蛋白表达和共定位使用复用免疫组织化学染色和多光谱成像定量

Summary

免疫组化是一种强大的实验室技术，用于评估组织内的蛋白质定位和表达。目前的半自动定量方法引入了主观性，并且经常会产生不可重现的结果。在此，我们描述了使用多光谱成像进行多重免疫组织化学和蛋白质表达和共定位的客观定量的方法。

Abstract

免疫组化是一种常用的临床和研究实验室检测技术，用于研究组织内的蛋白质表达和定位。已经开发了许多半定量系统来使用免疫组织化学对表达进行评分，但固有的主观性限制了结果的可重复性和准确性。此外，使用当前的免疫组织化学技术很难研究空间重叠的生物标志物，例如核转录因子。我们开发并优化了一个系统，用于使用多重免疫组织化学和多光谱成像的高通量方法同时研究多种蛋白质。多重免疫组织化学是通过依次应用一抗与辣根过氧化物酶或碱性磷酸酶偶联的二抗来进行的。使用不同的色原来检测每种目标蛋白质。将染色的玻片加载到自动玻片扫描仪中，并创建用于自动图像采集的方案。通过对一组载玻片进行染色来创建光谱库，每个载玻片上都有一个色原。将代表性染色图像的子集导入多光谱成像软件，并通过在图像上定义组织隔室来创建区分组织类型的算法。通过使用苏木精复染剂和调整内在算法来分割亚细胞区室。阈值用于确定阳性和蛋白质共定位。然后将最终算法应用于整组组织。所得数据允许用户根据组织类型（例如上皮细胞与基质）和亚细胞区室（细胞核、细胞质与质膜）来评估蛋白质表达。共定位分析允许研究双阳性、双阴性和单阳性细胞类型。将多光谱成像与多重免疫组织化学和自动图像采集相结合是一种客观、高通量的研究组织内生物标志物的方法。

Introduction

免疫组织化学（IHC）是组织中检测蛋白质的标准实验室技术，IHC仍广泛用于研究和诊断病理学。 IHC染色的评价往往是半定量，引入潜在的偏见到结果的解释。许多半定量方法已经开发了包含两个染色强度和染色程度成最终诊断^1-4。其它系统包括，以更好地定位表达⁵得分强度和亚细胞定位。从多个观看者平均分数的掺入通常被用于以最小化单个观察者偏倚⁶的影响。尽管有这些努力，主观性分析仍然存在，评估染色⁷的程度时尤为如此。协议的标准化和减少主观性的人力投入是极为重要的创造准确，重现IHC结果。

内容">还有除了IHC其他选项来确定组织中的表达。在研究设置，免疫组化历来被视为检验蛋白定位⁸的一种手段，而其他技术，如免疫印迹被视为黄金标准调查的表达。确定组织或细胞特异性车厢表达很难不采用先进的技术，如细 ​​胞分馏或激光捕获显微切割^9,10。在组织切片中使用荧光抗体提供了一个合理的妥协，但背景自发荧光由于NADPH，lipofuscins，网状纤维，胶原和弹性蛋白可以作出准确的定量困难^11。

自动计算病理平台是病理染色^12-15的更客观的定量一个有前途的方向。结合组织芯片多光谱成像便于在大样本蛋白表达的高通量分析。用这些技术，蛋白的共定位，染色不均匀性，以及组织和亚细胞定位的分析是可能的，同时基本上降低了两....

Protocol

注:此协议描述了染色和组织芯片（TMA）的分析，先前^12,17,18描述。从使用标准切片石蜡块获得4微米厚的TMA部分。

注:对于4色原和染液谱库应进行图像定量创建。为了做到这一点，对于每个单独的抗体的优化的协议，应每滑动一种抗体，减去最终染液运行。第五幻灯片应该用苏木染色生成创建谱库所需要的5张图像。

1.多重免疫组化

1. 烘烤载玻片在60℃的烘箱中20分钟。使用化学通风橱，浸泡在100％二甲苯滑动。重复二甲苯2的变化。浸泡在100％的乙醇滑动5分钟。用新鲜的100％乙醇重复。
2. 沉浸在95％乙醇的幻灯片3分钟。用新鲜的重复95％的乙醇。沉浸在70％乙醇幻灯片3分钟。浸入蒸馏水幻灯片3分钟。用新鲜蒸馏水重复。点击幻灯片垂直于从幻灯片沥干水分。应用200微升准备使用的内源性过氧化物酶阻断剂5分钟。
3. 从滑漏过氧化物阻断剂和在45ml浸入现成使用检索缓冲液（pH值小于7.0）。在高压锅地方滑动容器并开始程序设定为124℃进行4分钟。允许压力锅冷却20分钟。开幕前。
4. 除去检索缓冲器的容器，并允许冷却另外10分钟。在冲洗蒸馏水滑10分钟。从幻灯片沥干水分，仔细勾画具有疏水屏障笔幻灯片组织。
5. 加入200μl的磷酸缓冲盐水（PBS）.Transfer滑动的与盖（孵育室）含有湿润纱布扁平容器。
6. 通过稀释50米1升的1x Tris缓冲盐水与吐温20（TBST）20倍的Tris l的缓冲含有1％吐....

