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方法文章

高通量CRISPR载体构建及通过番茄毛状根生成对DNA修饰的表征

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DOI：

10.3791/53843

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2016年4月30日

 , 
1Boyce Thompson Institute for Plant Research, 2Section of Plant Pathology & Plant-Microbe Biology, School of Integrative Plant Science, Cornell University

本文内容

摘要

利用DNA组装技术，可在一次克隆反应中并行构建多个CRISPR载体，从而使大量CRISPR载体的构建变得简单。番茄毛状根是验证CRISPR载体和创制突变体材料的优良模型系统。

摘要

利用含有成簇规律间隔短回文重复序列（CRISPR）/Cas9 技术的载体所介导的靶向DNA突变，已被证明在功能基因组学研究中具有重要应用价值。尽管大多数克隆策略操作简便，但通常需要多个步骤，且构建最终载体往往耗时数天。本文所介绍的方法基于DNA组装技术，可在单次克隆反应中直接生成完全具有功能的CRISPR载体。此外，该方法支持载体构建的混合操作，从而进一步提高实验效率与实用性。通过对该方法进行适当改进，还可用于构建可靶向多个基因的CRISPR载体。随后将CRISPR载体转化至番茄毛状根中，以获得具有特异性DNA修饰的转基因材料。毛状根系统在验证载体功能方面具有显著优势，因其技术操作简便，并易于实现大规模培养。本文所述方法具有广泛的应用前景，可用于构建多种类型的CRISPR载体，并适用于多种植物物种。

引言

利用 CRISPR/Cas9 实现靶向 DNA 修饰的能力在功能基因组学研究中具有巨大潜力。CRISPR/Cas9 系统包含两个组分：来源于 Staphylococcus pyogenes 的 Cas9 核酸酶，以及一段长约 100 个核苷酸的向导 RNA（gRNA）分子，后者可将 Cas9 引导至特定的 DNA 靶位点1。靶位点的识别由 gRNA 的前约 20 个核苷酸决定，这使得靶向载体能够实现高通量制备2,3。目前大多数可进行基因工程改造的生物均已应用 CRISPR/Cas9 技术完成改造4,5。

在植物中，通常使用组成型启动子（如CaMV 35S启动子）来驱动Cas9核酸酶的表达6。gRNA则利用RNA聚合酶III的U6或U3启动子进行表达，这些启动子要求gRNA的第一个碱基必须是G（U6启动子）或A（U3启动子），以实现高效转录。然而，也有研究使用不受这些限制的RNA聚合酶II启动子7,8。

不同的gRNA诱导DNA突变的效率不同，因此在进行全植株转化或建立大规模表型筛选之前，首先验证CRISPR载体的有效性非常重要。通过农杆菌渗入法等方法在植物中瞬时表达CRISPR构建体，通常导致的DNA修饰频率低于稳定转化植株6，使得突变检测困难，且此类方法难以用于表型分析。所谓的毛状根则是一种便捷的替代系统，因为可在数周内获得大量独立的稳定转化材料，而稳定植株的获得通常需要数月时间。CRISPR载体在毛状根中诱导DNA突变非常有效9,10。

DNA 组装方法能够高效连接具有重叠末端的 DNA 片段11。某些 DNA 组装方法的一个主要优势是可将单链 DNA（即，寡核苷酸）整合到组装产物中。由于 gRNA 长度仅约 20 个核苷酸，且新的靶点可通过合成寡核苷酸制备，因此这些 DNA 组装方法非常适用于 CRISPR 克隆。本文所述方案基于 p201 系列 CRISPR 载体，该载体已成功应用于大豆10、杨树12以及目前的番茄。所介绍的克隆流程相较于当前的克隆方法10具有多项优势：可在单次克隆反应中于一天内构建出完全功能化的载体。此外，载体构建过程还可进行混合操作，以平行方式同时生成多个 CRISPR 载体，进一步减少操作时间和材料成本。我们还提供了一种用于生成番茄毛状根的实验方案，作为一种高效产生具有靶向基因缺失的转基因材料的方法。毛状根可用于验证 CRISPR 载体的有效性，并为后续实验提供材料。

