本文展示了一种利用基于毛细管的离心微流控装置制备尺寸可控、单分散性水包油（W/O）微液滴的简单方法。该方法仅需少量样品体积，即可实现高产率制备。我们预计该方法将适用于快速生化分析和细胞分析。
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摘要
摘要
本文展示了一种利用基于毛细管的离心式微流控装置快速制备尺寸可控、单分散水包油（W/O）微液滴的简便方法。近年来，W/O微液滴已被应用于多种强大的技术中，实现了化学实验的微型化。因此，开发一种通用的方法以生成单分散的W/O微液滴具有重要意义。我们开发了一种基于毛细管离心轴对称同轴流动微流控装置生成单分散W/O微液滴的方法。通过调节毛细管孔口，成功实现了对微液滴尺寸的控制。该方法所用设备比其他微流控技术更易于操作，仅需少量样品溶液（0.1–1 µl）即可完成包封，并能以每秒数十万计的速度生成W/O微液滴。我们预期该方法将有助于需要珍贵生物样品的生物学研究，通过节约样品体积，实现快速定量的生化与生物学分析。
引言
水包油（W/O）微液滴1-5在生物化学与生物工程研究中具有多种重要应用，包括蛋白质合成6、蛋白质结晶7、乳液PCR8,9、细胞封装10以及人工类细胞体系的构建5,6。为实现这些应用，制备W/O微液滴时需满足的关键条件是液滴尺寸的可控性与单分散性。目前用于制备单分散、尺寸可控的W/O微液滴11的微流控装置主要基于微通道中的同轴流动法12,13、流动聚焦法14,15和T型 junction 法16。尽管这些方法能够生成高度单分散的W/O微液滴，但其微加工过程需要复杂的操作和专门的微通道制备技术，同时由于注射泵和导液管路中不可避免的存在死体积，需要消耗大量样品溶液（至少数百µl）。因此，亟需一种操作简便且死体积小的单分散W/O微液滴生成方法。
本文结合实验操作视频，介绍了一种基于离心毛细作用的轴对称同轴流动微流控装置17，用于生成细胞尺寸、单一分散的水包油（W/O）微滴（图1）。该方法简单，可实现微滴尺寸的高度均一性和可控性。实验仅需一台台式迷你离心机，以及固定在取样微量管中的毛细管式轴对称同轴流动微流控装置。本方法所需样品体积极小（0.1 µl），且不会浪费任何显著量的样品。
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方案
1. 基于毛细管的微流控装置的制备
- 支架的安装
注意：支架设计见图 2A。- 使用铣床从 2 mm 厚的聚甲醛塑料板上切割出支架的四个圆盘（图 2A(i)-(iv)）。各圆盘尺寸如下：(i) 圆盘 1 直径 8.5 mm，毛细管孔（CH）直径 1.3 mm，螺钉孔（SH）直径 1.8 mm；(ii) 圆盘 2 直径 8.7 mm，CH 直径 2.0 mm，SH 直径 1.8 mm；(iii) 圆盘 3 直径 8.7 mm，CH 直径 0.5 mm，SH 直径 1.8 mm；(iv) 圆盘 4 直径 9.1 mm，CH 直径 1.0 mm，SH 直径 1.8 mm。
- 使用 M2 × 40 螺钉组装支架（图 2B）。支架的底部（图 2B）由 图 2A(i)、(ii) 中的圆盘 1 和圆盘 2 组成，支架的上部（图 2B）由 图 2A(iii)、(iv) 中的圆盘 3 和圆盘 4 组成。
- 构建支架底部时，将螺钉插入圆盘 1 和 2 的三个 SH 中。通过剪去螺纹部分的一段使螺钉变短，保持螺钉长度为 0.9 cm（与支架底部长度相同）。
- 构建支架上部时，将螺钉插入圆盘 3 和 4 的两个 SH 中。通过剪去螺纹部分的一段使螺钉变短，保持螺钉长度为 0.7 cm（与支架上部长度相同）。
- 使用一根长螺钉连接支架的底部和上部以完成组装。
注意：保持支架各部分长度精确：底部为 0.9 cm，上部为 0.7 cm（图 2B）。
- 玻璃毛细管的制备
- 使用两种类型的玻璃毛细管：内层玻璃毛细管（外径（OD）/内径（ID）：1.0/0.6 mm），以及外层玻璃毛细管（OD/ID：2.0/1.12 mm）。
- 使用玻璃切割器将外层玻璃毛细管分成三等份，再使用玻璃切割器将内层玻璃毛细管分成两等份。
