Method Article

受体放射自显影协议血管紧张素Ⅱ受体的本地化的可视化

DOI:

10.3791/53866

⸱

June 7th, 2016

 ,  ,  , 
1Farquhar College of Arts and Sciences, Nova Southeastern University, 2Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, Nova Southeastern University, 3School of Medicine, University of Colorado

In This Article

Summary

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在这里，我们提出了一个方案，通过使用碘-125 标记的血管紧张素 II 类似物进行定量、密度测定、体外受体放射自显影来描述血管紧张素 II 1 型受体在大鼠大脑中的定位。

Abstract

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这个协议描述了使用特异于血管紧张素II受体进行受体放射自显影映射放射性为血管紧张素Ⅱ（血管紧张素II）中的大鼠脑受体结合模式。

组织标本收获并保存在-80℃。低温恒温器是用来冠部分组织（脑）和部分解冻 - 安装到带电的幻灯片。制作在载玻片上的组织切片在125 I SI-血管紧张素II孵育放射性标记血管紧张素Ⅱ受体。相邻的幻灯片被分成两组:"非特异性结合"非放射性标记的血管紧张素II的受体饱和的浓度，或存在（NSP）的AT 1血管紧张素II受体亚型（AT 1R）选择性血管紧张素II受体拮抗剂，与"总结合'没有AT 1 R拮抗剂。 AT 2血管紧张素Ⅱ受体亚型（AT 2 R）饱和浓度的拮抗剂（PD123319，10μM）也出现在incubati关于缓冲区限制125 I-SI-血管紧张素II结合到AT 1 R亚型。在30分钟预温育在约22℃，NSP载玻片暴露于10μM的PD123319和氯沙坦，而'总结合'载玻片暴露于10μM的PD123319。载玻片然后用125 I SI-血管紧张素II在缓冲液中培养在PD123319存在关于'总结合'和PD123319和氯沙坦为NSP在测定缓冲液，随后几个"洗涤"，和水以除去盐和非特异性结合放射性。幻灯片使用吹塑机，然后暴露于放射自显影胶片使用一个专门的电影和录像带干燥。胶片显影和图像被扫描成用于使用专有成像系统和一个电子表格视觉和定量密度的计算机。另外一组幻灯片的硫堇染色进行组织学的比较。

使用受体放射自显影的优点是可视化的能力血管紧张素II受体原位 ，一个组织试样的一个区段内，和解剖学通过比较相邻的组织学参考部分确定的组织的区域。

Introduction

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心血管疾病仍然是死亡和残疾在美国，造成人员死亡，在美国超过30％的主要原因在2011年1，从美国心脏协会最近的统计数据表明，超过三分之一的人有一个或更多类型的心血管疾病。心血管研究继续迈大步对了解这种疾病，但作为一代开始变老当务之急是要继续努力。肾素-血管紧张素系统（RAS）的主要由促进动脉粥样硬化，炎症，全身性的血管收缩，和激活交感神经系统的（ 图1）2-8起着在心血管系统的调节中发挥中心作用。

在RAS是当肾的肾小球旁细胞分泌肾素进入血液响应于血压下降时启动的荷尔蒙系统，增加sympathetic刺激，或由致密斑流钠降低。肾素代谢血管紧张素原（在肝脏中合成），以形成血管紧张素I（血管紧张素Ⅰ）。血管紧张素I被随后通过血管紧张素转换酶（ACE）代谢，一种外酶对血管内皮细胞的腔侧，主要在肺，肾，以形成血管紧张素II（ANG II）中，在RAS的主要效应的肽。血管紧张素Ⅱ是能够激活两种接受亚型;的1型受体（AT 1 R）和2型受体（AT 2 R），两者调节心血管系统，保持体液和电解质平衡和现在被认为影响认知功能和神经变性疾病进程8,9。本地，特定脑-RAS报道独立合成血管紧张素II。在大脑中，前体蛋白血管紧张肽原在由肾素样酶3转化为血管紧张素我星形胶质细胞10合成，可能是肾素原结合于肾素原受体11，并且随后通过其在大脑中的神经元12的胞表面上大量表达血管紧张素转换酶转化成血管紧张素II。产生的血管紧张素II这intrabrain是对大脑的AT 1和AT个从血源性血管紧张素Ⅱ分离2受体的激动剂。

