使用多重免疫组织化学染色与多光谱成像定量蛋白质表达及共定位

摘要

免疫组织化学是一种用于评估组织内蛋白质定位和表达的强有力实验技术。目前用于定量的半自动化方法往往引入主观性，并常导致结果不可重复。本文中，我们描述了多重免疫组织化学的方法，以及利用多光谱成像对蛋白质表达和共定位进行客观定量的技术。

摘要

免疫组织化学是一种常用的临床和科研实验室检测技术，用于研究蛋白质在组织中的表达与定位。目前已开发出多种半定量系统，用于对免疫组织化学结果进行评分，但其固有的主观性限制了结果的可重复性和准确性。此外，利用现有的免疫组织化学技术，难以对空间上重叠的生物标志物（如细胞核转录因子）进行研究。我们开发并优化了一种系统，可结合高通量的多重免疫组织化学与多光谱成像技术，实现对多种蛋白质的同步分析。该多重免疫组织化学方法通过依次应用一抗，并使用与辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶偶联的二抗来实现。针对每种目标蛋白，采用不同的发色底物进行检测。染色后的切片被载入自动切片扫描仪，并建立自动图像采集的程序。通过在一系列切片上分别使用单一发色底物染色，建立光谱库。选取部分代表性染色图像导入多光谱成像软件，通过在图像上定义组织区域，建立区分组织类型的算法。利用苏木精复染对亚细胞结构进行分割，并调整内置算法。应用阈值设定以确定阳性信号及蛋白共定位情况。最终的算法将应用于全部组织样本。所得数据使用户能够根据组织类型（例如上皮组织与间质）和亚细胞区域（细胞核、细胞质、质膜）评估蛋白质表达水平。共定位分析可用于研究双阳性、双阴性以及单阳性细胞类型。将多光谱成像技术与多重免疫组织化学及自动图像采集相结合，是一种客观、高通量的组织内生物标志物研究方法。

引言

免疫组织化学（IHC）是一种在组织中检测蛋白质的标准实验技术，目前在科研和诊断病理学中仍被广泛使用。IHC染色结果的评估通常为半定量，这可能在结果解读中引入潜在的偏倚。已有多种半定量方法被开发出来，将染色强度和染色范围结合到最终诊断中^1-4。其他评分系统还包括对染色强度和亚细胞定位进行评分，以更精确地确定蛋白表达位置⁵。为了减少单个观察者偏倚的影响，通常采用多位观察者评分的平均值⁶。尽管如此，分析过程中的主观性仍然存在，尤其是在评估染色范围时尤为明显⁷。因此，实现操作流程的标准化并尽量减少人为因素带来的主观性，对于获得准确且可重复的IHC结果至关重要。

除了免疫组织化学（IHC）外，还有其他方法可用于确定组织中的蛋白质表达。在研究环境中，免疫组织化学传统上被视为检测蛋白质定位的手段⁸，而其他技术如免疫印迹（immunoblotting）则被认为是研究蛋白质表达的金标准。若不结合细胞分馏或激光捕获显微切割等先进技术^9,10，很难确定特定组织或细胞区室的表达情况。在组织切片上使用荧光抗体是一种较为合理的折中方案，但由于NADPH、脂褐素、网状纤维、胶原蛋白和弹性蛋白等引起的背景自发荧光，可能导致准确定量困难¹¹。

自动化的计算病理学平台为更客观地定量病理染色提供了有前景的方....

方案

     注意：本方案描述了组织芯片（TMA）的染色与分析方法，此前已有相关报道^12,17,18。4 µm 厚的 TMA 切片是使用标准切片机从石蜡包埋块中获取的。 

     注意：应为4种显色剂和复染剂建立光谱库，以进行图像定量分析。为此，需对每种抗体分别优化实验方案，并在每张切片上单独使用一种抗体，但省略最后的复染步骤。另需使用苏木精染色第五张切片 ，以获得创建光谱库所需的5张图像。

1. 多重免疫组织化学

1. 将载玻片置于 60 °C 烤箱中烘烤 20 分钟。在化学通风橱中，将载玻片浸入 100% 二甲苯中，更换新鲜二甲苯重复一次。
2. 将载玻片浸入 100% 乙醇中 5 分钟，更换新鲜 100% 乙醇重复一次。再将载玻片浸入 95% 乙醇中 3 分钟，更换新鲜 95% 乙醇重复一次。将载玻片浸入 70% 乙醇中 3 分钟，随后浸入蒸馏水中 3 分钟，更换新鲜蒸馏水重复一次。垂直轻敲载玻片以排干水分。在载玻片上加入 200 µl 即用型内源性过氧化物酶阻断剂，孵育 5 分钟。
3. 排干过氧化物酶阻断剂，将载玻片浸入 45 ml 即用型修复缓冲液（pH 小于 7.0）中。将盛有载玻片的容器放入压力锅中，设定程序为 124 °C 加热 4 分钟。加热结束后，静置压力锅冷却 20 分钟后再打开。
4. 取出修复缓冲液容器，继续冷却 10....

结果

在图1中，使用前列腺组织进行训练，将图像分割为上皮和间质部分，以及非组织区域。通过使用上皮细胞膜标志物E-cadherin，进行了细胞分割，以区分细胞核、细胞质和细胞膜部分，如图2所示。

在一项实验中，我们采用多重免疫组化（IHC）技术检测了AR、ERα、E-钙黏蛋白和CD147的表达与定位情况，如图3所示。利用这些技术，尽管存在显色信号重叠，我们仍能够识别出同时在细胞核中表达ERα和AR的阳性细胞（如图3A中绿色箭头所示，对应图3B–图3C）。我们发现，在不同前列腺疾病状态下，间质细胞中双阳性细胞的比例存在显著差异（图3D）。我们以E-钙黏蛋白作为标记蛋白（图3A中红色箭头所示），对.......

