高通量CRISPR载体的构建及DNA修饰的表征番茄毛状根的一代

Summary

使用DNA装配，可以并行地构建在单个克隆反应多个CRISPR矢量，使得大量CRISPR的建设矢量a简单的任务。番茄毛状根是一个很好的模型系统来验证CRISPR载体和产生突变体材料。

Abstract

由具有成簇的规则间隔短回文重复序列 （CRISPR）/Cas9 技术的载体产生的靶向 DNA 突变已被证明可用于功能基因组学研究。虽然大多数克隆策略都易于执行，但它们通常使用多个步骤，并且可能需要几天时间才能生成最终构建体。本文介绍的方法基于 DNA 组装，可以在单个克隆反应中产生功能齐全的 CRISPR 载体。载体构建也可以汇集在一起，进一步提高工艺的效率和实用性。该方法的修改用于创建具有多个基因靶标的 CRISPR 载体。然后将 CRISPR 载体转化到番茄毛状根中，以生成具有靶向 DNA 修饰的转基因材料。毛状根是测试载体功能的有用系统，因为它们在技术上易于生成并且适合大规模生产。这里介绍的方法将具有广泛的应用，因为它们可用于生成各种 CRISPR 载体并用于多种植物物种。

Introduction

生成具有针对性的CRISPR DNA修改的能力/ Cas9有功能基因组学研究的巨大潜力。还有CRISPR / Cas9系统的两个组件;的Cas9核酸酶，来自金化脓和指示Cas9到目标DNA的网站^，1的约100-nt的导的RNA（gRNA）分子衍生。目标识别由第一赋予〜了gRNA，其允许高通量生产靶向载体^2,3的20-nt的。可工程改造大多数生物体，已经已经与CRISPR / Cas9技术^4,5。

在植物中，组成型启动子，如CaMV 35S启动子，通常用于驱动Cas9核酸⁶的表达。的gRNAs使用RNA聚合酶III U6或U3启动子限制gRNA的第一基表示到一个G，对于U6，或A为U3，对有效转录。然而RNA聚合酶II舞会oters，这是自由的这些限制，也已经使用^7,8-。

不同gRNAs诱导不同的效率DNA突变，并且因此它可以在整个植物转化的投资或设立广泛的表型屏幕之前先验证CRISPR载体是重要的。 CRISPR的瞬时表达构建体在植物中，通过使用例如农杆菌渗入，通常导致DNA修饰的一个较低的频率相比，稳定的植物^6，使得突变困难和表型分析不切实际用这样的方法进行检测。所谓毛状根是由于能够在几周内产生大量的独立的，稳定转化的材料，而不是个月稳定的植物一个方便的替代系统。 CR....

Protocol

1.指南RNA设计载体的构建

1. 确定感兴趣的基因的靶序列。有多种适于此步骤^13,14在线CRISPR目标调查程序。
   注意:在这里，我们使用GN ₂₀ GG靶基序，但根据所使用的应用或载体系统上的其他设计可能是合适的。
2. 设计60聚体gRNA寡聚包括由5侧翼靶基序'和3'20-nt的序列所必需的DNA组件的GN ₁₉部。最后60聚体基序是:5'-TCAAGCGAACCAGTAGGCTT-GN ₁₉ -GTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3'。
   注:标准，脱盐引物，做工精细。
3. 制备用于装配的四个的DNA（ 图1）。见DNA序列的补充文件。
   1. 消化1 - p201N 5微克:Cas9 ¹⁰质粒用限制酶的Spe我在1×缓冲液4在37℃下2小时。柱净化消化ccording制造商的指示。重悬〜15微升10毫摩尔Tris-HCl中，并通过紫外分光光度法量化。
   2. 执行在25℃的第二与在1×缓冲液3.1限制性酶SWA我消化2小时。检查100 - 200纳克在0.8％琼脂糖凝胶，以确认完全消化。
      注:正常消化质粒将在14313 BP有一个乐队。不需要的酶和去磷酸化的热灭活:音符。消化的质粒可被储存在-20℃。