而对AT 1 R起着重要的生理作用，这是更好地了解整个身体的病理生理作用，主要影响心血管系统和肾脏（ 图2）。当血管紧张素II结合到AT 1 R，它会导致血管收缩;增加血流阻力和血压升高。它还促进醛固酮和加压素的合成和分泌，从而增加钠和水潴留。这些效果也可以引起缺血性脑损伤和认知障碍，并链接到帕金森氏病，阿尔茨海默氏病，和diabeTES，以及最近被鉴定为影响学习和记忆13-15。有在RAS在于一个反馈回路的AT在肾脏肾小球旁细胞1 R抑制肾素分泌。有趣的是，AT 2 R一般反调控的AT 1 R，导致在许多其他16-20血管扩张，轴突生长，轴突再生，抗增殖和cerebroprotection的动作。所述AT 2 R也被确定为抗高血压和最近，抗癌药21的靶。确定各种组织内的血管紧张素Ⅱ受体的定位和密度以及他们是如何通过定量光密度的受体放射自显影将有助于揭开RAS在特定疾病中扮演的角色不同的治疗方法和疾病状态的影响。

受体放射自显影已经使用了30多年作为一种有效的方法，用于指示血管紧张素I的存在下1受体和大脑中的RAS的其它部件和大鼠，小鼠，豚鼠，在各种实验条件下22-34狗和人的其他组织。大脑内定位血管紧张素II受体的重要性是一个可以应用功能的神经解剖学至血管紧张素II的动作在大脑中， 例如 ，AT 1 R的下丘脑（PVN）的室旁核的存在表明昂的函数II在大脑刺激加压素，催产素或促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）释放，或交感神经系统的活化。因此，阻断对AT 1 R药物可能会降低一些与在脑的RAS活性相关这些PVN介导的作用。正在进行的工作表明，AT 1 R拮抗剂的使用可以减少创伤后应激障碍（PTSD）的CRH诱导释放和缓解创伤后应激障碍的症状（伤害等 ，提交出版）。在PVN，穹窿器官（SFO），和杏仁核被称为调节体内平衡，食欲/口渴，睡眠，记忆，情绪反应，并且是本实证研究的目标区域。通过收集在显微镜玻片上脑的冠状切片，并治疗与特异性抑制剂的部分与血管紧张素II受体具有特异性放射性配体沿检查这些区域。在这项研究中，与建议的厂商沿所有材料和试剂中列出，碘-125，采用放射性标记的血管紧张素II受体拮抗剂，肌氨酸1，异亮氨酸8血管紧张素II（SI血管紧张素II），然后将其作为单声道125我纯化-SI血管紧张素II使用如前面所述的35 HPLC方法。使用这种高比活性的放射性配体的允许的放射性标记的部分暴露于X射线胶片后低，中和高受体密度的区域的可视化。通过与含有已知量的碘-125，具体量的脑糊标准校准膜血管紧张素II受体的区域结合的进行量化。在实验研究中，血管紧张素Ⅱ受体实验对象的大脑结合可以比对照受试者的大脑。这可以指示是否血管紧张素II的动作响应于遗传条件，表型异常，疾病状态或药物治疗被改变。然后，该知识可以应用到疗法来治疗与RAS的失调相关的疾病的发展。标识受体结合位点的替代技术，但具有降低的解剖分辨率，被结合使用从组织匀浆，这是与放射性配体的范围内的浓度，以评估作为解离常数放射性配体结合亲和力的培养来源的组织膜制剂测定（ 杀敌 ）和最大结合能力（B 最大值 ）的感兴趣的组织的。

这里所描述的协议可以被分解成5大共mponents:准备组织切片受体放射自显影;受体放射自显影;胶片曝光和发展;组织学;和密度图像分析。

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Protocol

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这项研究进行的所有动物的程序是由诺瓦东南大学的机构动物护理和使用委员会与指南实验动物的护理和使用一致认可， 第 8版（国家科学院出版社，华盛顿特区2011 ）。

1.准备组织切片受体放射自显影

  1. 牺牲后，收获新鲜的脑组织，并尽快包装在铝箔并将其放置在-20℃的冰箱。要保持正确的形状，放置在大脑脑模具模拟头骨的内部，包裹在铝箔和发生在 - 20℃的冰箱中。 30分钟后，在可密封的冷冻储存袋处的组织和移动到-80℃冷冻长期储存。
    1. 获得的从-80℃冷冻，并转移到设定为最小的-10℃和最高的-18℃的低温恒温器，以避免解冻感兴趣的新鲜冰冻组织标本。
    2. 放置在试样上组织与二醇和基于树脂的包埋介质装入，仅嵌入试样到培养基中的一小部分。对于大脑，大脑垂直安装，以使在冠状面切片。
  2. 将组织安装到低温恒温器内的切片机，并在地方拧紧。确保大脑的左侧和右侧是相同的前 - postero坐标，并且背腹轴垂直于常用脑图谱。
  3. 开始在所需的厚度切割（20微米推荐）和解冻安装部分到显微镜载玻片在垂直方向为具有在滑动空间更大的表面积。收集部分在载玻片上以顺序每组五，即第一组幻灯片标记1-1,1-2，1-3,1-4和1-5（ 图3）。
  4. 填写一组幻灯片与段后，允许幻灯片空气干燥达1小时，然后将SLI德在一个自密封冷冻储存袋在-20℃的塑料载玻片盒，和存储。

