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方法文章

通过 in ovo 微电穿孔法将基因导入鸡听觉器官

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DOI：

10.3791/53864

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2016年4月17日

 , 
1The Solomon H. Snyder Department of Neuroscience, The Center for Sensory Biology, The Johns Hopkins University, School of Medicine

本文内容

摘要

听觉器官介导听觉功能。本文介绍了一种改良的 在卵内 用于研究发育中鸡听觉器官内听觉前体细胞增殖与分化的优化微电穿孔方法

摘要

鸡胚是研究胚胎发育的理想模型系统，因为其基因功能的调控操作相对简便 在卵内内耳听觉感受器对我们 hearing 能力至关重要。它包含一个高度特化的感受上皮，由机械传导性毛细胞（HCs）及周围胶质样支持细胞（SCs）组成。尽管哺乳动物与鸟类的听觉器官在结构上存在差异，但调控听觉器官发育的分子机制在进化上是保守的。 在卵内 电穿孔技术主要局限于E1至E3时期的早期阶段。由于听觉器官在E5时期发育相对较晚，因此对听觉器官的操作在 在卵内 由于鸡胚在较晚阶段发育较为成熟，导致在E3阶段之后进行电穿孔操作较为困难。本文所述方法是一种瞬时基因转导技术，可用于在鸡胚发育的E4至E4.5阶段，靶向鸡听觉感觉器官中的目的基因 在卵内 显微电穿孔。该方法适用于基于常规质粒DNA表达载体的功能获得和功能缺失研究，并可与其他技术联用 在卵内 通过在电穿孔时向整个胚胎添加EdU（5-乙炔基-2′-脱氧尿苷）来进行细胞增殖检测。使用绿色或红色荧光蛋白（GFP或RFP）表达质粒可使实验者快速判断电穿孔是否成功靶向发育中内耳的听觉部分。在本方法学论文中，展示了GFP电穿孔样本的代表性实例；胚胎在电穿孔后18 – 96小时被取出 电穿孔后，通过RNA确认绿色荧光蛋白（GFP）已靶向至听觉器官的前感觉区 原位 杂交。该方法论文还提供了使用胸苷类似物EdU分析细胞增殖的优化方案；并给出了一个基于EdU的细胞增殖检测示例，该示例结合了免疫标记与点击化学EdU技术。

引言

尽管哺乳动物和鸟类听觉感觉器官在形态和细胞排列上存在差异，但负责感觉毛细胞发育的分子因子和信号通路被认为在进化上是保守的 1-3基底乳头是容纳听觉毛细胞（HC）及其周围支持细胞（SC）的结构，它作为内耳耳囊的一个外凸结构而发育形成。早期在耳基板/耳杯的神经-感觉潜能区（NSD）内确定了一群HC和SC的前体细胞。谱系追踪数据表明，在小鼠和鸡中，神经细胞系与感觉细胞系存在关联，并起源于位于耳杯或耳囊腹前区的NSD。 4,5首先，成神经细胞从神经感觉基板（NSD）脱离，形成听前庭神经节的神经元，这些神经元最终分化为听神经节和前庭神经节。这些神经元支配内耳的听觉和前庭感觉毛细胞（HCs）以及脑干中的相关核团。残留在NSD中的细胞则被认为会发育为多种感觉斑块，包括由机械转导性感觉毛细胞（HCs）及其支持细胞（SCs）组成的听觉感觉器官。

在鸡和小鼠中，听觉器官感觉前体细胞的细胞周期退出及毛细胞分化均以相反的梯度模式进行。在鸡中，听觉前体细胞的细胞周期退出始于约E5期，并从耳蜗基部向顶部、从中心向外围依次推进。 6一天后，毛细胞分化从顶端开始并向基部推进 7研究鸡内耳的发育过程具有诸多技术优势，因为其功能机制可以相对容易地进行探究。 在卵内 与操作胚胎相对 在子宫内 在其他模型系统中，这需要复杂的手术操作。本文所述方法采用 在卵内 在E4期，特异性地对耳泡中前腹侧的预定基底乳头区进行微电穿孔，以靶向目标基因。

