 将已知存在EGFR拷贝数扩增的MDA-MB-468细胞系DNA，在正常无突变的参考细胞系DNA背景中逐步稀释，以展示拷贝数变化随稀释程度而降低的趋势。每种细胞系DNA样本的百分比用不同的曲线表示（0、12.5、25、50和100%）。对一个已知存在KRAS扩增的卵巢癌FFPE肿瘤样本进行稀释，使用相同的滴定系列，结果显示相似的趋势，其中最上方两条曲线为100% FFPE DNA的重复样本。 请点击此处查看该图的放大版本。
图6：准确检测和定量低至50个可扩增的FFPE DNA拷贝，或1.2 ng总DNA中的突变。通过基于qPCR的质控检测确定结肠癌FFPE DNA的可扩增拷贝数，并将其稀释至400到25个拷贝范围内，作为测序前多重PCR富集的输入量。生物信息学分析流程在低至50个拷贝（相当于约10个突变模板）时仍能正确识别出两个已知的变异。请点击此处查看该图的放大版本。
| 材料名称/材料 | 公司 | 目录编号 |
| 2x Quantidex Master Mix | Asuragen | 145345 |
| Quant Primer Probe Mix | Asuragen | 145336 |
| Inhibition Primer Probe Mix | Asuragen | 145344 |
| ROX | Asuragen | 145346 |
| Diluent | Asuragen | 145339 |
| DNA Standard (50) | Asuragen | 145340 |
| DNA Standard (10) | Asuragen | 145341 |
| DNA Standard (2) | Asuragen | 145342 |
| DNA Standard (0.4) | Asuragen | 145343 |
| 2x Amplification Master Mix | Asuragen | 145348 |
| Pan Cancer Primer Panel | Asuragen | 145347 |
| Pan Cancer FFPE Control | Asuragen | 145349 |
| Pan Cancer Multi-Variant Control | Asuragen | 145350 |
| Library Pure Prep Beads | Asuragen | 145351 |
| Wash Buffer | Asuragen | 145352 |
| Elution Buffer | Asuragen | 145353 |
| 2x LQ Master Mix | Asuragen | 145358 |
| LQ Diluent | Asuragen | 145354 |
| LQ Positive Control | Asuragen | 145355 |
| LQ Standard | Asuragen | 145356 |
| LQ Primer / Probe Mix (ILMN) | Asuragen | 145357 |
| LQ ROX | Asuragen | 145359 |
| Index Codes (ILMN) - Set A | Asuragen | 150004 |
| AIL001 - AIL048 (48) | ||
| Index Codes (ILMN) - Set B | Asuragen | 150005 |
| AIL049 - AIL096(48) | ||
| 2x Index Master Mix | Asuragen | 145361 |
| Read 1 Sequencing Primers | Asuragen | 150001 |
| Index Read Sequencing Primers | Asuragen | 150002 |
| Read 2 Sequencing Primers | Asuragen | 150003 |
| Sequencing Diluent | Asuragen | 145365 |
| Illumina MiSeq | Illumina | |
| MiSeq Reagent Kit v3 (600-cycle) | Illumina | MS-102-3003 |
| MiSeq Reagent Nano Kit v2 (300-cycle) | Illumina | MS-103-1001 |
| PhiX Control v3 | Illumina | FC-110-3001 |
| Magnetic Stand-96 (或等效设备) | Ambion | AM10027 |
| Quantidex Reporter Software | Asuragen |
表1：试剂与试剂盒。ROX首次使用后，将试剂瓶储存于2-8 °C。请勿再次冷冻。软件可从 www.asuragen.com 下载。
| 基因 | COSMIC 变异 | COSMIC 氨基酸 | % 变异 |
| NRAS | c.182A>G | p.Q61R | 13.3 |
| NRAS | c.35G>A | p.G12D | 15.2 |
| HRAS | c.182A>G | p.Q61R | 17.8 |
| HRAS | c.35G>A | p.G12D | 9.2 |
| KRAS | c.182A>G | p.Q61R | 13.5 |
