中性粒细胞是最丰富的白细胞类型。本文介绍了通过密度梯度分离法从人血液中分离中性粒细胞，以及将人早幼粒细胞（HL60）沿粒细胞途径进行分化的方法；用于检测它们在淋巴瘤细胞对抗淋巴瘤药物敏感性中的作用。
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摘要
摘要
中性粒细胞是最丰富的白细胞类型（占40%至75%），也是最早迁移到炎症部位的炎症细胞之一。它们在先天免疫系统中发挥关键作用，并在肿瘤生物学中具有重要功能。研究表明，中性粒细胞可能作为恶性转化、肿瘤进展、血管生成以及抗肿瘤免疫调节的关键介质，其作用机制包括释放可溶性因子或与肿瘤细胞相互作用。为了明确中性粒细胞的特定功能，亟需一种快速且可靠的实验方法 体外 从人血液中分离中性粒细胞。本文演示了一种密度梯度分离法，用于从血液中分离中性粒细胞以及单个核细胞。该方法包括：将密度梯度溶液（如Ficoll）小心地加至来自慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者稀释后的血液上方，随后进行离心，收集单个核细胞层，并利用葡聚糖将中性粒细胞与红细胞分离，再裂解残留的红细胞。该方法可获得纯度≥90%的中性粒细胞。为模拟肿瘤微环境，采用基底膜基质（如Matrigel）进行三维（3D）实验。鉴于中性粒细胞半衰期较短 体外, 无法使用新鲜的人类中性粒细胞进行三维实验。因此，采用二甲基亚砜（DMSO）和维甲酸（RA）作为诱导剂，将早幼粒细胞HL60细胞沿粒细胞途径进行分化。我们实验的目的是研究中性粒细胞对淋巴瘤细胞对抗淋巴瘤药物敏感性的影响。然而，这些方法可推广应用于不同条件下中性粒细胞或类中性粒细胞与多种细胞类型之间相互作用的研究。
引言
固有免疫细胞在肿瘤微环境中的细胞中占有重要比例，并且在癌症患者及动物模型中已被证实与肿瘤恶性程度相关1。近年来，人们越来越认识到慢性免疫反应在促进肿瘤进展、转移以及对化疗产生耐药性方面发挥着关键作用2。巨噬细胞是重要的固有免疫细胞，已被证明可直接调控肿瘤细胞对化疗的反应3,4。然而，中性粒细胞作为固有免疫系统中的关键成员，其在调控肿瘤对抗癌治疗反应中的作用尚不清楚。本实验方案的目标是采用一种快速且可靠的方法，从慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者的血液样本中分离中性粒细胞，并将HL60细胞沿粒细胞途径进行分化，以研究其在调控淋巴瘤细胞对抗淋巴瘤药物敏感性中的作用。
中性粒细胞是血液中先天免疫系统最丰富的细胞成分 5 并作为抵御入侵微生物的第一道防线 6中性粒细胞在启动有效的先天免疫反应中发挥关键作用，并在多种病理条件下具有多样的效应功能。 7因此，需要一种快速且可靠的方法从其他血细胞中分离中性粒细胞，例如密度梯度分离法 体外 研究。采用此方法分离中性粒细胞将有助于进一步研究中性粒细胞介导的免疫功能 体内 和 离体.