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方案

1. 向导RNA设计与载体构建

  1. 确定目的基因的靶序列。有多种在线 CRISPR 靶点查找程序适用于此步骤13,14.
    注意：此处我们使用 GN20GG靶向基序，但其他设计可能也适用，具体取决于所用的应用或载体系统。
  2. 设计60碱基gRNA寡核苷酸，包含GN19 由5'和3'端各20个核苷酸序列侧翼包围的目标基序片段，该片段用于DNA组装。最终的60聚体基序为：5'-TCAAGCGAACCAGTAGGCTT-GN19-GTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3'
    注意：标准的脱盐引物即可满足要求。
  3. 准备用于组装的四种DNA（图1）。DNA序列详见补充文件。
    1. 消化1 - 5 µg p201N:Cas910 用限制性内切酶处理质粒 光谱在37 °C下，将样品于1× Buffer 4中孵育2小时。按照制造商说明书进行柱纯化。用约15 µl的10 mM Tris-HCl缓冲液重悬，并通过紫外分光光度法定量。
    2. 用限制性内切酶进行第二次消化 斯瓦在25 °C下用1x Buffer 3.1孵育2小时。取100–200 ng样品在0.8%琼脂糖凝胶上电泳，以确认消化完全。
      注意：正确消化的质粒将在14,313 bp处显示单一条带。注意：无需进行酶的热失活和去磷酸化处理。消化后的质粒可保存于-20 °C。
    3. PCR 扩增 Medicago truncatula (Mt) U6 启动子和来自 pUC gRNA 载体的支架 DNA10 使用引物扩增质粒 斯瓦I_MtU6F / MtU6R 和 ScaffoldF / SpeI_ScaffoldR。使用高保真聚合酶进行PCR扩增，反应条件为：95 °C预变性3 min；31个循环（98 °C变性20 sec，60 °C退火15 sec，72 °C延伸30 sec）；72 °C最终延伸5 min。
      1. 在1%琼脂糖凝胶上电泳检测约3 µl PCR产物，以确认扩增效果。MtU6扩增片段为377 bp，支架序列扩增片段为106 bp。根据制造商说明书对剩余PCR产物进行柱纯化，通过紫外分光光度法定量后，于-20 °C保存。
    4. 将整管gRNA寡核苷酸用实验级水重悬至100 µM。取1 µl 100 µM寡核苷酸加入500 µl 1x Buffer 2.1中，充分混匀。若需混合多个寡核苷酸，将每种100 µM寡核苷酸各取1 µl加入同一管1x Buffer 2.1中。稀释后的寡核苷酸可于-20 °C保存。
  4. 使用带加热盖的PCR仪，设置程序在50 °C下保温。将100 ng（0.011 pmol）线性化载体、50 ng（0.2 pmol）MtU6启动子、12 ng（0.2 pmol）支架序列、1 µl（0.2 pmol）稀释后的gRNA寡核苷酸以及水混合，总体积为5 µl。加入5 µl 2x高保真DNA组装预混液，充分混匀后离心。将反应体系置于50 °C PCR仪中孵育60分钟，随后置于冰上。
    注意：可根据DNA得率较低的情况适当增加反应体系体积。
  5. 转化 2 µl 反应转入感受态细胞 E. coli 使用标准技术处理细胞，并接种于添加50 mg/L抗生素的LB培养基中-1 卡那霉素（Kan50在37 °C下过夜培养已铺板的细胞。将剩余的DNA组装反应产物保存于-20 °C。
