高通量CRISPR载体构建及通过番茄毛状根生成对DNA修饰的表征

摘要

利用DNA组装技术，可在一次克隆反应中并行构建多个CRISPR载体，从而使大量CRISPR载体的构建变得简单。番茄毛状根是验证CRISPR载体和创制突变体材料的优良模型系统。

摘要

利用含有成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/Cas9 技术的载体所介导的靶向DNA突变，已被证明在功能基因组学研究中具有重要应用价值。尽管大多数克隆策略操作简便，但通常需要多个步骤，且构建最终载体往往耗时数天。本文所介绍的方法基于DNA组装技术，可在单次克隆反应中直接生成完全具有功能的CRISPR载体。此外，该方法支持载体构建的混合操作，从而进一步提高实验效率与实用性。通过对该方法进行适当改进，还可用于构建可靶向多个基因的CRISPR载体。随后将CRISPR载体转化至番茄毛状根中，以获得具有特异性DNA修饰的转基因材料。毛状根系统在验证载体功能方面具有显著优势，因其技术操作简便，并易于实现大规模培养。本文所述方法具有广泛的应用前景，可用于构建多种类型的CRISPR载体，并适用于多种植物物种。

引言

利用 CRISPR/Cas9 实现靶向 DNA 修饰的能力在功能基因组学研究中具有巨大潜力。CRISPR/Cas9 系统包含两个组分：来源于 Staphylococcus pyogenes 的 Cas9 核酸酶，以及一段长约 100 个核苷酸的向导 RNA（gRNA）分子，后者可将 Cas9 引导至特定的 DNA 靶位点¹。靶位点的识别由 gRNA 的前约 20 个核苷酸决定，这使得靶向载体能够实现高通量制备^2,3。目前大多数可进行基因工程改造的生物均已应用 CRISPR/Cas9 技术完成改造^4,5。

在植物中，通常使用组成型启动子（如CaMV 35S启动子）来驱动Cas9核酸酶的表达⁶。gRNA则利用RNA聚合酶III的U6或U3启动子进行表达，这些启动子要求gRNA的第一个碱基必须是G（U6启动子）或A（U3启动子），以实现高效转录。然而，也有研究使用不受这些限制的RNA聚合酶II启动子^7,8。

不同的gRNA诱导DNA突变的效率不同，因此在进行全植株转化或建立大规模表型筛选之前，首先验证CRISPR载体的有效性非常重要。通过农杆菌渗入法等方法在植物中瞬时表达CRISPR构建体，通常导致的DNA修饰频率低于稳定转化植株⁶，使得突变检测困难，且此类方法难以用于表型分析。....

方案

1. 向导RNA设计与载体构建

1. 确定目的基因的靶序列。有多种在线 CRISPR 靶点查找程序适用于此步骤^13,14.
   注意：此处我们使用 GN₂₀GG靶向基序，但其他设计可能也适用，具体取决于所用的应用或载体系统。
2. 设计60碱基gRNA寡核苷酸，包含GN₁₉ 由5'和3'端各20个核苷酸序列侧翼包围的目标基序片段，该片段用于DNA组装。最终的60聚体基序为：5'-TCAAGCGAACCAGTAGGCTT-GN₁₉-GTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3'
   注意：标准的脱盐引物即可满足要求。
3. 准备用于组装的四种DNA（图1）。DNA序列详见补充文件。
   1. 消化1 - 5 µg p201N:Cas9¹⁰ 用限制性内切酶处理质粒 光谱在37 °C下，将样品于1× Buffer 4中孵育2小时。按照制造商说明书进行柱纯化。用约15 µl的10 mM Tris-HCl缓冲液重悬，并通过紫外分光光度法定量。
   2. 用限制性内切酶进行第二次消化 斯瓦在25 °C下用1x Buffer 3.1孵育2小时。取100–200 ng样品在0.8%琼脂糖凝胶上电泳，以确认消化完全。
      注意：正确消化的质粒将在14,313 bp处显示....

