本文介绍了一种使用冻干试剂检测患者样本中贝氏柯克斯体（C. burnetii）的简单环介导等温扩增（LAMP）方法。
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摘要
摘要
Coxiella burnetii 是引起Q热的病原体，是一种专性细胞内寄生细菌。目前已开发出基于PCR的诊断检测方法，用于检测细胞培养物和临床样本中的 C. burnetii DNA。PCR检测需要专用设备以及对最终使用者进行 extensive 培训，因此不适合常规使用，尤其是在资源有限的地区。我们开发了一种环介导等温扩增（LAMP）检测方法，用于检测患者样本中 C. burnetii 的存在。该方法在约60 °C的恒定温度下进行，可使用水浴或加热块完成。该LAMP检测方法的灵敏度与PCR非常相似，检测下限约为每反应25个拷贝。本报告描述了使用冻干试剂配制反应体系，以及通过羟基萘酚蓝（HNB）显色或在反应体系中加入荧光嵌入染料后使用紫外灯观察结果的方法。LAMP试剂经冻干后可在室温（RT）下保存一个月，检测灵敏度未发生下降。该LAMP检测方法具有较强的稳健性，因为反应体系的配制不涉及复杂步骤。该方法特别适用于Q热流行且资源有限的地区使用。
引言
小型革兰氏阴性菌 Coxiella burnetii是Q热的病原体，Q热是一种全球流行的动物源性传染病。由于Q热在全球范围内分布广泛，且C. burnetii具有高传染性，因此派驻海外的美国军事和民事人员在流行地区存在感染风险。
Q热表现为两种形式：急性感染和慢性感染。急性Q热的症状包括流感样表现、肝炎或肺炎，通常为自限性疾病，死亡率较低。慢性Q热虽然较少见，但常导致心内膜炎，若不及时治疗，死亡率显著升高1,2。因此，早期诊断以指导适当治疗对患者管理至关重要。已有针对细胞培养物和临床样本中C. burnetii DNA检测的聚合酶链式反应（PCR）和实时定量PCR（qPCR）检测方法3-5。然而，PCR和qPCR成本较高，且在资源有限地区通常难以常规开展。
环介导等温扩增技术（LAMP）最初由Notomi6描述，是一种替代性的DNA扩增方法。LAMP利用Bst DNA聚合酶进行链置换DNA合成，并结合特异性设计的引物组，这些引物可识别靶基因至少六个独立区域。LAMP最显著的优势在于扩增过程在等温条件下进行，因此仅需水浴锅、加热块或培养箱即可完成。该方法已被用于检测多种立克次体病原体7-9。通过琼脂糖凝胶电泳对扩增后的DNA产物进行可视化分析是最准确的方法，可有效区分因非特异性扩增导致的假阳性结果。然而，凝胶电泳操作在资源有限的地区并不实用。为此，已开发出多种替代方法用于检测反应产物。这些替代方法，例如通过焦磷酸镁沉淀引起的浊度变化10，或使用荧光嵌入染料在紫外光下观察11,12，比进行凝胶电泳更为便捷。LAMP试剂在25 °C和37 °C下储存时稳定性可达一个月，而这些温度正是Q热病流行地区常见的热带和亚热带环境温度13。
我们实验室开发了一种LAMP检测方法，用于检测血浆样本中是否存在C. burnetii14。本文介绍了一种从冻干试剂配制LAMP反应混合液的简单方案。冻干试剂在室温下保存可稳定一个月。结合简便的可视化检测方法，该方法非常适合在资源有限的条件下用于检测C. burnetii。
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方案
1. 准备质粒DNA稀释液作为LAMP反应的标准品
- 使用分光光度计在 260 nm 处测量光密度（O.D.），以确定质粒（含有 C. burnetii RSA 493 的目标基因 IS1111a）DNA 浓度。O.D.260 为 1 时相当于 50 µg/µl 的 DNA。
- 将质粒 DNA 量换算为拷贝数。由于该质粒大小为 6,330 bp，其分子量为 4.1 × 106 g（6,330 bp × 649 g/bp）。质粒的 DNA 浓度为 34.2 ng/µl（根据步骤 1.1 测定结果）。每 1 µl 该 DNA 样品含有 34.2 ng 质粒 DNA，相当于 5 × 109 拷贝（34.2 × 10-9 g / 4.1 × 106 g × 6.02 × 1023）的 DNA。
- 将 10 µl 质粒 DNA（5 × 109 拷贝/µl）加入 90 µl 水中，进行 10 倍稀释，制备成浓度为 5 × 108 拷贝/µl 的 DNA 样品。