获得中性粒细胞纯群是研究免疫系统疾病患者的重要第一步8。密度梯度分离法是一种理想的技术，可获得较高得率的细胞。该方法包括将密度梯度液加入含有稀释人血的离心管底部，随后以300 g离心35分钟，且不启用刹车。单个核细胞层在界面处形成环状，而中性粒细胞则位于其下方。与其他可用方法（如价格昂贵得多的中性粒细胞分离试剂盒）相比，该方法具有显著优势9。此外，使用商业试剂盒通过针对人中性粒细胞特异性表面标志物的抗体分离中性粒细胞，会增加细胞活化或分化的风险。密度梯度分离法可在较短时间内完成中性粒细胞的分离。在同一操作步骤中，单个核细胞也可同时被分离并回收。该技术是一项基础方法，可获得高得率的高纯度细胞，以确保细胞功能的完整性。
为了模拟肿瘤微环境，进行了三维实验。鉴于中性粒细胞的半衰期较短 体外，使用新鲜人中性粒细胞进行的三维实验尚无定论。因此，通常采用二甲基亚砜（DMSO）和维甲酸（RA）作为分化诱导剂，诱导早幼粒细胞（HL60）分化为类中性粒细胞。利用分化后的HL60细胞（HL60差异可避免因从不同供体分离中性粒细胞而导致的反应差异。
体外 3D 培养模型代表了介于体外 2D 模型与体内模型之间的中间阶段。在 2D 培养中，细胞在塑料表面铺展，形成对沉积蛋白的非自然细胞黏附，而这些蛋白在该合成表面上已发生变性。相反，在 3D 培养中，细胞与其自身合成的细胞外基质发生黏附，构成了细胞所天然依附的环境，从而形成自然的细胞-细胞连接。因此，3D 共培养模型，尤其是癌细胞与其他细胞类型的共培养模型，在揭示它们对肿瘤生长、血管生成及转移的贡献方面已显示出重要价值。正因如此，3D 培养使细胞培养更接近体内存在的生理条件10。
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方案
1. 中性粒细胞的分离及与原代白血病细胞的共培养
注意：所有操作均在里昂医院伦理委员会批准下进行，并已获得所有患者的知情同意。
- 原代白血病细胞与中性粒细胞的分离
- 采集慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者外周血，使用含EDTA的采血管（每毫升血液含1.8 mg EDTA）。
- 将每15 ml血液加入无菌50 ml离心管中，加入15 ml RPMI培养基（1:1稀释），然后小心缓慢地将15 ml密度梯度液沿管壁加入至管底，避免混合各相。确保密度梯度液在制备前处于室温 。
- 在室温下以300 × g离心35分钟，不启用刹车。血液应分为四个清晰的层次，自上而下如图1A所示：血小板与血浆层、单个核细胞层（白色环状层）、密度梯度液层、粒细胞与红细胞层。
- 用塑料巴斯德吸管收集代表原代白血病细胞的白色环状层，转移至新的50 ml离心管中。
- 加入PBS（含钙和镁）至总体积50 ml，于室温下以300 g离心10分钟。
- 将沉淀重悬于5 ml PBS中，再加PBS至总体积50 ml，于室温下以300 g离心10分钟。
- 将沉淀用完全RPMI培养基（RPMI 1640，添加10%胎牛血清（FBS）、2 mM谷氨酰胺、100 U/ml青霉素和100 mg/ml链霉素）重悬，使用细胞活力计数仪进行计数。
- 吸除上层液体，保留粒细胞与红细胞层，加入PBS至25 ml，再加入3%右旋糖酐的0.9% NaCl溶液至总体积50 ml。轻轻颠倒混匀10次，于室温静置30分钟，期间不混匀。
- 收集上层红细胞较少的中性粒细胞层，转移至洁净无菌的50 ml离心管中，于室温下以300 g离心10分钟。将每管沉淀重悬于5 ml PBS中，再加入红细胞裂解缓冲液至总体积50 ml。
- 于室温避光孵育15分钟，然后以500 g离心10分钟。用PBS洗涤沉淀（加PBS至总体积50 ml），再以500 g离心10分钟。
- 将沉淀用完全RPMI培养基重悬，使用细胞活力计数仪进行计数。取每种细胞类型各3 × 105个细胞，置于含50 µl PBS-FBS（4%）的5 ml塑料管中，用于通过流式细胞术检测分离纯度。
- 分析分离细胞群体的形态学特征
- 将3 × 104个中性粒细胞和3 × 104个单个核细胞分别重悬于150 µl完全RPMI培养基中。安装载玻片、滤纸卡和样品室至细胞离心涂片机中，确保离心机平衡良好。
- 将每种细胞加入样品室，于室温下以750 × g离心10分钟。取出载玻片、滤纸卡和样品室，小心拆卸，避免损伤载玻片上的细胞。弃去滤纸卡和样品室。