电穿孔 在卵内 是一种成熟且常用的技术 8-14电穿孔技术的原理基于以下事实：核苷酸（例如， 质粒DNA、合成DNA或RNA寡核苷酸均带负电荷。将DNA注射至目标组织中，当电流通过该组织时，会在细胞膜上形成瞬时孔道，使带负电荷的DNA在向正极（阳极）迁移的过程中进入细胞。在功能获得实验中，通常将目的基因亚克隆至含有绿色荧光蛋白（GFP）或红色荧光蛋白（RFP）表达盒的表达质粒中。在功能缺失实验中，常用基于质粒的显性负性抑制子构建体、RNA干扰（RNAi）或吗啉代寡核苷酸（morpholino）构建体。 15,16. 为了抑制微小RNA（miRNA）功能，可使用miRNA海绵载体，这类载体通常基于质粒构建 17此处描述的方法可用于研究控制听觉器官中细胞增殖与分化的分子机制，因为 在卵内 微电穿孔法可轻松地与其他方法结合使用 在卵内 通过向整个胚胎添加EdU进行细胞增殖检测。

在听觉器官细胞周期退出开始前的一天，即E4期，在耳囊中进行电穿孔并加入EdU。通常在电穿孔后的E5期（感觉前体细胞周期退出起始）、E6期（毛细胞分化起始）、E7期（毛细胞分化过程中），以及最晚至约E9期（毛细胞分化结束）进行18–96小时 的听觉器官分析。这种基因转移的电穿孔方法是瞬时性的，持续时间约为4天，因为目的基因不会整合到基因组中；但该方法适用于使用适当的基于质粒DNA的表达载体，例如具有基因组整合能力的Tol2介导的基因转移11。采用此方法，GFP或RFP在耳蜗中的表达可维持约4天，之后信号逐渐减弱，但仍提供了充足的时间窗口用于研究听觉器官复杂的发育过程。这种in ovo基因转移方法具有新颖性，可在E4期特异性地靶向预期的听觉器官，非常适合聚焦于听觉器官中毛细胞发育的研究。该方法是对其他替代技术的良好补充，例如在更早期发育阶段进行电穿孔的技术11,12，或与in vitro基底乳头组织外植体培养方法相比18。

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方案

对卵和未孵化的胚胎应进行合乎伦理 且人道的照料与处理。所有涉及未孵化胚胎使用的实验方案均经马里兰州巴尔的摩市约翰斯·霍普金斯医学院动物护理与使用委员会批准。

1. 卵母细胞的获取与表达载体的构建

  1. 卵：
    1. 孵育3至4打受精鸡卵（Gallus gallus侧卧于37 °C环境中。
      1. 24 小时后 孵育一段时间后，用注射器从鸡蛋圆钝端抽取3 cc的蛋清，并用透明胶带封住孔洞。此举可在胚胎与蛋壳之间形成一个气室，便于后续在蛋壳顶部开窗时顺利接触胚胎，避免胚胎粘连在蛋壳上。 19.
      2. 在117小时时 孵育时间，根据Hamburger和Hamilton标准对胚胎进行分期 20 E4（HH24-25）时期的发育阶段（参见 图1D).
  2. 表达载体构建：
    1. 使用市售质粒DNA提取试剂盒及其配套试剂和说明书中的方案制备质粒DNA。在提取的最后一步，将DNA洗脱至试剂盒提供的500 µl TE（Tris-EDTA）缓冲液中，收集于1.5 ml离心管中。
    2. 加入50 µl 3 M醋酸钠和1 ml 100%乙醇至离心管中，通过乙醇沉淀浓缩DNA。将离心管置于-20 °C过夜。
    3. 将离心管在 4 °C 条件下以 14,000 rpm 离心 30 分钟。弃去上清液，将沉淀在室温下晾干 10 分钟。用 15 µl TE 缓冲液溶解沉淀，所得浓度约为 4 µg/µl。
      注意：此处使用的对照表达载体为 pMES-IRES-GFP10，由鸡启动 β-actin 启动子，或 pCI-H2B-IRES-RFP10，由以下因素驱动 CMV 启动子