2.放射自显影受体

注意:放射性。使用防护服装来处理放射性。处置成立后依赖，并且必须遵循准则正确衰减（半衰期60天）或通过认证的公司被拾起。

  1. 从-20℃冷冻机中取出感兴趣的"-1"和"-2"幻灯片和安装到滑动夹（ 图5）。安装"-1"的幻灯片共同为"非特定的"治疗和"-2"幻灯片"总"的待遇。 "非特异性"罐子将包含10μM的PD123319的终浓度的AT 2 R拮抗剂氯沙坦的AT 1 R拮抗物，在测定培养基缓冲液（AM5）（ 表1）中 ，"总"结合罐子将只包含10 μMPD123319在AM5。
  2. 反转幻灯片夹具放置载玻片到装有35-40毫升AM5的预培养科普林缸，和各自的抑制剂在室温下30分钟。在4分钟的时间间隔开始在他们的预培养浴随后集。
  3. 立即在室温从预温育溶液的孵育滑动邮寄者传送幻灯片，含有10ml AM5的，再加上125 I SI-血管紧张素II的预定浓度与相应的抑制剂（ 图4中的计算），60-90分钟温度。如果有足够的放射性，10幻灯片可以放置（背靠背）在修改幻灯片夹和科普林罐子125 I-SI-血管紧张素Ⅱ培养。
  4. 地方滑动回幻灯片夹具（如果需要），印迹，并冲洗轻轻1-2秒在400毫升蒸馏水在两个单独的容器中旋流。
  5. 顺序地转移滑入含35-40毫升AM5的每个（如在图4 <所示恰好1分钟4科普林罐子/ STRONG>）。
  6. 最后1分钟后用清水洗净，轻轻摇动部分在冰冷的蒸馏水中的四个转变1-2秒。
  7. 吹干冷空气的幻灯片（注意:热空气会挥发放射性化合物）利用4分钟（ 图5）不同的角度设置了四个吹风机，直到所有的路段都干，然后将纸巾上。
  8. 滑山与组织朝上到纸板的并置，以X光片使用双面胶带。
  9. 安装的至少一个，125碘校准标准滑动到每个纸板（ 图6）。
    注意:校准标准包括脑糊用125碘彻底混合绑定到含有苯酚环，通过离心在1ml结核菌素注射器压实的化合物，其是低温恒温器在相同的厚度脑切片切片并解冻安装到显微镜的幻灯片。另外，125我校准标准在20微米厚切片塑性树脂可以商购获得。在这些标准的塑料树脂部分地屏蔽来自辐射的膜，使得〜40％的组织等效应计入校准。

3.胶片曝光与发展

  1. 继续用皮带背透视卡带和放射自显影胶片暗房。打开纸盒，并把里面滑梯（ 图6）的硬纸板。
    1. 把灯关了，打开安全灯。小心打开X射线胶片的箱子，取出一部电影，并将电影光面向上（与右下角的锯齿边缘）在磁带上的幻灯片上。小心关闭磁带，并旋转锁定杆密封发光（ 图6）。在-20℃下暴露数日的幻灯片到几周。
  2. 在暗室中，打开磁带和胶片显影PROC进行ESS。
    1. 放置滑入连续托盘;显影剂2分钟，含有5％冰醋酸，30秒，和定影剂进​​行5分钟的水。该薄膜的置于与20分钟流水的托盘，然后放入Photoflo为不超过10秒，挂起。
      注意:曝光时间凭经验确定，并且可以包括与不同曝光时间的多个片:长到足以从具有低结合区获得可测量的信号，但没有限制，只要通过与高结合区域饱和膜。一旦获得可接受的曝光，然后进行到下一个步骤。

4.组织学

  1. 制备硫素染色和染色试剂（ 表2， 图7）。
    1. 放置"-3"在滑动架，和转让顺序用离子交换水开始1分钟，然后接着是三个倾角成去电离10分钟硫素染色液美化版水域，并在去离子一水30秒洗。
    2. 继水，将滑动架成乙醇洗涤如下; 50％，70％，90％，30秒，然后在100％含双乙醇洗涤每个1分钟。最后，将滑动架成二甲苯为3分钟，然后转移到第二个二甲苯溶液5分钟。
  2. 在从最后二甲苯浴一次删除一个滑动，并覆盖与在有机溶剂中的安装平台的树脂基滑动件的上边缘，并放置一个24mm×60毫米盖玻片的幻灯片。允许幻灯片充分干燥〜48小时，然后扫描到电脑2400 dpi灰阶。