| KRAS | c.35G>A | p.G12D | 19.1 |
| PIK3CA | c.1633G>A | p.E545K | 9.3 |
| PIK3CA | c.3140A>G | p.H1047R | 9.1 |
| KIT | c.2447A>T | p.D816V | 14.6 |
| EGFR | c.2369C>T | p.T790M | 11.3 |
| EGFR | c.2573T>G | p.L858R | 14.9 |
| BRAF | c.1799T>A | p.V600E | 17.3 |
表2：由12种“驱动”癌症基因变异组成的混合型合成对照品，其丰度为9-17%。 对含有12种不同突变的12种双链合成模板混合物进行测序后评估。所有变异均被准确检出，无假阳性结果。
| 样本编号 | 功能性 cps | 基因 | COSMIC变异 | COSMIC氨基酸 | 变异百分比 | 中位测序深度 | 中位数5倍范围内的百分比 |
| BCPAP | 400 | BRAF | c.1799T>A | p.V600E | 99.5 | 3289 | 96% |
| BCPAP | 10,000 | BRAF | c.1799T>A | p.V600E | 99.7 | 4040 | 98% |
| BCPAP | 25,000 | BRAF | c.1799T>A | p.V600E | 99.4 | 3687 | 96% |
| BCPAP | 50,000 | BRAF | c.1799T>A | p.V600E | 99.7 | 4611 | 93% |
表3：覆盖度与变异检测在不同条件下保持稳定 >DNA投入量的100倍范围。 将400至50,000拷贝的BCPAP细胞系可扩增DNA输入多重PCR富集并进行测序。在该输入范围内，读长深度、覆盖均一性、突变检测能力及突变准确性均得以保持。
表4：22例FFPE和20例FNA肿瘤活检样本中的变异检出结果与独立突变检测结果一致。 一组22个福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）肿瘤DNA样本，其突变状态先前已通过正交靶向高通量测序（NGS）检测确定，将400至2,928个可扩增拷贝数的DNA输入PCR富集步骤，并使用21基因泛癌 panel 进行测序。此外，另一组20个细针穿刺（FNA）DNA样本，先前已通过液相荧光微球阵列突变检测进行表征8 使用156至36,080个可扩增拷贝数作为输入，通过PCR扩增并进行测序。泛癌NGS panel与参考方法之间的所有重叠检测结果均一致。 请点击此处以查看此图的放大版本。
讨论
下一代测序（NGS）技术重新定义了临床环境中对肿瘤活检样本分子谱分析的期望值9。目前已开发出多种靶向NGS检测面板，作为研究技术、实验室自建检测方法以及商业产品和定制化面板，用于分析多种类型的临床样本3,5,10-15。多项研究的报告已证实NGS作为临床工具在检测基因组变异方面的高灵敏度和特异性3,10-12,14。然而，研究也表明，在处理如福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）样本等具有挑战性的癌症活检样本时，可能存在产生假阳性结果的技术假象风险2-5,12,14。此外，近期发表的研究指出，使用肿瘤学样本进行NGS检测时失败率较高16，且在DNA起始量较低的情况下，商业化的靶向NGS面板更易出现假阳性结果12。因此，一些实验室已对现有的商业化靶向NGS技术进行了修改，或增加了额外的质量控制环节，以提升检测性能，通常是为了确保结果准确性或验证生物信息学分析的发现5,10,11。
该21基因检测面板（图2）是为全面的NGS系统设计的靶向内容，用于检测在福尔马林固定石蜡包埋（FFPE）和细针穿刺（FNA）肿瘤活检等难处理样本类型中具有循证依据且可指导临床决策的突变。该工作流程具有多项优势：1）通过提供均一的扩增子覆盖度实现一致性（图3 和图4，表3）；2）通过提供预配制且经过优化的试剂组，并简化生物信息学分析需求，提高操作便捷性；3）通过优化流程、减少移液步骤，相较于其他商业化的NGS方法更高效；4）通过整合DNA质控检测以评估可扩增DNA拷贝数，确保模板多样性达到可接受水平，并避免变异检测中的随机波动，从而提高准确性4。将分析前质控数据与生物信息学分析相结合，使得该方法可接受较低量的FFPE DNA输入。这一目标通过训练决策树算法实现，该算法基于400例FFPE样本中不同功能DNA拷贝数输入，并结合独立的真实值测量结果，最终将该算法整合至生物信息学软件中。因此，推荐输入量为400个可扩增DNA拷贝，通常相当于约~5–20 ng的FFPE DNA，优于其他方法10–12，包括基于杂交富集的方法（后者推荐输入约250 ng FFPE DNA）17,18。尽管本技术以MiSeq平台为例进行描述，但可通过使用带有仪器特异性接头的Tag PCR引物进行调整，从而适用于其他NGS测序平台。
有多个步骤对于确保实验成功至关重要。分析前的质量控制（QC）检测可确定可扩增的DNA拷贝数，并报告是否存在功能抑制。然而，如果在PCR富集步骤中使用的可扩增DNA拷贝数少于400，则来自低丰度突变样本的假阴性结果风险将增加（图6）。此外，在文库纯化过程中必须小心，避免在洗涤或洗脱步骤中磁珠过度干燥。同时，文库的准确定量高度依赖于文库DNA的精确稀释。为获得最佳结果，样本文库的qPCR结果（Cq FAM）与低定量标准品（LQ Standard，Cq VIC）之间的差值应≤3.3 Cq。若差值大于3.3 Cq，建议对样本重新稀释并重新检测。尽管该竞争性qPCR方法与采用标准曲线进行绝对定量的商业试剂盒之间已观察到极好的相关性，但在克隆扩增步骤中，可能需要对文库的上样量进行适当调整，以相对于其他方法达到最佳的接种密度。
