中性粒细胞是最丰富的白细胞类型。本文介绍了通过密度梯度分离法从人血液中分离中性粒细胞，以及将人早幼粒细胞（HL60）沿粒细胞途径进行分化的方法；用于检测它们在淋巴瘤细胞对抗淋巴瘤药物敏感性中的作用。
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摘要
摘要
中性粒细胞是最丰富的白细胞类型（占40%至75%），也是最早迁移到炎症部位的炎症细胞之一。它们在先天免疫系统中发挥关键作用，并在肿瘤生物学中具有重要功能。研究表明，中性粒细胞可能作为恶性转化、肿瘤进展、血管生成以及抗肿瘤免疫调节的关键介质，其作用机制包括释放可溶性因子或与肿瘤细胞相互作用。为了明确中性粒细胞的特定功能，亟需一种快速且可靠的实验方法 体外 从人血液中分离中性粒细胞。本文演示了一种密度梯度分离法，用于从血液中分离中性粒细胞以及单个核细胞。该方法包括：将密度梯度溶液（如Ficoll）小心地加至来自慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者稀释后的血液上方，随后进行离心，收集单个核细胞层，并利用葡聚糖将中性粒细胞与红细胞分离，再裂解残留的红细胞。该方法可获得纯度≥90%的中性粒细胞。为模拟肿瘤微环境，采用基底膜基质（如Matrigel）进行三维（3D）实验。鉴于中性粒细胞半衰期较短 体外, 无法使用新鲜的人类中性粒细胞进行三维实验。因此，采用二甲基亚砜（DMSO）和维甲酸（RA）作为诱导剂，将早幼粒细胞HL60细胞沿粒细胞途径进行分化。我们实验的目的是研究中性粒细胞对淋巴瘤细胞对抗淋巴瘤药物敏感性的影响。然而，这些方法可推广应用于不同条件下中性粒细胞或类中性粒细胞与多种细胞类型之间相互作用的研究。
引言
固有免疫细胞在肿瘤微环境中的细胞中占有重要比例，并且在癌症患者及动物模型中已被证实与肿瘤恶性程度相关1。近年来，人们越来越认识到慢性免疫反应在促进肿瘤进展、转移以及对化疗产生耐药性方面发挥着关键作用2。巨噬细胞是重要的固有免疫细胞，已被证明可直接调控肿瘤细胞对化疗的反应3,4。然而，中性粒细胞作为固有免疫系统中的关键成员，其在调控肿瘤对抗癌治疗反应中的作用尚不清楚。本实验方案的目标是采用一种快速且可靠的方法，从慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者的血液样本中分离中性粒细胞，并将HL60细胞沿粒细胞途径进行分化，以研究其在调控淋巴瘤细胞对抗淋巴瘤药物敏感性中的作用。
中性粒细胞是血液中先天免疫系统最丰富的细胞成分 5 并作为抵御入侵微生物的第一道防线 6中性粒细胞在启动有效的先天免疫反应中发挥关键作用，并在多种病理条件下具有多样的效应功能。 7因此，需要一种快速且可靠的方法从其他血细胞中分离中性粒细胞，例如密度梯度分离法 体外 研究。采用此方法分离中性粒细胞将有助于进一步研究中性粒细胞介导的免疫功能 体内 和 离体.
获得中性粒细胞纯群是研究免疫系统疾病患者的重要第一步8。密度梯度分离法是一种理想的技术，可获得较高得率的细....
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方案
1. 中性粒细胞的分离及与原代白血病细胞的共培养
注意：所有操作均在里昂医院伦理委员会批准下进行，并已获得所有患者的知情同意。
- 原代白血病细胞与中性粒细胞的分离
- 采集慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者外周血，使用含EDTA的采血管（每毫升血液含1.8 mg EDTA）。
- 将每15 ml血液加入无菌50 ml离心管中，加入15 ml RPMI培养基（1:1稀释），然后小心缓慢地将15 ml密度梯度液沿管壁加入至管底，避免混合各相。确保密度梯度液在制备前处于室温 。
- 在室温下以300 × g离心35分钟，不启用刹车。血液应分为四个清晰的层次，自上而下如图1A所示：血小板与血浆层、单个核细胞层（白色环状层）、密度梯度液层、粒细胞与红细胞层。
- 用塑料巴斯德吸管收集代表原代白血病细胞的白色环状层，转移至新的50 ml离心管中。
- 加入PBS（含钙和镁）至总体积50 ml，于室温下以300 g离心10分钟。
- 将沉淀重悬于5 ml PBS中，再加PBS至总体积50 ml，于室温下以300 g离心10分钟。
- 将沉淀用完全RPMI培养基（RPMI 1640，添加10%胎牛血清（FBS）、2 mM谷氨酰胺、100 U/ml青霉素和100....