2. 鸡胚 in ovo 微电穿孔及 in ovo 细胞增殖检测

  1. 在卵内 表达载体的显微注射与微型电穿孔技术
    1. 使用显微拉针仪，采用以下优化参数将玻璃毛细管拉制成细针：铂金加热丝规格为 2.5 x 2.5 mm，压力 = 500，加热温度 = 600 °C，拉力 = 64，拉速 = 105，时间 = 150 毫秒（参见 表1).
    2. 在显微镜两侧分别安装左式和右式显微操作仪支架（参见 图1A）。右手侧显微操作器夹持玻璃毛细管针头，左手侧显微操作器夹持电极（图1A).
    3. 在显微镜下用镊子剪断精细拉制的玻璃毛细管针尖，以制备显微注射用针头。
    4. 在显微镜下操作，使用显微操作仪手动将2.5 µl含0.1%快绿染料的质粒DNA吸入针头中。
    5. 将鸡蛋侧放于模具/鸡蛋固定装置中（参见 图1A用剪刀在蛋壳顶部剪出一个圆形窗口 19 (图1A).
    6. 在显微镜下操作时，使用镊子小心地打开覆盖在胚胎上的两层膜。
    7. 在显微镜下操作时，使用右手手动操控显微操作仪，通过显微注射将约0.5 µl质粒DNA注入右侧耳泡腔内，并结合微电穿孔技术完成转染。
      1. 为此，使用右侧显微操作仪向右侧耳泡腔内显微注射DNA图1B-D）同时用左手持镊子固定胚胎头部，因为E4期胚胎的头部会下倾。显微注射时不可超过耳囊腔，以免损伤耳囊。
      2. 显微注射后立即在显微镜下操作，使用左手显微操作器将正极（阳极）2 mm铂电极置于右侧耳泡前腹侧，负极（阴极）2 mm电极与其平行放置，间距1 mm（参见 图1 C）。以12 V电压递送4次脉冲，每次持续100毫秒，间隔200毫秒。左侧耳囊作为未处理的内部对照。
        注意：每次电穿孔之间，用浸有1×PBS的棉签清洁电极。
  2. 在卵内 细胞增殖检测
    1. 电穿孔后立即手动将50 μl含0.25 mg/ml EdU的1×PBS溶液滴加至整个胚胎上 在卵内 使用移液器。用胶带密封卵子，并放回培养箱中孵育18 - 96 小时
    2. 小心移除胶带，在18–24小时后检测胚胎耳泡内是否存在荧光GFP或RFP信号 使用标准荧光显微镜（参见 图1 E-E'）。如果存在荧光信号，此时可收获胚胎用于分析；或者用胶带重新密封后放回培养箱，以备在后续阶段收获并进行分析（参见 图1 F-P'').
      注意：GFP 信号的表达与 pMES-IRES-GFP 6-7 小时后可明显观察到构建体 电穿孔后 10.

3. 胚胎采集及用于RNA的组织处理 原位 杂交与免疫组织化学

  1. 使用镊子采集胚胎，用冷的1×PBS冲洗胚胎。用镊子在颈部处剪下胚胎头部，并将头部放入4%多聚甲醛中，4 °C过夜固定。用镊子刺破脑组织，以促进4%多聚甲醛渗入头部内部。
  2. 在30%蔗糖（溶于1×PBS）中，4 °C过夜脱水处理头部组织。
  3. 将头部组织包埋于冷冻保护介质中，通过干冰与甲基丁烷（2-甲基丁烷）混合物快速冷冻。或者，也可使用液氮对包埋于冷冻保护介质中的头部组织进行快速冷冻。将包埋好的头部组织保存于-80 °C。
  4. 将头部组织进行冷冻切片，切成12 µm厚的组织切片，并将所有包含内耳结构的切片收集至防脱载玻片上。
  5. 按照先前描述的方法进行标准RNA原位杂交和免疫组织化学染色4,21，并根据试剂盒制造商提供的方案分析EdU细胞增殖情况。
    注意：毛细胞可通过兔多克隆α-MyosinVIIa（Myo7a）抗体（1:1,000，Proteus Biosciences）以及荧光标记的二抗（1:250，山羊抗兔AlexaFluor 488；Invitrogen）进行鉴定。

4. 图像采集与处理

  1. 使用数字成像设备拍摄图像。采用标准荧光显微镜观察免疫组织化学结果及其他实验结果。 原位 使用标准的宽场显微镜（放大倍数范围为5x至40x）。
  2. 使用图像处理软件对图像进行处理。