- 使用玻璃毛细管拉制仪对每段分割后的内层和外层玻璃毛细管进行尖端拉制（图 3A）。将拉制仪的重量设为最大值。外层玻璃毛细管的加热温度设为 60 度，内层毛细管设为 70 度。小心地完成玻璃毛细管的拉制。
- 保持尖端在玻璃毛细管收缩部分内的长度：内层毛细管为 1.5–1.8 cm，外层毛细管为 0.8–1.0 cm（图 3C）。若该长度短于或长于所述范围，请调整拉制仪的加热温度。
- 使用胶带将内层或外层玻璃毛细管固定在显微操作仪支架上（图 3B）。
- 使用显微操作仪以三步法切断玻璃毛细管的尖端（图 3B）：(i) 将玻璃毛细管尖端接触铂丝上的玻璃珠，(ii) 踩下脚踏开关加热铂丝 1–2 秒，(iii) 1–2 秒后，通过冷却铂丝切断玻璃毛细管尖端。
- 分别调节内层（di）和外层（do）毛细管开口的直径。本实验中，内层玻璃毛细管的开口直径为 5、10 和 20 µm（di= 5,10, 20 µm），外层玻璃毛细管（do）为 60 µm（do= 60 µm）。
注意：玻璃毛细管为一次性使用。需重复制备玻璃毛细管。
- 分别调节内层（di）和外层（do）毛细管开口的直径。本实验中，内层玻璃毛细管的开口直径为 5、10 和 20 µm（di= 5,10, 20 µm），外层玻璃毛细管（do）为 60 µm（do= 60 µm）。
2. 生成水包油微滴的步骤
- 将含有表面活性剂的油填充到外层玻璃毛细管中。本实验中使用的油和表面活性剂混合物为含有2%（w/w）司盘-80（sorbitan monooleate）的十六烷（图4A）。
注意： 油和表面活性剂有多种组合方式（例如，油可以是氟化或碳化的；表面活性剂可以是离子型、非离子型或氟化化学物质）。- 将10 µl含有司盘-80的十六烷引入外层玻璃毛细管中。图4A中，外层玻璃毛细管的孔径（do）为60 µm（do= 60 µm）。如需调节玻璃毛细管的孔径，请返回步骤1.2.4–1.2.5。
- 将外层毛细管安装在支架的底部（图4B）。
- 通过毛细作用将约0.1 µl的水溶液吸入内层玻璃毛细管中（图4C）。图4C中，内层玻璃毛细管的孔径（di）为10 µm（di= 10 µm）。如需调节玻璃毛细管的孔径，请返回步骤1.2.4–1.2.5。
- 将内层毛细管安装在支架的上部（图4D-a），并将内层毛细管插入外层毛细管中（图4D-a）。参照图4D-a中的白色圆点圈，使用数字显微镜观察内层毛细管在外层毛细管内的位置（外层毛细管的内径（w）=130 µm）（图4D-b,c）。内层毛细管在外层毛细管中的位置应设定为w = 100–150 µm。
注意： 若要调整内层毛细管在外层毛细管中的位置，请旋转支架上部的螺丝，从而精确控制距离w。 - 向1.5 ml样品微量离心管底部加入100 µl含有2%（w/w）司盘-80的十六烷。将装有内外毛细管的支架安装到样品微量离心管中（图4E-a）。务必检查外层毛细管的位置，使其远离气-油界面（图4E-b）。
- 使用台式摆出式微型离心机，在1,600 × g的重力条件下离心1–2秒，以生成微滴（图4F）。所有实验均在室温（RT）下进行。
注意： 必须使用摆出式离心机。若使用固定角度转子离心机，微滴可能撞击样品管侧壁并破裂。 - 用移液器缓慢吸取水包油（W/O）微滴，然后将其滴加到载玻片上。
- 使用数字显微镜（放大倍数：200X）拍摄所生成的微滴图像。
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结果
本研究中，我们介绍了一种利用基于毛细管的离心微流控装置生成细胞尺寸的水/油（W/O）微液滴的简单方法（图1）。该微流控装置由毛细管支架（图2B）、两根玻璃毛细管（内层和外层玻璃毛细管，见图3C）以及含有表面活性剂的油相的微量离心管组成。我们将0.1 µl样品溶液注入内层玻璃毛细管中，并将内层毛细管插入外层玻璃毛细管中（图4D）。通过样品溶液射流的Plateau-Rayleigh不稳定性，可生成细胞尺寸的W/O微液滴17（图1B），且这些微液滴至少在2小时内保持稳定17。
由基于毛细管的离心式微流控装置生成的不同尺寸 W/O 微液滴的典型示例如图5所示。图5A-F展示了 W/O...