Results

在图1中 ，训练是在前列腺组织进行图像分割成上皮细胞和基质部，与非组织隔室沿。通过使用上皮细胞膜标记物E-钙粘蛋白，进行小区分割至细胞核，细胞质和膜的部分，在图2所示分开。

在一项实验中，我们使用多路复用IHC研究AR，ERα，E-钙粘蛋白，和CD147的表达和定位， 如图3。使用这些技术，我们能够识别阳性细胞都ERα和核表达AR（ 图3B - 3C）尽管重叠比色信号，如示出在图3A绿色箭头。我们发现在双阳性基质细胞PR的不同状态中的比重显着差异ostate疾病（ 图3D）。我们量化CD147细胞特异膜表达通过使用E-cadherin的一个标志物蛋白（ 图3A红色箭头），以及我们要探讨.......

Discussion

使用用于评估蛋白表达的传统免疫组织化学被分析^22,23的主观的，半定量法的限制。提前平台已经为生物标志物的表达和定位的高通量分析创建。两个组织和亚细胞区室的详细分割允许用户来研究生物标志物表达，定位，和共定位与其他感兴趣的标记。在以前的研究中，我们已经证明IHC和多光谱成像，用于研究定位于相同的细胞隔室^18,20,21的蛋白质尤其是当的效用。当组织芯片结合^24，这些技术允许蛋白表达的更快，更客观的定量所允许的人工分析由病理学家。

与使用免疫组化的蛋白定量的一个问题是结果的不可再现由于subjec分析及技术和试剂的内在差异性略去。使用如多光谱成像的平台，用于测量蛋白表达的显著优点是结果的可重复性。从计算机化病理平台的数据与手动分析由病理学家高度相关，而在连续的格式返回数据，并且基本上减少了工作时间，特别是在大样本时大小^12,16,25。研究在不同的多光谱平台¹⁴之间的结果表明高的整体一致性。此外，我们已经证实了染色结果是高度可重复的，即使在有变异蛋白的数量调查^12。.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
二甲苯	费舍尔化学	X3F1GAL	NFPA评级：健康 – 2， 火 – 3 ， 反应性 – 0
乙醇-200证明	费舍尔科学	4355223	NFPA评级：健康 – 0， 火 – 3 ， 反应性 – 0
Tris Base	Fisher Scientific	BP152-500	NFPA评级：健康 – 2， 火 – 0 ， 反应性 – 0
Tris羟甲基氨基甲烷HCl	Fisher Scientific	BP153-1	NFPA评级：健康– 2，火– 0，反应性– 0
吐温20	-Impex	1512	NFPA评级：健康– 0，火– 1，反应性– 0
盐缓冲盐水	Fisher Scientific	BP2944-100	NFPA 评级：健康 –1， 火 –0 ， 反应性 –0
Peroxidazed	Biocare Medical	PX968	避免与皮肤和眼睛接触。可能引起皮肤刺激和眼睛损伤。
雌激素受体 α	Thermo Fisher Scientific-Labvision	RM9101	未归类为危险
雄激素受体	SCBT	sc-816	未归类为危险
CD147	生物设计	P87535M	未归类为危险
E-cadherin	Dako	M3612	未归类为危险
雷诺阿红Andibody稀释剂	Biocare医用	PD904	专为与 Tris 抗体
配合使用而设计 Decloaking chamber	Biocare Medical	Model DC2002	采取正常预防措施使用压力锅
Barrier pen-Immuno Edge	Vector Labs	H-4000
变性试剂盒-洗脱步骤	Biocare Medical	DNS001H	未归类为危险
赫 2 山羊抗兔 HRP 聚合物	Biocare 医疗	RHRP520	未归类为危险
赫 2 山羊抗兔 AP 聚合物	Biocare 医疗	RALP525	未归类为危险
马赫 2 山羊抗小鼠 HRP 聚合物	Biocare Medical	M3M530	未归类为危险
Betazoid DAB 色原试剂盒	Biocare Medical	BDB2004	1。已知 DAB 是一种可疑的致癌物。 2.请勿将 DAB 组件暴露在强光或阳光直射下。 3.穿戴适当的个人防护装备和衣服。 4.DAB 可能会导致皮肤过敏。避免接触皮肤和眼睛。 5.遵守所有联邦、州和地方有关处置
Warp Red Chromogen Kit	Biocare Medical	WR806	腐蚀性的环境。可能引起皮肤刺激或眼睛损伤的酸。
Vina Green Chromogen Kit	Biocare Medical	BRR807	吞咽有害
Bajoran Purple Chromogen Kit	Biocare Medical	BJP807	易燃液体。远离热源、火焰和火花。摄入或吸收有害。避免与皮肤或眼睛接触，并避免吸入。
猫 Hematoxylin	Biocare Medical	CATHE	紫色  解决方案  和  一个  温和  乙酸  酸  （醋）  气味。 五月  be  刺激性  至  皮肤  或  眼睛。 避免  联系我们  和  皮肤  和  眼睛。 避免  摄入。
XYL 封片剂	Richard Allen	8312-4	NFPA 评级：健康 – 2，火灾 – 3 ，反应性 – 0
1.5 盖玻片	Fisher 品牌	22266858	锐边
培养（湿度）腔室	过时	过时 过时	提供多个供应商
对流烘箱	稳定 - Therm	C-4008-Q
背景惩罚者阻断试剂	Biocare Medical	BP974	此产品未被归类为危险品。
inForm 软件	PerkinElmer	CLS135781	用于手稿的主要多光谱成像软件
Nuance 软件	PerkinElmer	Nuance EX	软件，用于在手稿中创建光谱库
Vectra 显微镜和载玻片扫描仪	PerkinElmer	VECTRA	用于获取 IM3 图像立方体的自动载玻片扫描仪和显微镜