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结果

在本方法学论文中，将含有绿色荧光蛋白（GFP）表达盒的质粒DNA，以优化参数（12 V、4次脉冲、每次脉冲持续100毫秒、间隔200毫秒）靶向导入发育中的鸡基底乳头（basilar papilla, BP），获得约50%的胚胎存活率，并实现了质粒DNA向BP的有效靶向。对发育中胚胎内源性GFP表达进行荧光成像显示，该电穿孔方法优先靶向耳囊的腹前部区域，该区域将发育形成BP。图1 E-E'；白色箭头）GFP 表达可在长达约 4 天的时间范围内进行追踪（图1 E-H）。RNA 原位 杂交（ISH）被用于确定电穿孔是否成功靶向了发育中内耳的听觉部分。为了确定GFP是否被听觉感觉前体细胞摄取，对相邻的基底乳头（BP）切片进行了ISH实验。在发育中的基底乳头中，感觉前体细胞通过其基因表达被鉴定出来 Sox2 (图1 K 和 N）和 Lunatic fringe (Lfng) (图1 J

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讨论

本文所述的in ovo显微电穿孔方法经过优化，适用于将基因导入发育中的听觉器官。该方法可与基于质粒DNA的表达载体兼容，通常用于调控基因功能或表达。在胚胎发育第4天（E4）进行电穿孔，是研究听觉器官中毛细胞（HC）发育的最佳时机。最关键的步骤包括：将DNA微量注射至听泡腔内时，避免针头插入过深而损伤听泡结构（见图1A-D）；通过合理放置电极，使DNA靶向听泡的前腹侧区域（见图1C）；以及采用优化的电穿孔参数，即施加4次12 V电压脉冲。这些参数与质粒DNA的优化浓度（约3.5 - 4 µg/µl）相结合，可特异性地靶向E4期的听觉器官前体区域。最初我们尝试使用6 V电压进行电穿孔，但未检测到荧光信号。随后逐步提高电压，分别尝试8 V 和10 V，最终确定12 V 为最佳电压。同样，脉冲次数、脉冲持续时间及脉冲间隔也经过了系统优化。在12 V条件下，施加4次、每次100毫秒、间隔200毫秒的脉冲最为理想。这些参数不仅可实现E4期高效的基因转导，还可使胚胎存活率达到约50%。若在电穿孔后24小时 内未观察到荧光信号，...

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披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

我们感谢Doris K. Wu博士提供表达质粒以及 原位 探针、约翰斯·霍普金斯大学感官生物学中心成像设施以及听力与平衡中心。本研究由NIDCD资助T32 DC000023支持，资助对象为L.E.

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
无菌 1x PBS，pH 7.4gibco10010-023
快绿 FCF 粉末SigmaF7252-5G
EdU 粉末InvitrogenE10187
Click-IT EdU Alexa Fluor 555 成像试剂盒InvitrogenC10338
HiSpeed 质粒中量提取试剂盒（25）Qiagen12643
ECM 830 电穿孔仪 BTX Harvard Apparatus
香蕉到微型抓取器电缆套件BTX Harvard Apparatus45-0216
右手性 &左利手显微操作器World Precision Instruments 公司 M3301R && M3301L
两个带7英寸垂直支架的12毫米磁性固定装置载台World Precision Instruments 公司 M10
金属钢制底板 12x24 英寸World Precision Instruments 公司 5479
用于卵的剪刀，长12厘米，弯曲，12毫米超细刀刃；弹簧式剪刀World Precision Instruments 公司 14120
用于拉制针头的微电极拉制仪Sutter Instrument Co.P-97
2.5x2.5 mm 盒式铂金加热丝Sutter Instrument Co.
玻璃毛细管/针头/无纤维/硼硅酸盐 1 mmFHC27-30-0
Hamilton 玻璃注射器 100 μlHamilton80601 型号 710LT
用于 Hamilton 玻璃注射器的石蜡油（重质）Fisher ScientificO122-1
连接玻璃注射器与玻璃毛细管针头的聚乙烯管 / 无毒贝克顿·迪金森公司（BD）427420 Intramedic Clay Adams 品牌
3 cc 一次性注射器Becton Dickinson and Company (BD)309657
一次性21号针头Becton Dickinson and Company (BD)305122
一对2 mm铂电极Bulldog Bio. / NepageneCUY611P3-2
电极夹Bulldog Bio. / NepageneCUY580
一对Dumont 5号精细镊子精细科学工具（FST）
用于封固鸡蛋的哑光透明胶带Office Depot520-928
棉签Fisher Scientific23-400-101
无菌滤芯吸头

参考文献

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