通过 in ovo 微电穿孔法将基因导入鸡听觉器官

摘要

听觉器官介导听觉功能。本文介绍了一种改良的 在卵内 用于研究发育中鸡听觉器官内听觉前体细胞增殖与分化的优化微电穿孔方法

摘要

鸡胚是研究胚胎发育的理想模型系统，因为其基因功能的调控操作相对简便 在卵内内耳听觉感受器对我们 hearing 能力至关重要。它包含一个高度特化的感受上皮，由机械传导性毛细胞（HCs）及周围胶质样支持细胞（SCs）组成。尽管哺乳动物与鸟类的听觉器官在结构上存在差异，但调控听觉器官发育的分子机制在进化上是保守的。 在卵内 电穿孔技术主要局限于E1至E3时期的早期阶段。由于听觉器官在E5时期发育相对较晚，因此对听觉器官的操作在 在卵内 由于鸡胚在较晚阶段发育较为成熟，导致在E3阶段之后进行电穿孔操作较为困难。本文所述方法是一种瞬时基因转导技术，可用于在鸡胚发育的E4至E4.5阶段，靶向鸡听觉感觉器官中的目的基因 在卵内 显微电穿孔。该方法适用于基于常规质粒DNA表达载体的功能获得和功能缺失研究，并可与其他技术联用 在卵内 通过在电穿孔时向整个胚胎添加EdU（5-乙炔基-2′-脱氧尿苷）来进行细胞增殖检测。使用绿色或红色荧光蛋白（GFP或RFP）表达质粒可使实验者快速判断电穿孔是否成功靶向发育中内耳的听觉部分。在本方法学论文中，展示了GFP电穿孔样本的代表性实例；胚胎在电穿孔后18 – 96小时被取出 电穿孔后，通过RNA确认绿色荧光蛋白（GFP）已靶向至听觉器官的前感觉区 原位 杂交。该方法论文还提供了使用胸苷类似物EdU分析细胞增殖的优化方案；并给出了一个基于EdU的细胞增殖检测示例，该示例结合了免疫标记与点击化学EdU技术。

引言

尽管哺乳动物和鸟类听觉感觉器官在形态和细胞排列上存在差异，但负责感觉毛细胞发育的分子因子和信号通路被认为在进化上是保守的 ^1-3基底乳头是容纳听觉毛细胞（HC）及其周围支持细胞（SC）的结构，它作为内耳耳囊的一个外凸结构而发育形成。早期在耳基板/耳杯的神经-感觉潜能区（NSD）内确定了一群HC和SC的前体细胞。谱系追踪数据表明，在小鼠和鸡中，神经细胞系与感觉细胞系存在关联，并起源于位于耳杯或耳囊腹前区的NSD。 ^4,5首先，成神经细胞从神经感觉基板（NSD）脱离，形成听前庭神经节的神经元，这些神经元最终分化为听神经节和前庭神经节。这些神经元支配内耳的听觉和前庭感觉毛细胞（HCs）以及脑干中的相关核团。残留在NSD中的细胞则被认为会发育为多种感觉斑块，包括由机械转导性感觉毛细胞（HCs）及其支持细胞（SCs）组成的听觉感觉器官。

在鸡和小鼠中，听觉器官感觉前体细胞的细胞周期退出及毛细胞分化均以相反的梯度模式进行。在鸡中，听觉前体细胞的细胞周期退出始于约E5期，并从耳蜗基部向顶部、从中心向外围依次推进。 ⁶一天后，毛细胞分化从顶端开始并向基部推进 ⁷研究鸡内耳的发育过程具有诸多技术优势，因为其功能机制可以相对容易地进行探究。 在卵内 与操作胚胎相对 在子宫内 在其他模型系统中，这需要复杂的手术操作。本文所述方法采用 在卵内 在E4期，特异性....

方案

对卵和未孵化的胚胎应进行合乎伦理 且人道的照料与处理。所有涉及未孵化胚胎使用的实验方案均经马里兰州巴尔的摩市约翰斯·霍普金斯医学院动物护理与使用委员会批准。

1. 卵母细胞的获取与表达载体的构建

1. 卵：
   1. 孵育3至4打受精鸡卵（Gallus gallus侧卧于37 °C环境中。
      1. 24 小时后 孵育一段时间后，用注射器从鸡蛋圆钝端抽取3 cc的蛋清，并用透明胶带封住孔洞。此举可在胚胎与蛋壳之间形成一个气室，便于后续在蛋壳顶部开窗时顺利接触胚胎，避免胚胎粘连在蛋壳上。 ¹⁹.
      2. 在117小时时 孵育时间，根据Hamburger和Hamilton标准对胚胎进行分期 ²⁰ E4（HH24-25）时期的发育阶段（参见 图1D).
2. 表达载体构建：
   1. 使用市售质粒DNA提取试剂盒及其配套试剂和说明书中的方案制备质粒DNA。在提取的最后一步，将DNA洗脱至试剂盒提供的500 µl TE（Tris-EDTA）缓冲液中，收集于1.5 ml离心管中。
   2. 加入50 µl 3 M醋酸钠和1 ml 1....