讨论

传统的免疫组织化学方法在评估蛋白质表达时，受限于主观的半定量分析手段^22,23。为此，已开发出先进的平台，用于生物标志物表达及定位的高通量分析。通过对组织和亚细胞区域进行精细的分割，研究人员能够分析生物标志物的表达水平、定位情况以及与其他目标标志物的共定位关系。在先前的研究中，我们已证明免疫组织化学结合多光谱成像技术具有显著优势，尤其是在研究定位于相同细胞区域的蛋白质时^18,20,21。当该技术与组织微阵列结合使用时²⁴，相较于病理学家的手动分析，能够实现更快速、更客观的蛋白质表达定量。

使用免疫组织化学进行蛋白质定量的一个问题是，由于分析的主观性以及技术和试剂的固有差异，导致结果难以重复。采用多光谱成像等平台检测蛋白质表达的一个显著优势在于结果具有良好的可重复性。计算机化病理学平台所得数据与病理学家手工分析高度一致，同时以连续数值形式输出结果，并显著减少工作时间，尤其是在处理大样本量时^12,16,25。研究表明，不同多光谱成像平台之间的结果总体具有高度一致性¹⁴。此外，我.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
二甲苯	Fisher Chemical	X3F1GAL	NFPA 等级：健康 – 2，易燃性 – 3，反应性 – 0
乙醇-200 证明	Fisher Scientific	4355223	NFPA 等级：健康 – 0，易燃性 – 3，反应性 – 0
Tris 碱	Fisher Scientific	BP152-500	NFPA 等级：健康 – 2，易燃性 – 0，反应性 – 0
Tris 羟甲基氨基甲烷盐酸盐	Fisher Scientific	BP153-1	NFPA 等级：健康 – 2，易燃性 – 0，反应性 – 0
Tween 20	Chem-Impex	1512	NFPA 等级：健康 – 0，易燃性 – 1，反应性 – 0
磷酸盐缓冲液	Fisher Scientific	BP2944-100	NFPA 等级：健康 – 1，易燃性 – 0，反应性 – 0
Peroxidazed	Biocare Medical	PX968	避免与皮肤和眼睛接触。可能导致皮肤刺激和眼部损伤。
雌激素受体 α	Thermo Fisher Scientific-Labvision	RM9101	未被归类为危险品
雄激素受体	SCBT	sc-816	未被归类为危险品
CD147	Biodesign	P87535M	未被归类为危险品
E-钙黏蛋白	Dako	M3612	未被归类为危险品
Renoir 红抗体稀释液	Biocare Medical	PD904	专为与基于 Tris 的抗体配合使用而设计
去封闭室	Biocare Medical	Model DC2002	使用时需采取与使用压力锅相同的常规预防措施
屏障笔-Immuno Edge	Vector Labs	H-4000
变性试剂盒-洗脱步骤	Biocare Medical	DNS001H	未被归类为危险品
Mach 2 山羊抗兔 HRP 聚合物	Biocare Medical	RHRP520	未被归类为危险品
Mach 2 山羊抗兔 AP 聚合物	Biocare Medical	RALP525	未被归类为危险品
Mach 2 山羊抗鼠 HRP 聚合物	Biocare Medical	M3M530	未被归类为危险品
Betazoid DAB 显色试剂盒	Biocare Medical	BDB2004	1. DAB 被认为是疑似致癌物。 2. 不要将 DAB 组分暴露于强光或直射阳光下。 3. 佩戴适当的个人防护装备和防护服。 4. DAB 可能引起皮肤致敏。避免与皮肤和眼睛接触。 5. 遵守所有联邦、州和地方关于废弃物处置的环境法规
Warp 红显色试剂盒	Biocare Medical	WR806	具有腐蚀性。为酸性物质，可能导致皮肤刺激或眼部损伤。
Vina 绿显色试剂盒	Biocare Medical	BRR807	吞咽有害
Bajoran 紫显色试剂盒	Biocare Medical	BJP807	易燃液体。远离热源、火焰和火花。经口摄入或吸收有害。避免与皮肤或眼睛接触，避免吸入。
Cat 苏木精	Biocare Medical	CATHE	呈紫色 溶液 ，带有 轻微 的 醋酸 （醋） 气味 。 可能 对  皮肤 或 眼睛 造成 刺激 。 避免 与 皮肤 和 眼睛 接触 。避免摄入。
XYL 封片介质	Richard Allen	8312-4	NFPA 等级：健康 – 2，易燃性 – 3，反应性 – 0
1.5 盖玻片	Fisher Brand	22266858	边缘锋利
孵育（保湿）室	已淘汰	已淘汰	多个供应商可提供
对流烘箱	Stabil- Therm	C-4008-Q
Background Punisher 封闭试剂	Biocare Medical	BP974	本产品未被归类为危险品。
inForm 软件	PerkinElmer	CLS135781	手稿中使用的主要多光谱成像软件
Nuance 软件	PerkinElmer	Nuance EX	用于在手稿中构建光谱库的软件
Vectra 显微镜和切片扫描仪	PerkinElmer	VECTRA	用于获取 IM3 图像立方体的自动化切片扫描仪和显微镜