  6. 使用引物 StUbi3P218R 和 ISceIR 通过 PCR 进行菌落筛选。将剩余 DNA 组装反应产物的等分试样用 ddH₂O 按 1:5 比例稀释，取 1 µl 使用。 作为菌落筛选的阳性对照，以及1 ng环状p201N:Cas9质粒作为无插入片段的对照。
    1. PCR扩增条件：95 °C 预变性3 min；31个循环（95 °C 变性30 sec，58 °C 退火30 sec，72 °C 延伸30 sec）；最后72 °C 延伸5 min。将PCR产物在1%琼脂糖凝胶上电泳检测。确保含有正确插入片段的样品在725 bp处出现条带，而无插入片段的载体（例如未切割的载体）将出现一条310 bp的条带。
  7. 在LB卡那霉素培养基中培养阳性菌落50 在37 °C下过夜培养液体培养物，并根据制造商说明纯化质粒。使用StUbi3P218R引物对质粒进行Sanger测序，将测序色谱图与MtU6启动子、靶序列和支架序列比对，以确认克隆过程中未引入错误。
  8. 通过使用限制性内切酶消化约 1 µg 质粒进行诊断性酶切 生态右心室和 风格I. 在0.8%琼脂糖凝胶上进行可视化。片段大小（bp）分别为：4192、2001、1743、1544、1381、995、831、702、460、423、318和174。
  9. 使用DNA组装技术构建含多个gRNA的载体。
    1. 构建含有两个gRNA表达盒的载体时，使用引物对第一个位置的gRNA进行PCR扩增 斯瓦I_MtU6F / UNS1_ScaffoldR 以及第二位点gRNA对应的引物UNS1_MtU6F / Spe使用1.1–1.8步构建的各质粒中分别提取的1 ng作为模板，进行I_ScaffoldR扩增。PCR反应条件参照1.3.3步。取约3 µl PCR产物在1%琼脂糖凝胶上电泳检测，以确认扩增效果。扩增片段大小约为500 bp。
    2. 将未纯化的PCR产物各取约等量（通常每种3–4 µl）混合于一个200 µl离心管中。进行连接时，加入1 µl混合后的PCR产物和50 ng的 斯瓦我与 光谱将p201N:Cas9线性化，加入2.5 µl实验室级水和2.5 µl 2x高保真DNA组装预混液，于50 °C恒温循环仪中孵育15分钟。
      注意：DNA 组装说明书建议 2–3 个片段的孵育时间为 15 分钟。
    3. 将1 - 2 µl转化至感受态细胞中 E. coli 细胞并在LB卡那霉素平板上培养50在37 °C下培养接种的细胞过夜。将剩余的反应物保存在-20 °C。
    4. 使用引物 StUbi3P218R 和 ISceIR，按照与步骤 1.6 相同的条件进行菌落 PCR 筛选。正确克隆将产生 1,200 bp 的扩增片段。将阳性菌落接种于 LB 卡那霉素培养基中培养50 过夜培养液体培养物并纯化质粒。
    5. 使用引物 StUbi3P218R（覆盖第一位点 gRNA）和 p201R（覆盖第二位点 gRNA）对质粒进行 Sanger 测序。将测序峰图与 MtU6 启动子、靶序列及支架序列比对。进行诊断性酶切消化， 生态右心室和 风格将产生以下片段（单位：bp）：4192、2476 1743，1544，1381，995，831，702，460，423，318，174。加粗片段包含第二个gRNA。
  10. 在满足所有质量控制要求后，将质粒转化进入 根癌农杆菌 菌株 ARqua115将1 µl质粒加入50 µl电转感受态细胞中，用1 mm比色皿在以下参数下进行电穿孔：2.4 kV、25 µF、200 Ω。加入约500 µl SOC培养基复苏细胞，28 °C振荡培养2小时。涂布于LB卡那霉素平板50 在28 °C下培养2天。使用与步骤1.3.3相同的引物和PCR条件进行菌落筛选。从阳性克隆制备甘油菌保存液。