- 使用吉姆萨染色试剂盒对细胞进行染色，室温干燥1小时 。使用显微镜在100倍放大倍数下观察细胞形态。
- 通过流式细胞术检测分离细胞的纯度
- 使用与APC偶联的抗人CD19抗体（5 µl/106个细胞）标记分离的原代白血病细胞。使用表1中列出的抗人抗体混合物（5 µl/106个细胞）标记纯化的中性粒细胞。于4 oC避光孵育30分钟。
- 用500 µl PBS-FBS（4%）洗涤细胞，于室温下以300 g离心5分钟。
- 将每管沉淀重悬于200 µl PBS-FBS（4%）中。
- 使用以下光学配置在流式细胞仪上进行分析：488 nm激光：FSC-A（488 nM）、SSC-A（488/10BP）、FITC（530/30 BP）、PerCP-Cy5.5（695/40 BP）、PE（575/26 BP）；633 nm激光：APC（660/20 BP）、APC-Cy7（780/60 BP）。确保进行荧光补偿校正。
- 原代白血病细胞与自体中性粒细胞的共培养
- 将2 × 105个/ml原代白血病细胞单独或以1:10比例与自体中性粒细胞共同接种于完全RPMI培养基中。具体操作为：通过稀释细胞悬液调整细胞数量，将2 × 105个/ml原代白血病细胞与2 × 106个/ml中性粒细胞混合。轻轻混匀。
- 向细胞中加入25 µM布鲁顿酪氨酸激酶（Btk）抑制剂（伊布替尼）。于37 °C、5% CO2条件下孵育24小时。
- 细胞收获与流式细胞术分析
- 将细胞收集至5 ml塑料管中用于流式细胞术分析，于室温下以300 g离心5分钟。用1 ml PBS-FBS（4%）洗涤沉淀，再以300 g离心5分钟。
- 使用商品化试剂盒将沉淀重悬于Annexin V和PI中，于室温避光孵育10分钟。使用图2A所示的设门策略及以下光学配置在流式细胞仪上进行分析：488 nm激光：FSC-A（488 nM）、SSC-A（488/10BP）、FITC（530/30 BP）、PI（610/20 BP）。确保进行荧光补偿校正。
2. HL60细胞向粒细胞途径的分化及其在三维模型中与RL淋巴瘤B细胞的共培养
- 人早幼粒细胞（HL60）向类中性粒细胞的分化
- 将HL60细胞数量调整至3 × 105 个细胞/mL，加入1 µM全反式维甲酸（RA）和1.25% DMSO以诱导其分化。每孔接种3 × 105 个HL60细胞至48孔板中，于37 °C、5% CO2条件下培养48小时。
- 随后收集细胞，在室温下以300 g离心5分钟。用完全RPMI培养基重悬细胞沉淀，使用细胞活力计数仪进行计数。
- 再将细胞悬液用完全RPMI培养基稀释，调整HL60细胞密度至3 × 105 个细胞/mL，并再次加入1 µM全反式维甲酸（RA）和1.25% DMSO以诱导分化。每孔接种3 × 105 个HL60细胞至48孔板中，于37 °C、5% CO2条件下继续培养48小时。
- HL60细胞分化（HL60diff）分析
- 收集细胞，在室温下以300 g离心5分钟。用完全RPMI培养基重悬细胞沉淀，使用细胞活力计数仪进行计数。
- 通过流式细胞术分析细胞表面标志物表达的变化。分别取3 × 105 个未分化的HL60细胞（来自细胞培养）和3 × 105 个HL60diff细胞，置于5 mL塑料管中用于FACS分析，并在室温下以300 g离心5分钟。
- 用50 µL PBS-FBS（4%）重悬细胞沉淀。加入抗人CD11b-AF700或抗人CD38-APC抗体（5 µL/106 个细胞）进行标记。在4 oC避光孵育30分钟。
- 用500 µL PBS-FBS（4%）洗涤一次，室温下以300 g离心5分钟。再用200 µL PBS-FBS（4%）重悬细胞沉淀。
- 使用图3A所示的设门策略及以下光学配置在流式细胞仪上进行检测：488 nm激光：FSC-A（488 nM），SSC-A（488/10BP）；633 nm激光：APC（660/20 BP），Alexa Fluor 700（730/45 BP）。
- 为检测HL60diff的形态学变化，将细胞固定于载玻片上进行显微镜观察。
- 将3 × 104 个未分化的HL60细胞（来自细胞培养）和3 × 104 个HL60diff细胞分别用150 µL完全RPMI培养基重悬。将载玻片、滤纸片和样品室组装到细胞离心涂片机中，确保离心机平衡。
- 将每种细胞加入样品室，于室温下以1,500 rpm离心10分钟。从离心机中取出载玻片、滤纸片和样品室，小心拆卸，避免损伤载玻片上的细胞。弃去滤纸片和样品室。