- 重复步骤 1.3，制备浓度分别为 5 × 107、5 × 106、5 × 105、5 × 104、5 × 103、5 × 102、5 × 101 和 5 × 100 拷贝/µl 的 DNA 样品。
2. 为 LAMP 反应准备样品的 DNA 模板
- 根据制造商的说明书，使用商用DNA小量提取试剂盒从人血浆样本中提取DNA。提取时使用总共200 µl 样本，并将提取的DNA洗脱于20 µl体积中。
3. 配制 2x LAMP 反应缓冲液
- 取 200 µl 10x Pol 缓冲液、320 µl 5 M 甜菜碱、12 µl 1 M MgSO4、280 µl dNTP 混合液（各 10 mM）和 188 µl 水，配制成 1 ml 的 2x LAMP 缓冲液。涡旋振荡 10 秒以充分混匀。
4. 进行标准 LAMP 反应
- 在0.2 ml PCR管中，加入12.5 µl 2x LAMP缓冲液（按步骤3配制；含40 mM Tris-HCl (pH 8.8)、20 mM KCl、16 mM MgSO4、20 mM (NH4)2SO4、0.2% Triton X-100、1.6 M 甜菜碱、1.4 mM dNTP混合物）、1.2 µl 引物混合物、1 µl Bst DNA聚合酶（8 U/µl）和5.3 µl 水，配制成20 µl反应体系。
- 向20 µl反应体系中加入5 µl DNA（来自步骤1或2），充分混匀。
- 盖紧管盖，在水浴或加热块中于60 °C孵育60分钟。此温度为先前确定的最佳反应温度。
- 加入5 µl 10x凝胶上样缓冲液以终止反应。
- 取5 µl反应产物加入含核酸嵌入染料的2%琼脂糖凝胶中进行电泳。
- 在1x TBE缓冲液中以100 V电压电泳35分钟。
- 通过紫外光观察结果。
5. 使用重组试剂进行LAMP反应
- 取125 µl 10x Pol Buffer、200 µl 5 M 甜菜碱、7.5 µl 1 M MgSO4 和667.5 µl 水，配制成1 ml 重建缓冲液。涡旋振荡10秒以充分混匀。
- 从密封的铝箔袋中取出含有冻干试剂的离心管。若铝箔袋未密封或已破损，请勿使用管内试剂。
- 向每根离心管中加入20 µl 重建缓冲液，以重悬冻干试剂。
- 用移液器反复吹打5次进行混匀。观察确认冻干试剂已完全重悬，管内白色粉末应完全消失。
- 向重悬后的试剂中加入5 µl DNA模板（来自步骤1或2），充分混匀。
- 盖紧管盖，在水浴或加热块中于60 °C孵育60分钟。
- 加入5 µl 10x上样缓冲液以终止反应。
- 取5 µl反应产物，上样至含核酸嵌入染料的2%琼脂糖凝胶。
- 在1x TBE缓冲液中，以100 V电压电泳35分钟。
- 使用紫外光观察结果。
6. 使用含有 HNB 或荧光嵌入染料的重建缓冲液进行 LAMP 反应
- 取125 µl 10x Pol缓冲液、200 µl 5 M三甲基甘氨酸、7.5 µl 1 M MgSO4、7.5 µl 20 mM HNB（或12.5 µl 100x荧光嵌入染料）以及660 µl（或655 µl）水，混合配制成1 ml的重建缓冲液。涡旋振荡10秒以充分混匀。
- 使用第6节中配制的重建缓冲液，重复步骤5.2–5.6。
- 通过肉眼（含HNB的反应）或紫外灯（含荧光嵌入染料的反应）观察结果。
7. 使用管式扫描仪进行实时 LAMP 反应
- 将 5 µl DNA 加入含有荧光嵌入染料的重组试剂中，盖紧管盖后插入管式扫描仪。
- 设置孵育温度为 60 °C，在 60 分钟内于 520 nm 处检测荧光信号。
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结果
0.2 ml 管内的冻干 LAMP 试剂含有 Bst DNA 聚合酶、引物和 dNTPs。使用 20 µl 复溶缓冲液重新溶解冻干试剂。图 1展示了使用新配制试剂和冻干试剂进行 LAMP 反应后在琼脂糖凝胶上的结果。冻干试剂未降低其活性，两种试剂配制的 LAMP 反应均可检测到 25 个拷贝的 DNA 模板。图 2展示了在反应体系中加入 HNB 或荧光嵌入染料后对反应产物的检测结果。在反应中加入 HNB 后，当 DNA 模板拷贝数为 25、50 和 100 时，溶液颜色由紫色变为蓝色。在反应中加入荧光嵌入染料后，当 DNA 模板拷贝数为 25、50 和 100 时，紫外光下可观察到强烈的荧光信号。本研究使用了管式扫描仪进行实时检测，该设备可同时运行 8 个反应。图 3展示了利用管式扫描仪在荧光嵌入染料存在下实时监测荧光信号的变化。当反应中 DNA 模板拷贝数分别为 106、104、103 ...