2. 毛状根转化

  1. 用20%家用次氯酸钠溶液对番茄种子进行15分钟的灭菌处理，并持续搅拌。在超净工作台中去除次氯酸钠溶液，并用无菌实验室级水清洗种子3次。
  2. 将30粒种子接种于含有½ MS培养基（2.22 g L-1 MS盐 + Gamborg维生素，10 g L-1 蔗糖，3 g L-1 胶凝剂，pH 5.8）的GA-7培养盒中。先在黑暗条件下萌发约2天，然后将GA-7培养盒转移至光照条件下，再继续培养幼苗约4天。
  3. 转化前一天，将A. rhizogenes菌株在含Kan50的固体LB培养基上划线接种，并于28 °C过夜培养。
  4. 转化当天，在超净工作台中准备好以下无菌材料：12 ml培养管、50 ml锥形管、½ MS液体培养基（不含胶凝剂）、200 µM乙酰丁香酮、滤纸、培养皿、镊子和手术刀、移液器及枪头。向50 ml ½ MS液体培养基中加入25 µl乙酰丁香酮，并将约6 ml该溶液分装至每根培养管中。
  5. 使用弯头200 µl枪头从平板上刮取A. rhizogenes菌体，并重悬于6 ml ½ MS液体培养基中。涡旋振荡培养管以充分重悬菌体。每种载体对应的菌液重悬后，取1 ml菌液在600 nM固定波长下测定光密度（O.D.），确保O.D.值在0.2至0.4之间；必要时进行稀释或添加菌体。对每种构建体重复此步骤。
  6. 在培养皿中加入约2 ml ½ MS液体培养基和一张无菌滤纸。切取幼苗子叶并放置于湿润滤纸上。待所有子叶收集完毕后，切除子叶远端约1 cm，得到两端均被切割的子叶片段。将外植体加入A. rhizogenes菌液中，混匀后于室温下孵育20分钟，期间偶尔轻轻翻转。
    注：通常每种构建体使用约12个外植体，但最多可在6 ml A. rhizogenes菌液中接种80个外植体。
  7. 在A. rhizogenes孵育期间，为每种待转化的构建体准备一个含有滤纸的培养皿。同时将不含抗生素的½ MS固体培养基置于超净工作台中晾干表面。
  8. 用无菌镊子将子叶从A. rhizogenes菌液中取出，放置于干燥滤纸上。用培养皿盖覆盖以防止组织干燥，直至完成下一轮转化操作。用滤纸轻轻吸干子叶表面液体，然后将其腹面朝上转移至½ MS固体培养基上。用外科胶带封口，在室温黑暗条件下共培养2天。
  9. 共培养结束后，将子叶腹面朝上转移至添加了300 mg L-1 替卡西林/克拉维酸（Tim300，用于抑制残留A. rhizogenes生长）和Kan50（用于植物筛选）的½ MS培养基上，用外科胶带封口。将培养物置于室温下，以16小时光照/8小时黑暗的光周期在荧光灯下培养。
  10. 约1.5至2周后，使用无菌镊子和手术刀切下长度至少为2 cm的根，并转移至½ MS Kan50 Tim300培养基中。每块平板接种10至15条根。用记号笔标记根尖位置，封口后置于培养室中继续培养。
  11. 一周后可在选择性培养基上观察到转化根的生长。选取部分转化根用于DNA提取（采用常规DNA提取方法）。注：含子叶的培养皿可进行2至3次每周采收，之后根系会缠绕成团，难以分离。未采收的根组织可长期维持培养。可对分离的DNA样本进行多种检测，以确定DNA突变频率和类型。以下描述了部分检测结果。

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结果

利用DNA组装进行CRISPR载体构建通常会产生数十至数百个独立克隆。通过PCR进行菌落筛选可轻松鉴定正确克隆，并能区分含有与不含插入片段的质粒（图2A），这在故障排查中具有实用价值。通常情况下，所有克隆均含有插入片段，因此用户可选择完全跳过菌落筛选步骤。诊断性酶切（图2B）和Sanger测序用于质量控制。当出现错误时，通常发生在DNA重叠区域，即MtU6启动子的5'端、gRNA序列或支架序列的3'端。i.e.。若将多个gRNA寡核苷酸混合物加入同一反应体系中，需通过Sanger测序确定具体gRNA序列。各个gRNA的整合分布均匀，大多数gRNA均可从单次转化子中获得（图2C）。建议优先选用高保真DNA组装试剂盒，而非标准DNA组装试剂盒，因为高保真版本的错误率更低（图2C）。

转化后约一至两周可观察...