- 使用吉姆萨染色试剂盒对细胞进行染色，室温干燥1小时。使用100倍物镜在显微镜下观察细胞形态。
- 三维（3D）培养
注意：确保本实验所用材料保持低温，并在冰上操作。- 使用无菌剪刀将1 mL移液枪头末端剪开，扩大开口至约2–3 mm，用于将5 × 104 个RL细胞（单独或与HL60diff按RL:HL60diff 1:10比例混合）用300 µL基底膜基质重悬。此步骤中应避免产生气泡。
- 每孔加入300 µL细胞悬液至24孔板中。此步骤中应避免产生气泡。将培养板于37 °C、5% CO2条件下孵育30分钟，随后每孔加入1 mL完全RPMI培养基，继续在37 °C、5% CO2条件下培养7天。每隔两天更换一次培养基。在第5天加入10 nM长春新碱。
- FACS分析
- 培养7天后，吸除培养基，每孔用1 mL预冷PBS洗涤两次。每孔加入3 mL预冷PBS-EDTA（5 mM）。用200 µL移液枪头底部轻轻刮擦孔底，使凝胶脱离。将培养板在冰上轻柔振荡30分钟。
- 将细胞悬液转移至无菌15 mL离心管中，在冰上继续轻柔振荡30分钟。检查是否形成均一的细胞悬液。（若未达到均一状态，可延长振荡时间或添加更多PBS-EDTA。）
- 在室温下以300 × g离心10分钟。用PBS洗涤一次，再次在室温下以300 × g离心10分钟。
- 用PBS-FBS（4%）重悬细胞，加入抗人CD19-PE-Cy7和抗人CD38-APC抗体（5 µL/106 个细胞）进行标记。在4 oC避光孵育30分钟。
- 用500 µL PBS-FBS（4%）洗涤一次，在室温下以300 g离心5分钟。使用商品化试剂盒用Annexin V和PI重悬细胞。
- 使用图4A所示的设门策略及以下光学配置在流式细胞仪上进行检测：488 nm激光：FSC-A（488 nM），SSC-A（488/10BP），FITC（530/30 BP），PI（610/20 BP），PE-Cy7（780/60 BP）；633 nm激光：APC（660/20 BP）。确保完成荧光补偿校正。
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结果
此处所述的密度梯度分离方法可从慢性淋巴细胞白血病（CLL）患者的血液中分离获得原代白血病细胞和未刺激的中性粒细胞。图1A显示了密度梯度离心后获得的不同血液层（从上到下依次为：血小板和血浆、白色环状层代表单个核细胞、密度梯度液、粒细胞和红细胞）。图1B和1C分别展示了中性粒细胞（多叶核细胞）与单个核细胞在形态学上的差异。
图 1D 显示了原代白血病细胞（单个核细胞）的前向散射（FSC）与侧向散射（SSC）图。使用与 APC 偶联的抗人 CD19 抗体对该细胞群进行标记后，直方图显示完全向右偏移（图 1E），仅出现一个峰，表明该细胞群 CD19 阳性且纯度高。通过使用 表 1 所列的荧光染料偶联单克隆抗体混合物对分离的中性粒细胞进行标记，并经流式细胞术验证，中性粒细胞纯度也 ≥90%。
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讨论
本文介绍一种高效、简单、快速且低成本的方案，通过密度梯度离心法从人血中分离高纯度的中性粒细胞，同时在同一步骤中分离并回收单个核细胞。所获得的细胞群体纯度≥90%。
目前有多种方法可用于从人血中分离中性粒细胞。这些方法包括使用不连续密度梯度的类似技术11,12，或使用商业试剂盒通过正向免疫磁珠分选法分离中性粒细胞，其中中性粒细胞通过特异性抗体（如抗人CD16抗体）进行免疫磁标记，随后CD16阳性细胞在磁性柱上结合而实现中性粒细胞的富集13。也有采用负向免疫磁珠分选的商业试剂盒，其原理是将全血或粒细胞悬液用一组抗体混合物进行标记，这些抗体结合除中性粒细胞以外的其他细胞9（即标记红细胞、血小板以及CD2、CD3、CD9、CD19、CD36、CD56、血型糖蛋白A等非目标细胞的抗体复合物，以及包被葡聚糖的磁性颗粒），随后未与磁性柱结合的抗体阴性细胞组分被洗脱，从而富集中性粒细胞。此外，还可通过荧光激活细胞分选技术分离中性粒细胞14。
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
本工作由法国国家癌症研究院（INCa-DGOS-4664）资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| RPMI 1640 | Gibco Invitrogen | 21875-034 | |