某些癌症样本由于在DNA提取后仍存在抑制物，测序尤为困难。为了在文库构建前识别出这些 样本，qPCR质控检测通过加入一种外源性模板，同时作为内参对照和功能抑制的警示信号，从而检测扩增抑制现象。如图3所示，一个黑色素瘤DNA样本在测序前未能通过质控抑制指标检测，并最终未能生成可测序的文库。该失败很可能是由于黑色素污染所致，而黑色素是已知的PCR抑制物，可能从FFPE DNA提取步骤中残留下来。通过质控检测识别出存在扩增失败风险的样本，可通过额外的纯化步骤去除潜在抑制物，从而挽救样本。
该靶向21基因检测面板聚焦于基于证据的基因热点区域，提供了一套完整的系统，包含经过优化的试剂和对照，用于DNA质量控制、高通量测序（NGS）以及生物信息学分析软件，并结合分析前的"功能性"DNA定量结果进行指导。该方法能够从低起始量DNA样本中准确检测碱基替换突变和插入缺失突变，展示了可扩展面板内容的NGS系统示例，可用于检测其他类型的变异（如拷贝数变异CNVs），并可适用于靶向RNA测序。
披露
JH、AH、RZ、BCH 和 GJ 是 Asuragen 公司的雇员，并持有该公司股票。RZ、BCH 和 GJ 是一项专利申请的共同发明人，该专利涉及利用每个样本确定的可扩增拷贝数信息来改进变异检测。
致谢
感谢 Annette Schlageter 博士对本文稿的审阅。本工作部分由德克萨斯州癌症预防与研究所资助，资助编号为 CP120017（项目负责人：GJL）。
材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2x Quantidex 主混合液 | Asuragen | 145345 | |
| 定量引物探针混合液 | Asuragen | 145336 | |
| 抑制引物探针混合液 | Asuragen | 145344 | |
| ROX | Asuragen | 145346 | |
| 稀释液 | Asuragen | 145339 | |
| DNA标准品 (50) | Asuragen | 145340 | |
| DNA标准品 (10) | Asuragen | 145341 | |
| DNA标准品 (2) | Asuragen | 145342 | |
| DNA标准品 (0.4) | Asuragen | 145343 | |
| 2X 扩增主混合液 | Asuragen | 145348 | |
| 泛癌引物组 | Asuragen | 145347 | |
| 泛癌FFPE对照品 | Asuragen | 145349 | |
| 泛癌多变异对照品 | Asuragen | 145350 | |
| 文库纯化磁珠 | Asuragen | 145351 | |
| 洗涤缓冲液 | Asuragen | 145352 | |
| 洗脱缓冲液 | Asuragen | 145353 | |
| 2X LQ 主混合液 | Asuragen | 145358 | |
| LQ 稀释液 | Asuragen | 145354 | |
| LQ 阳性对照 | Asuragen | 145355 | |
| LQ 标准品 | Asuragen | 145356 | |
| LQ 引物/探针混合液 (ILMN) | Asuragen | 145357 | |
| LQ ROX | Asuragen | 145359 | |
| 索引编码 (ILMN) - A组，AIL001 - AIL048 (48) | Asuragen | 150004 | |
| 索引编码 (ILMN) - B组，AIL049 - AIL096 (48) | Asuragen | 150005 | |
| 2x 索引主混合液 | Asuragen | 145361 | |
| 读段1测序引物 | Asuragen | 150001 | |
| 索引读段测序引物 | Asuragen | 150002 | |
| 读段2测序引物 | Asuragen | 150003 | |
| 测序稀释液 | Asuragen | 145365 | |
| Illumina MiSeq | Illumina | ||
| MiSeq 试剂盒 v3 (600循环) | Illumina | MS-102-3003 | |
| MiSeq Nano 试剂盒 v2 (300循环) | Illumina | MS-103-1001 | |
| PhiX 对照 v3 | Illumina | FC-110-3001 | |
| 96孔磁力架（或等效设备） | Ambion | AM10027 | |
| Quantidex 报告软件 | Asuragen |
参考文献
- Medicines in Development for Cancer. , Available from: http://www.phrma.org/sites/default/files/pdf/2014-cancer-report.pdf 1-103 (2014).