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讨论
此前，我们开发了一种针对插入元件IS1111a14的高灵敏度和高特异性的LAMP检测方法。IS1111元件被选为靶标，是因为它在不同株系的C. burnetii中高度保守，并且在该细菌中拷贝数较高（7至110个）（Klee 2006）。我们的结果表明，LAMP可检测约25个IS1111元件拷贝，这可能相当于仅一个Coxiella DNA染色体拷贝。在本研究中，Bst DNA聚合酶、LAMP引物和dNTPs被冻干后封装于带封口的铝箔袋中。这些冻干试剂的检测灵敏度仍为25个拷贝，在室温下保存至少一个月时，其性能与新鲜配制的试剂相当。在打开铝箔袋前，必须确保其密封完好。若铝箔袋未密封或已破损，则不得使用管内试剂，因为这可能导致冻干试剂吸潮，从而丧失反应活性。另一个关键步骤是使用重建缓冲液充分重悬冻干试剂。若试剂未完全重悬，LAMP反应将无法正常进行。由于反应缓冲液中盐浓度较高，且甜菜碱（trimethylglycine）溶液黏度较大，这些成分无法与Bst DNA聚合酶、LAMP引物和dNTPs共同...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本研究由海军医学研究中心（Naval Medical Research Center）研究项目编号 6000.RAD1.J.A0310 资助。本文所表达的观点仅为作者观点，并不一定反映美国海军部、国防部或美国政府的官方政策或立场。Wei-Mei Ching 是美国政府雇员，本工作系其履行官方职责期间完成。根据美国《版权法》第17编第105条（Title 17 U.S.C. §105）规定：“美国政府作品不享有本法规定的版权保护。” 第17编第101条（Title 17 U.S.C. §101）将美国政府作品定义为：由美国政府军事人员或雇员在其官方职责范围内完成的作品。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| LAMP 引物 | Eurofins MWG operon | 10 nmol，无盐 | 序列由客户设计 |
| Bst DNA 聚合酶 | New England Biolabs | M0275L | 8 单位/毫升 |
| 10x 热稳定聚合酶缓冲液 | New England Biolabs | B9004S | |
| dNTP 混合物 | New England Biolabs | N0447L | 每种 10 mM |
| 甜菜碱 | Sigma-Aldrich | B0300 | 5 M，三甲基甘氨酸 |
| 硫酸镁 | Sigma-Aldrich | M3409-1ML | 1 M |
| 10x Bluejuice | Invitrogen | 10816-015 | 上样缓冲液 |
| SYBR green | Invitrogen | S7585 | 10,000 倍稀释，用于在试管中观察产物 |
| GelRed | Phenix Research Products | RGB-4103 | 10,000 倍稀释，用于在凝胶中观察产物 |
| 冻干试剂 | Gene Reach | ||
| 羟基萘酚蓝 | Fluka | 33936-10G | |
| ESEQuant 管式扫描仪 | Qiagen | 实时检测 |
参考文献
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