| 胎牛血清（FBS） | Gibco Invitrogen | 10270-106 | |
| 磷酸盐缓冲液（PBS，含钙和镁） | Gibco Invitrogen | 14040-091 | |
| N-乙酰-L-丙氨酰-L-谷氨酰胺（L-谷氨酰胺） | Life technologies | 25030-024 | |
| 青霉素-链霉素（Pen Strep） | Life technologies | 15140-122 | |
| 布鲁顿酪氨酸激酶（Btk）抑制剂（伊布替尼） | CliniSciences | A3001 | |
| 长春新碱 | EG labo | ||
| BD Matrigel 基底膜基质 | BD Biosciences | 354234 | 实验前一天于 4 oC 过夜（O/N） |
| 红细胞裂解缓冲液 | BD Biosciences | 555899 | |
| Ficoll（Pancoll） | PAN Biotech | P04-60500 | |
| 葡聚糖 | Sigma-Aldrich | D8906 | |
| 二甲基亚砜（DMSO） | Sigma-Aldrich | D8418 | |
| 维甲酸 | Sigma-Aldrich | R2625 | |
| 牛血清白蛋白（BSA） | Sigma-Aldrich | A7906 | |
| 乙二胺四乙酸（EDTA） | Sigma-Aldrich | E5134 | |
| 氯化钠（NaCl） | Euromedex | S3014 | |
| Annexin V-FLOUS 染色试剂盒 | Roche | 11 988 549 001 | |
| Kit RAL 555 改良吉姆萨染色试剂盒 | Cosmos Biomedical | CB361550-0000 | |
| LSRII 流式细胞仪 | BD Biosciences | ||
| 细胞离心涂片机 | Thermo Scientific | ||
| Leica DMR-XA 显微镜 | Leica Microsystems | ||
| Cellometer Auto T4 细胞活力计数仪 | Nexcelom Bioscience |
参考文献
- Gocheva, V., et al. IL-4 induces cathepsin protease activity in tumor-associated macrophages to promote cancer growth and invasion. Genes Dev. 24, 241-255 (2010).
- Grivennikov, S. I., Greten, F. R., Karin, M. Immunity, Inflammation, and Cancer. Cell. 140, 883-899 (2010).
- Mitchem, J. B., et al. Targeting tumor-infiltrating macrophages decreases tumor-initiating cells, relieves immunosuppression, and improves chemotherapeutic responses. Cancer Res. 73, 1128-1141 (2013).
- DeNardo, D. G., et al. Leukocyte Complexity Predicts Breast Cancer Survival and Functionally Regulates Response to Chemotherapy. Cancer Discov. 1, 54-67 (2011).
- Di Carlo, E., et al. The intriguing role of polymorphonuclear neutrophils in antitumor reactions. Blood. 97, 339-345 (2001).
- Kumar, V., Sharma, A. Neutrophils: Cinderella of innate immune system. Int. Immunopharmacol. 10, 1325-1334 (2010).