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讨论

由于DNA组装可用于重组任意重叠的DNA序列，该克隆方法可应用于任何CRISPR载体构建。大多数CRISPR克隆方案使用gRNA的基因合成、IIS型限制性内切酶17,18或重叠延伸PCR19。这些技术各自具有固有的优缺点，但通常需要多个手动操作的克隆步骤。本文所介绍克隆方法的主要优势在于整个过程在一个小时内完成，且gRNA寡核苷酸可混合使用，从而进一步简化克隆流程。此外，该DNA组装机制不依赖限制性内切酶，因此该方法几乎适用于任何DNA序列。方便的是，可将不变的DNA组分（线性化载体、MtU6启动子和支架序列）预先配制成主混合液，并于-20 °C保存，用于后续的组装反应。

尽管我们使用 GN20GG gRNA 靶标序列，但也有多种其他可选的 gRNA 靶标序列可供使用17。已有研究表明，较短的 gRNA 可提高动物细胞中的特异性20。在 gRNA 序列中使用 5' G 与 U6 启动子（或在使用 U3 启动子时使用 A），无论其是否与预期靶序列匹配，均可采用更常见的靶标序列...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本研究由美国国家科学基金会资助（项目编号：IOS-1025642，GBM）。我们感谢Maria Harrison提供了ARqua1菌株。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
NEBuilder®（HiFi DNA 组装混合物）新英格兰生物实验室E5520
p201N:Cas9Addgene59175p201H:Cas9 质粒（59176）也适用于所报道的重叠序列和酶。
pUC gRNA 载体Addgene47024
SwaI新英格兰生物实验室R0604S
SpeI新英格兰生物实验室R0133S
Zymo 清洁与浓缩-5 柱纯化试剂盒Zymo ResearchD4003
NEB Buffer 2.1新英格兰生物实验室B7202S
NEB CutSmart（Buffer 4）新英格兰生物实验室B7204S
NEB Buffer 3.1新英格兰生物实验室B7203S
EconoSpin Mini Spin Column（质粒制备）Epoch Life Sciences1910-050/250
EcoRV-HF®新英格兰生物实验室R3195S
StyI-HF®新英格兰生物实验室R3500S
MS 盐 + Gamborg 维生素Phytotechnology LaboratoriesM404
Phytagel™（结冷胶）Sigma AldrichP8169
GA-7 培养盒Sigma AldrichV8505
Micropore™ 外科胶带3M1535-0
Timentin®（羧苄西林/克拉维酸）多个供应商0029-6571-26
引物 5' → 3'
SwaI_MtU6F GATATTAATCTCTTCGATGA
AATTTATGCCTATCTTATAT
GATCAATGAGG
MtU6R  AAGCCTACTGGTTCGCTTG
AAG
ScaffoldF GTTTTAGAGCTAGAAATAGC
AAGTT
SpeI_Scaffold RGTCATGAATTGTAATACGACTC
AAAAAAAAGCACCGACTCGGTG
StUbi3P218R ACATGCACCTAATTTCACTA
GATGT
ISceIRGTGATCGATTACCCTGTTAT
CCCTAG		由于质粒上存在第二个结合位点，不能用于 Sanger 测序
UNS1_Scaffold R GAGAATGGATGCGAGTAATGAA
AAAAAGCACCGACTCGGTG
UNS1_MtU6 F  CATTACTCGCATCCATTCTCAT
GCCTATCTTATATGATCAATGAGG
p201R CGCGCCGAATTCTAGTGATCG
加粗序列表示与线性化 p201N:Cas9 的 20-nt 重叠区域。

参考文献

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