- Chen, G., Mosier, S., Gocke, C. D., Lin, M. T., Eshleman, J. R. Cytosine deamination is a major cause of baseline noise in next-generation sequencing. Mol Diagn Ther. 18 (5), 587-593 (2014).
- Choudhary, A., et al. Evaluation of an integrated clinical workflow for targeted next-generation sequencing of low-quality tumor DNA using a 51-gene enrichment panel. BMC Med Genomics. 7, 62(2014).
- Sah, S., et al. Functional DNA quantification guides accurate next-generation sequencing mutation detection in formalin-fixed, paraffin-embedded tumor biopsies. Genome Med. 5 (8), 77(2013).
- Zhang, L., et al. Profiling cancer gene mutations in clinical formalin-fixed, paraffin-embedded colorectal tumor specimens using targeted next-generation sequencing. Oncologist. 19 (4), 336-343 (2014).
- Latham, G. J. Next-generation sequencing of formalin-fixed, paraffin-embedded tumor biopsies: navigating the perils of old and new technology to advance cancer diagnosis. Expert Rev Mol Diagn. 13 (8), 769-772 (2013).
- Crawford, J. M., et al. The business of genomic testing: a survey of early adopters. Genet Med. 16 (12), 954-961 (2014).
- Smith, D. L., et al. A multiplex technology platform for the rapid analysis of clinically actionable genetic alterations and validation for BRAF p.V600E detection in 1549 cytologic and histologic specimens. Arch Pathol Lab Med. 138 (3), 371-378 (2014).
- Thomas, F., Desmedt, C., Aftimos, P., Awada, A. Impact of tumor sequencing on the use of anticancer drugs. Curr Opin Oncol. 26 (3), 347-356 (2014).
- Singh, R. R., et al. Clinical validation of a next-generation sequencing screen for mutational hotspots in 46 cancer-related genes. J Mol Diagn. 15 (5), 607-622 (2013).
- Beadling, C., et al. Combining highly multiplexed PCR with semiconductor-based sequencing for rapid cancer genotyping. J Mol Diagn. 15 (2), 171-176 (2013).
- McCall, C. M., et al. False positives in multiplex PCR-based next-generation sequencing have unique signatures. J Mol Diagn. 16 (5), 541-549 (2014).
- Schleifman, E. B., et al. Next generation MUT-MAP, a high-sensitivity high-throughput microfluidics chip-based mutation analysis panel. PLoS One. 9 (3), e90761(2014).
- Wong, S. Q., et al. Sequence artefacts in a prospective series of formalin-fixed tumours tested for mutations in hotspot regions by massively parallel sequencing. BMC Med Genomics. 7, 23(2014).
- Narayan, A., et al. Ultrasensitive measurement of hotspot mutations in tumor DNA in blood using error-suppressed multiplexed deep sequencing. Cancer Res. 72 (14), 3492-3498 (2012).
- Hagemann, I. S., et al. Clinical next-generation sequencing in patients with non-small cell lung cancer. Cancer. 121 (4), 631-639 (2015).
- Won, H. H., Scott, S. N., Brannon, A. R., Shah, R. H., Berger, M. F. Detecting somatic genetic alterations in tumor specimens by exon capture and massively parallel sequencing. J Vis Exp. (80), e50710(2013).
- Simen, B. B., et al. Validation of a next-generation-sequencing cancer panel for use in the clinical laboratory. Arch Pathol Lab Med. 139 (4), 508-517 (2015).
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