- Mantovani, A., Cassatella, M. A., Costantini, C., Jaillon, S. Neutrophils in the activation and regulation of innate and adaptive immunity. Nat. Rev. Immunol. 11, 519-531 (2011).
- Kelbaek, H. Sterile isolation of polymorphonuclear leukocytes from large blood volumes. J. Clin. Chem. Clin. Biochem. Z. FürKlin. Chem. Klin. Biochem. 23, 17-20 (1985).
- Aynaud, M. -M., et al. Human Tribbles 3 protects nuclear DNA from cytidine deamination by APOBEC3A. J. Biol. Chem. 287, 39182-39192 (2012).
- Ziòłkowska, K., et al. Long-term three-dimensional cell culture and anticancer drug activity evaluation in a microfluidic chip. Biosens.Bioelectron. 40, 68-74 (2013).
- Eggleton, P., Gargan, R., Fisher, D. Rapid method for the isolation of neutrophils in high yield without the use of dextran or density gradient polymers. J. Immunol. Methods. 121, 105-113 (1989).
- Behnen, M., et al. Immobilized immune complexes induce neutrophil extracellular trap release by human neutrophil granulocytes via FcγRIIIB and Mac-1. J. Immunol. Baltim.Md 1950. 193, 1954-1965 (2014).
- Hirsch, G., Lavoie-Lamoureux, A., Beauchamp, G., Lavoie, J. -P. Neutrophils are not less sensitive than other blood leukocytes to the genomic effects of glucocorticoids. PloS One. 7, 44606(2012).
- Dorward, D. A., et al. Technical advance: autofluorescence-based sorting: rapid and nonperturbing isolation of ultrapure neutrophils to determine cytokine production. J. Leukoc. Biol. 94, 193-202 (2013).
- Swamydas, M., Lionakis, M. S. Isolation, Purification and Labeling of Mouse Bone Marrow Neutrophils for Functional Studies and Adoptive Transfer Experiments. J Vis Exp. , e50586(2013).
- Scaife, H., Woldehiwet, Z., Hart, C. A., Edwards, S. W. Anaplasmaphagocytophilum reduces neutrophil apoptosis in vivo. Infect. Immun. 71, 1995-2001 (2003).
- Maianski, N. A., Maianski, A. N., Kuijpers, T. W., Roos, D. Apoptosis of neutrophils. ActaHaematol. 111, 56-66 (2004).
- Dalton, W. T., et al. HL-60 cell line was derived from a patient with FAB-M2 and not FAB-M3. Blood. 71, 242-247 (1988).
- Hogan, C., Kajita, M., Lawrenson, K., Fujita, Y. Interactions between normal and transformed epithelial cells: Their contributions to tumourigenesis. Int. J. Biochem. Cell Biol. 43, 496-503 (2011).
- Page, H., Flood, P., Reynaud, E. G. Three-dimensional tissue cultures: current trends and beyond. Cell Tissue Res. 352, 123-131 (2013).
- Mantovani, A. Macrophages, Neutrophils, and Cancer: A Double Edged Sword. New J. Sci. , 271940(2014).
- Hanahan, D., Coussens, L. M. Accessories to the crime: functions of cells recruited to the tumor microenvironment. Cancer Cell. 3, 309-322 (2012).
- Shojaei, F., Ferrara, N. Refractoriness to antivascular endothelial growth factor treatment: role of myeloid cells. Cancer Res. 68, 5501-5504 (2008).
- Liang, J., et al. Neutrophils promote the malignant glioma phenotype through S100A4. Clin Cancer Res Off J Am Assoc Cancer Res. 20, 187-198 (2014).
- Teramukai, S., et al. Pretreatment neutrophil count as an independent prognostic factor in advanced non-small-cell lung cancer: an analysis of Japan Multinational Trial Organisation LC00-03. Eur. J. Cancer Oxf.Engl 1990. 45, 1950-1958 (2009).
- Zhu, Q., et al. The IL-6-STAT3 axis mediates a reciprocal crosstalk between cancer-derived mesenchymal stem cells and neutrophils to synergistically prompt gastric cancer progression. Cell Death Dis. 5, 1295(2014).
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