结果

在本方法学论文中，将含有绿色荧光蛋白（GFP）表达盒的质粒DNA，以优化参数（12 V、4次脉冲、每次脉冲持续100毫秒、间隔200毫秒）靶向导入发育中的鸡基底乳头（basilar papilla, BP），获得约50%的胚胎存活率，并实现了质粒DNA向BP的有效靶向。对发育中胚胎内源性GFP表达进行荧光成像显示，该电穿孔方法优先靶向耳囊的腹前部区域，该区域将发育形成BP。图1 E-E'；白色箭头）GFP 表达可在长达约 4 天的时间范围内进行追踪（图1 E-H）。RNA 原位 杂交（ISH）被用于确定电穿孔是否成功靶向了发育中内耳的听觉部分。为了确定GFP是否被听觉感觉前体细胞摄取，对相邻的基底乳头（BP）切片进行了ISH实验。在发育中的基底乳头中，感觉前体细胞通过其基因表达被鉴定出来 Sox2 (图1 K 和 N）和 Lunatic fringe (Lfng) (图1 J

讨论

本文所述的in ovo显微电穿孔方法经过优化，适用于将基因导入发育中的听觉器官。该方法可与基于质粒DNA的表达载体兼容，通常用于调控基因功能或表达。在胚胎发育第4天（E4）进行电穿孔，是研究听觉器官中毛细胞（HC）发育的最佳时机。最关键的步骤包括：将DNA微量注射至听泡腔内时，避免针头插入过深而损伤听泡结构（见图1A-D）；通过合理放置电极，使DNA靶向听泡的前腹侧区域（见图1C）；以及采用优化的电穿孔参数，即施加4次12 V电压脉冲。这些参数与质粒DNA的优化浓度（约3.5 - 4 µg/µl）相结合，可特异性地靶向E4期的听觉器官前体区域。最初我们尝试使用6 V电压进行电穿孔，但未检测到荧光信号。随后逐步提高电压，分别尝试8 V 和10 V，最终确定12 V 为最佳电压。同样，脉冲次数、脉冲持续时间及脉冲间隔也经过了系统优化。在12 V条件下，施加4次、每次100毫秒、间隔200毫秒的脉冲最为理想。这些参数不仅可实现E4期高效的基因转导，还可使胚胎存活率达到约50%。若在电穿孔后24小时 内未观察到荧光信号，.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
无菌 1x PBS，pH 7.4	gibco	10010-023
快绿 FCF 粉末	Sigma	F7252-5G
EdU 粉末	Invitrogen	E10187
Click-IT EdU Alexa Fluor 555 成像试剂盒	Invitrogen	C10338
HiSpeed 质粒中量提取试剂盒（25）	Qiagen	12643
ECM 830 电穿孔仪	BTX Harvard Apparatus
香蕉到微型抓取器电缆套件	BTX Harvard Apparatus	45-0216
右手性 &左利手显微操作器	World Precision Instruments 公司	M3301R && M3301L
两个带7英寸垂直支架的12毫米磁性固定装置载台	World Precision Instruments 公司	M10
金属钢制底板 12x24 英寸	World Precision Instruments 公司	5479
用于卵的剪刀，长12厘米，弯曲，12毫米超细刀刃；弹簧式剪刀	World Precision Instruments 公司	14120
用于拉制针头的微电极拉制仪	Sutter Instrument Co.	P-97
2.5x2.5 mm 盒式铂金加热丝	Sutter Instrument Co.
玻璃毛细管/针头/无纤维/硼硅酸盐 1 mm	FHC	27-30-0
Hamilton 玻璃注射器 100 μl	Hamilton	80601 型号 710LT
用于 Hamilton 玻璃注射器的石蜡油（重质）	Fisher Scientific	O122-1
连接玻璃注射器与玻璃毛细管针头的聚乙烯管 / 无毒	贝克顿·迪金森公司（BD）	427420 Intramedic Clay Adams 品牌
3 cc 一次性注射器	Becton Dickinson and Company (BD)	309657
一次性21号针头	Becton Dickinson and Company (BD)	305122
一对2 mm铂电极	Bulldog Bio. / Nepagene	CUY611P3-2
电极夹	Bulldog Bio. / Nepagene	CUY580
一对Dumont 5号精细镊子	精细科学工具（FST）
用于封固鸡蛋的哑光透明胶带	Office Depot	520-928
棉签	Fisher Scientific	23-400-101
无菌滤芯吸头