5.光密度图像分析

  1. 放置膜光泽面下来，用在左下角的锯齿边和扫描利用能够没有在成像系统的计算机的任何失真发送膜密度信息的专有扫描器。
  2. 打开专用的成像SYS统和利用校准棒以建立校准标准（ 图9 - 12）在胶片上的图像的未来光密度分析。
  3. 通过建立两种模板或经验概括感兴趣的领域的兴趣度的区域。数据被收集并基于膜分离，对照或野生型（部分），和区域。确保包括测量过程中的密度（飞摩尔/克），扫描区域和总目标区域（ 图9）。
    1. 通过确保感兴趣区域落在突出的参数（ 图10）之间调整扫描区域酒吧。
    2. 导出数据到电子表格（ 表4）。乘以密度倍的总的目标区域，然后通过扫描区域，以获得用于结合该特定区域的值除以。一旦这样做是为了测量所有值，底物的非特异性的既定从总得到特异性结合p怨恨。平均值，也可以对这些值进行的。

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Results

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所述肾素-血管紧张素系统的代谢途径的概要示于图1和直接集中在血管紧张素II受体亚型（AT 1 R和AT 2 R）在图2中进行说明。 图3显示冠状脑转移节到显微镜载玻片，然后将其通过一个受体放射自显影方法，使用预定的125 I SIANG II浓度运行， 如图4所示。 图5示出了用于在受体放射自显影的幻灯片其然后粘贴到纸板作为干燥步骤如图6所示，并随后开发的。 表2列出了用于在图中描述7校准标准单位为量化制作在载玻片上的组织切片的硫素染色过程所用试剂确定巴关于该测定的日期的sed如表3所示 。 图8示出了建立与125 I...

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Discussion

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描述的协议标识"总"和"非特异性"在啮齿动物脑先前收获并保存在-80℃的冠状切片的相邻部分的放射性配体结合的可视化，并且可以容易地适用于几乎所有的组织中已解剖解决其中显示的受体或放射性配体结合位点的差的量子结构。在协议中描述的过程简单，分析是正确地解释结果的关键。测定20微米厚为最佳;如果部分过厚的非特异性结合会增加，从而难以解决的放射性配体的结合到它的目标。如果该部分被切断变薄，变得难以顺利切割和保存顺序部分不失真。在最佳切割温度会由于组织的性质和段和i的厚度略有不同S键通常凭经验确定。一旦接触叶片和组织之间进行，试样的取向可以进行审查，并通过移动该组织标本从刀片往回走，和调整所述安装球重新调整。当切割啮齿动物脑关键是要确保大脑的左侧和右侧是相同的前 - postero坐标，并且背腹轴垂直于常用脑图谱。幻灯集预标记，以对组织的相邻部分进行研究。 5幻灯片的第一集合标记1-1,1-2，1-3,1-4和1-5。在第一切口部在左上角的推移滑动1-1（这是幻灯片的右上角，当它是磨砂面朝下）;第二次切割部分那张幻灯片1-2 等 。第五部分切那张幻灯片1-5。第六部分切那张幻灯片1-1首节的左侧。第一组幻灯片被填满后，启动另一...

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Disclosures

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Robert Speth 已将血管紧张素 II 受体抗体授权给一家商业供应商，并从销售上述抗体中获得特许权使用费。其他作者没有什么可透露的。

Acknowledgements

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这项工作得到了 NIH Grant HL-113905 的支持

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
500 ml 塑料烧杯Fisher02-591-30
24 mm x 60 mm 盖玻片Fisher22-050-25
放射自显影成像胶片 24 mm x 30 cmCarestream-Biomax MR 胶片891-2560
杆菌肽（来自地衣芽孢杆菌）SigmaB-0125
纸板 8 x 11新月形插图板 #201201
Coplin 罐Fisher ScientificE94
商用吹风机Conair型号 SD6X
一次性培养管Fisher14-961-26
EDTA（二钠盐，二水合物）USB Corporation15-699
乙醇Fisher16-100-210 
D-19 显影摄影师 Formulary， Inc. 的处方替代品 01-0036
冰醋酸FisherA38 SI-212
Histoprep/OCTFisherSH75-125D
胶片定影器柯达5160320
Photo flo柯达1464502
氯沙坦Fisher/Tocris37-985-0
MCID™Core 7.0MCIDN/A
NaClFisherS271
Peel-A-Way 滑动夹具VWR48440-003
PermountFisherSP15-100
PD123319Fisher13-615-0
高级带电载玻片，精细研磨边缘Premiere 显微镜载玻片9308W
125I 配体Perkin ElmerNEX- 248
125SI-Ang II 乔治华盛顿大学Speth
Slide MailersFisher ScientificHS15986
水磷酸氢二钠 （Na2PO4）FisherRDCS0750500
乙酸钠（无水）FisherBP333-500
硫氨酸 FisherT409-25
X射线盒 （10 x 12）Spectronics Corporation四方
二甲苯Fisher X3P-1GAL
博士放射性碘 无

References

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