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结果
此处所述的密度梯度分离方法可从慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者的血液中分离获得原代白血病细胞和未刺激的中性粒细胞。图1A显示了密度梯度离心后获得的不同血液层（从上到下依次为：血小板和血浆、白色环状层代表单个核细胞、密度梯度液、粒细胞和红细胞）。图1B和1C分别展示了中性粒细胞（多叶核细胞）与单个核细胞在形态学上的差异。
图 1D 显示了原代白血病细胞（单个核细胞）的前向散射（FSC）与侧向散射（SSC）图。使用与 APC 偶联的抗人 CD19 抗体对该细胞群进行标记后，直方图显示完全向右偏移（图 1E），仅出现一个峰，表明该细胞群 CD19 阳性且纯度高。通过使用 表 1 所列的荧光染料偶联单克隆抗体混合物对分离的中性粒细胞进行标记，并经流式细胞术验证，中性粒细胞纯度也 ≥90%。
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讨论
本文介绍一种高效、简单、快速且低成本的方案，通过密度梯度离心法从人血中分离高纯度的中性粒细胞，同时在同一步骤中分离并回收单个核细胞。所获得的细胞群体纯度≥90%。
目前有多种方法可用于从人血中分离中性粒细胞。这些方法包括使用不连续密度梯度的类似技术11,12，或使用商业试剂盒通过正向免疫磁珠分选法分离中性粒细胞，其中中性粒细胞通过特异性抗体（如抗人CD16抗体）进行免疫磁标记，随后CD16阳性细胞在磁性柱上结合而实现中性粒细胞的富集13。也有采用负向免疫磁珠分选的商业试剂盒，其原理是将全血或粒细胞悬液用一组抗体混合物进行标记，这些抗体结合除中性粒细胞以外的其他细胞9（即标记红细胞、血小板以及CD2、CD3、CD9、CD19、CD36、CD56、血型糖蛋白A等非目标细胞的抗体复合物，以及包被葡聚糖的磁性颗粒），随后未与磁性柱结合的抗体阴性细胞组分被洗脱，从而富集中性粒细胞。此外，还可通过荧光激活细胞分选技术分离中性粒细胞14。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由法国国家癌症研究院（INCa-DGOS-4664）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| RPMI 1640 | Gibco Invitrogen | 21875-034 | |
| 胎牛血清（FBS） | Gibco Invitrogen | 10270-106 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS，含钙和镁） | Gibco Invitrogen | 14040-091 | |
| N-乙酰-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺（L-谷氨酰胺） | Life technologies | 25030-024 | |
| 青霉素-链霉素（Pen Strep） | Life technologies | 15140-122 | |
| 布鲁顿酪氨酸激酶（Btk）抑制剂（伊布替尼） | CliniSciences | A3001 | |
| 长春新碱 | EG labo | ||
| BD Matrigel 基底膜基质 | BD Biosciences | 354234 | 实验前一天于 4 oC 过夜（O/N） |
| 红细胞裂解缓冲液 | BD Biosciences | 555899 | |
| Ficoll（Pancoll） | PAN Biotech | P04-60500 | |
| 葡聚糖 | Sigma-Aldrich | D8906 | |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| 维甲酸 | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| 乙二胺四乙酸（EDTA） | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| 氯化钠（NaCl） | Euromedex | S3014 | |
| Annexin V-FLOUS 染色试剂盒 | Roche | 11 988 549 001 | |
| Kit RAL 555 改良吉姆萨染色试剂盒 | Cosmos Biomedical | CB361550-0000 | |
| LSRII 流式细胞仪 | BD Biosciences | ||
| 细胞离心涂片机 | Thermo Scientific | ||
| Leica DMR-XA 显微镜 | Leica Microsystems | ||
| Cellometer Auto T4 细胞活力计数仪 | Nexcelom Bioscience |
参考文献
- Gocheva, V., et al. IL-4 induces cathepsin protease activity in tumor-associated macrophages to promote cancer growth and invasion. Genes Dev. 24, 241-255 (2010).
- Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. Immunity, Inflammation, and Cancer. Cell. ....
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重印与许可