Results

CRISPR载体的构建与DNA组装通常会产生数十到数百个独立的克隆。通过PCR克隆筛选容易识别正确的克隆，可以带和不带刀片（ 图2A），这是用于故障排除质粒进行区分。通常情况下，所有的克隆包含插件和用户可以选择完全跳过克隆筛选步骤。诊断消化（ 图2B）和Sanger测序被用于质量控制。什么时候发生错误，它们通常在重叠DNA区域观察到的， 即 ，在5'端的MtU6的启动子，所述gRNA，或3'支架序列的末端。如果多个gRNA寡聚汇集成一个单一的反应中，gRNAs由Sanger测序来确定。个别gRNAs掺入均匀分布和大部分gRNAs可以从一个单一的转换（ 图2C中分离图2C）。

变换（ 图3A）后番茄毛根通常观察到一到两周。根≥2长度厘米切下并转移至选择培养基和卡那霉素抗性根可在一周后（

Discussion

由于 DNA 组装用于重组任何重叠的 DNA 序列，因此该克隆方法可应用于任何 CRISPR 载体构建。大多数CRISPR克隆方案使用gRNA的基因合成，IIS型限制性内切酶^17,18或重叠延伸PCR¹⁹。这些技术中的每一种都有固有的优点和缺点，但它们通常需要多个动手克隆步骤。这里介绍的克隆方法的主要优点是整个过程发生在一个一小时的反应中，并且可以合并gRNA寡核苷酸以进一步简化克隆过程。此外，DNA 组装机制独立于限制性内切酶，这使得该方法几乎与任何 DNA 序列兼容。方便的是，可以制作不变 DNA 组分（线性化载体、MtU6 启动子和支架）的预混液并将其储存在 -20 °C 以供以后组装。

虽然我们使用 GN₂₀GG gRNA 靶基序，但可以使用几种替代的 gRNA 靶基序¹⁷。较短的gRNA已被证明可以增加动物细胞的特异性²⁰。通过在gRNA序列中使用具有U6启动子的5'G（或U3启动子中的A），无论它是否与预期的靶序列匹配，都可以使用更丰富的靶基序N_21.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
NEBuilder®（HiFi DNA 组装混合物）	New England Biolabs	E5520
p201N：Cas9	Addgene	59175	p201H：Cas9 质粒 （59176） 也与报道的重叠和酶相容。
pUC gRNA 穿梭	Addgene	47024<
em>SwaI	新英格兰生物实验室	R0604S
SpeI	新英格兰生物实验室	R0133S
Zymo 清洁和浓缩器 5 柱纯化	Zymo Research	D4003
NEB 缓冲液 2.1	新英格兰生物实验室	B7202S
NEB CutSmart（缓冲液 4）	New England Biolabs	B7204S
NEB 缓冲液 3.1	New England Biolabs	B7203S
EconoSpin Mini 离心柱（质粒制备）	Epoch Life Sciences	1910-050/250
EcoRV-HF®	新英格兰生物实验室	R3195S
StyI-HF®	New England Biolabs	R3500S
MS 盐 + Gamborg 维生素	技术实验室	M404
Phytagel™（结冷胶）	Sigma Aldrich	P8169
GA-7 盒子	Sigma Aldrich	V8505
微孔™ 手术胶带	3M	1535-0
Timentin®（Ticarcillin/克拉维酸）	各种	0029-6571-26
引物 5' → 3'SwaI_MtU6F
	GATATTAATCTCTTCGATGA AATTTATGCCTATCTTATAT GATCAATGAGG
MtU6R	AAGCCTACTGGTTCGCTTG AAG
脚手架F	GTTTTAGAGCTAGAAATAGC AAGTT<
em>SpeI_Scaffold R	GTCATGAATTGTAATACGACTC AAAAAAAAGCACCGACTCGGTG
StUbi3P218R	ACATGCACCTAATTTCACTA GATGT
ISceIR	GTGATCGATTACCCTGTTAT CCCTAG	不能用于Sanger测序，因为质粒
UNS1_Scaffold R	GAGAATGGATGCGAGTAATGAA AAAAAGCACCGACTCGGTG
UNS1_MtU6 F	CATTACTCGCATCCATTCTCAT GCCTATCTTATATGATCAATGAGG
p201R	CGCGCCGAATTCTAGTGATCG
粗体序列表示与线性化 p201N：Cas9 的 20-nt 重叠。