结果

利用DNA组装进行CRISPR载体构建通常会产生数十至数百个独立克隆。通过PCR进行菌落筛选可轻松鉴定正确克隆，并能区分含有与不含插入片段的质粒（图2A），这在故障排查中具有实用价值。通常情况下，所有克隆均含有插入片段，因此用户可选择完全跳过菌落筛选步骤。诊断性酶切（图2B）和Sanger测序用于质量控制。当出现错误时，通常发生在DNA重叠区域，即MtU6启动子的5'端、gRNA序列或支架序列的3'端。i.e.。若将多个gRNA寡核苷酸混合物加入同一反应体系中，需通过Sanger测序确定具体gRNA序列。各个gRNA的整合分布均匀，大多数gRNA均可从单次转化子中获得（图2C）。建议优先选用高保真DNA组装试剂盒，而非标准DNA组装试剂盒，因为高保真版本的错误率更低（图2C）。

转化后约一至两周可观察.......

讨论

由于DNA组装可用于重组任意重叠的DNA序列，该克隆方法可应用于任何CRISPR载体构建。大多数CRISPR克隆方案使用gRNA的基因合成、IIS型限制性内切酶^17,18或重叠延伸PCR¹⁹。这些技术各自具有固有的优缺点，但通常需要多个手动操作的克隆步骤。本文所介绍克隆方法的主要优势在于整个过程在一个小时内完成，且gRNA寡核苷酸可混合使用，从而进一步简化克隆流程。此外，该DNA组装机制不依赖限制性内切酶，因此该方法几乎适用于任何DNA序列。方便的是，可将不变的DNA组分（线性化载体、MtU6启动子和支架序列）预先配制成主混合液，并于-20 °C保存，用于后续的组装反应。

尽管我们使用 GN₂₀GG gRNA 靶标序列，但也有多种其他可选的 gRNA 靶标序列可供使用¹⁷。已有研究表明，较短的 gRNA 可提高动物细胞中的特异性²⁰。在 gRNA 序列中使用 5' G 与 U6 启动子（或在使用 U3 启动子时使用 A），无论其是否与预期靶序列匹配，均可采用更常见的靶标序列.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
NEBuilder®（HiFi DNA 组装混合物）	新英格兰生物实验室	E5520
p201N:Cas9	Addgene	59175	p201H:Cas9 质粒（59176）也适用于所报道的重叠序列和酶。
pUC gRNA 载体	Addgene	47024
SwaI	新英格兰生物实验室	R0604S
SpeI	新英格兰生物实验室	R0133S
Zymo 清洁与浓缩-5 柱纯化试剂盒	Zymo Research	D4003
NEB Buffer 2.1	新英格兰生物实验室	B7202S
NEB CutSmart（Buffer 4）	新英格兰生物实验室	B7204S
NEB Buffer 3.1	新英格兰生物实验室	B7203S
EconoSpin Mini Spin Column（质粒制备）	Epoch Life Sciences	1910-050/250
EcoRV-HF®	新英格兰生物实验室	R3195S
StyI-HF®	新英格兰生物实验室	R3500S
MS 盐 + Gamborg 维生素	Phytotechnology Laboratories	M404
Phytagel™（结冷胶）	Sigma Aldrich	P8169
GA-7 培养盒	Sigma Aldrich	V8505
Micropore™ 外科胶带	3M	1535-0
Timentin®（羧苄西林/克拉维酸）	多个供应商	0029-6571-26
引物 5' → 3'
SwaI_MtU6F	GATATTAATCTCTTCGATGA AATTTATGCCTATCTTATAT GATCAATGAGG
MtU6R	AAGCCTACTGGTTCGCTTG AAG
ScaffoldF	GTTTTAGAGCTAGAAATAGC AAGTT
SpeI_Scaffold R	GTCATGAATTGTAATACGACTC AAAAAAAAGCACCGACTCGGTG
StUbi3P218R	ACATGCACCTAATTTCACTA GATGT
ISceIR	GTGATCGATTACCCTGTTAT CCCTAG	由于质粒上存在第二个结合位点，不能用于 Sanger 测序
UNS1_Scaffold R	GAGAATGGATGCGAGTAATGAA AAAAAGCACCGACTCGGTG
UNS1_MtU6 F	CATTACTCGCATCCATTCTCAT GCCTATCTTATATGATCAATGAGG
p201R	CGCGCCGAATTCTAGTGATCG
加粗序列表示与线性化 p201N:Cas9 的 20-nt 重叠区域。