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讨论
利用该装置，通过射流的 Plateau-Rayleigh 不稳定性生成单分散的水包油（W/O）微液滴17。显微观察未发现卫星液滴的存在。在装置的制备过程中，有三个关键步骤对于成功生成单分散 W/O 微液滴至关重要。首先，为了提供含有表面活性剂的油相和水相溶液的直线流动，四个圆盘的毛细孔必须排列成同心结构。其次，需将内层毛细管小心插入外层毛细管中，因为若毛细管尖端接触上部固定座，极易断裂。该操作可能较为困难，因此建议使用放大镜辅助。最后，为了形成水相溶液的射流流动17，必须将内层毛细管插入外层毛细管的位置调节至w = 100–150 µm。若由离心微流控装置生成的 W/O 微液滴粒径分布不均一，应检查内层毛细管在外层毛细管中的位置。如需调节内层毛细管在外层毛细管中的位置，请旋转固定座上部的螺钉，从而精确控制距离w。
制备单分散的水/油微滴目前存在一些局限性。由于研究中的所有实验均在台式离心机的最大离心转速下进行，因此难以进一步提高离心速率（如有需要）。此外，从多种不同的样品溶液中生成微滴也较为困难，该限制...
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披露
未声明任何利益冲突。
致谢
本工作得到了日本科学技术振兴机构（JST）PRESTO“细胞功能设计与调控”研究领域、日本文部科学省（MEXT）创新科学领域研究资助“分子机器人学”（项目编号 24104002）、日本学术振兴会（JSPS）青年科学家研究资助（A类）（项目编号 24680033）和科学研究资助（B类）（项目编号 26280097），以及东京工业大学生物科学与生物技术学院生物科学与生物技术创意设计课程的支持。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 2毫米厚的聚甲醛塑料板 | 工具 | Nikkyo Technos, Co., Ltd. (日本) | 244-6432-08 |
| 铣床 | 工具 | Roland DG Co., Ltd. (日本) | MDX-40A |
| 端铣刀 RSE230-0.5*2.5 | 工具 | NS Tool Co., Ltd. (日本) | 01-00644-00501 |
| M2*40 螺丝 | 工具 | Jujo Synthetic Chemistry Labo. (日本) | 0001-024 |
| 玻璃毛细管拉制仪 | 工具 | Narishige (日本) | PC-10 |
| 显微操作仪 | 工具 | Narishige (日本) | MF-900 |
| 内层玻璃毛细管 | 工具 | Narishige (日本) | G-1 |
| 外层玻璃毛细管 | 工具 | World Precision Instruments Inc. (美国) | 1B200-6 |
| 1.5 ml 样品管 | 工具 | INA OPTIKA CO.,LTD (日本) | ST-0150F |
| 十六烷 | 试剂 | Wako Pure Chemical Industries Ltd. (日本) | 080-03685 |
| 单油酸山梨醇酯（Span 80） | 试剂 | Tokyo Chemical Industry Co., Ltd. (日本) | S0060 |
| Milli Q 系统 | 试剂 | Merck Millipore Corporation (德国) | ZRQSVP030 |
| 摆出式小型离心机 | 工具 | Hitech Co., Ltd. (日本) | ATT101 |
| 数字显微镜 | 工具 | KEYENCE Corporation (日本) | VHX-2001 |
参考文献
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