血管紧张素II受体定位可视化的受体放射自显影实验方案

摘要

本文介绍了一种通过定量、密度测定法、体外受体放射自显影技术，使用碘-125标记的血管紧张素II类似物，来描述血管紧张素II 1型受体在大鼠脑内定位的实验方案。

摘要

本方案描述了使用特异性放射性配体对大鼠脑内血管紧张素II（Ang II）受体进行受体自显影定位，以研究Ang II在大鼠脑中的受体结合模式。

采集组织样本并保存于 -80 °C。使用冷冻切片机对组织（脑组织）进行冠状切片，并将切片 thaw-mount 到带电荷的载玻片上。将载玻片上的组织切片与 ¹²⁵I-SI-Ang II 孵育，以放射性标记 Ang II 受体。相邻的载玻片分为两组：一组用于检测“非特异性结合”（NSP），在含有受体饱和浓度的非放射性标记 Ang II 或 AT₁ Ang II 受体亚型（AT₁R）选择性拮抗剂的条件下进行；另一组用于检测“总结合”（total binding），不添加 AT₁R 拮抗剂。在孵育缓冲液中同时加入饱和浓度的 AT₂ Ang II 受体亚型（AT₂R）拮抗剂（PD123319，10 µM），以限制 ¹²⁵I-SI-Ang II 仅与 AT₁R 亚型结合。在约 22 °C 下进行 30 分钟预孵育，NSP 组载玻片暴露于 10 µM PD123319 和氯沙坦（losartan），而“总结合”组载玻片仅暴露于 10 µM PD123319。随后，载玻片在含有 PD123319 的缓冲液中与 ¹²⁵I-SI-Ang II 孵育用于“总结合”检测，或在含有 PD123319 和氯沙坦的缓冲液中孵育用于 NSP 检测，之后用缓冲液多次“洗涤”，再用水冲洗以去除盐分和非特异性结合的放射性配体。载玻片经吹干后，置于专用胶片和暗盒中进行放射自显影。胶片显影后，图像被扫描进入计算机，使用专有成像系统和电子表格软件进行可视化及定量密度分析。另设一组载玻片进行硫堇染色，用于组织学比较。

使用受体放射自显影技术的优势在于能够可视化血管紧张素II受体 原位在组织标本的某一区域中，通过与相邻的组织学参考切片进行比较，解剖学上识别该组织区域。

引言

心血管疾病仍然是美国死亡和残疾的首要原因，2011年导致了美国超过30%的死亡病例¹。美国心脏协会的最新统计数据显示，超过三分之一的美国人患有一种或多种类型的心血管疾病。心血管研究在深入理解该疾病方面持续取得进展，但随着人口老龄化加剧，继续推进这些研究工作显得尤为迫切。肾素-血管紧张素系统（RAS）在心血管系统的调节中起着核心作用，主要通过促进动脉粥样硬化、炎症反应、全身性血管收缩以及交感神经系统的激活来发挥作用（图1）^2-8。

肾素-血管紧张素系统（RAS）是一种激素系统，当肾脏的球旁细胞在血压降低、交感神经刺激增强或致密斑处钠离子流量减少的情况下向血液中分泌肾素时，该系统即被激活。肾素将由肝脏合成的血管紧张素原代谢为血管紧张素I（Ang I）。随后，Ang I被主要存在于肺部和肾脏血管内皮细胞管腔侧的膜外酶——血管紧张素转换酶（ACE）进一步代谢，生成RAS的主要效应肽血管紧张素II（Ang II）。Ang II能够激活两种受体亚型：1型受体（AT₁R）和2型受体（AT₂R），二者均参与调节心血管系统、维持体液和电解质稳态，目前也被认为影响认知功能及神经退行性疾病过程^8,9。已有研究报道，脑内存在一个局部的、脑特异性的RAS，可独立合成Ang II。在脑组织中，前体蛋白血管紧张素原由星形胶质细胞合成¹⁰，经一....

方案

本研究中进行的所有动物实验均经诺瓦东南大学机构动物护理和使用委员会批准，符合《实验动物护理与使用指南》第8版的要求。^th （美国国家科学院出版社，华盛顿特区，2011年版）

1. 受体放射自显影组织切片的制备

1. 处死后立即采集新鲜脑组织，用铝箔包裹，并尽快放入 -20 °C 冰箱中。为保持脑组织的正确形态，可将脑组织置于模拟颅腔内部结构的脑模中，再用铝箔包裹，放入 -20 °C 冰箱。30 分钟后，将组织转移至可密封的冷冻储存袋中，并移至 -80 °C 冰箱进行长期保存。
   1. 从 -80 °C 冰箱中取出所需的新鲜冷冻组织样本，转移至设定温度为 -10 °C 至 -18 °C 的冷冻切片机中，以避免样本解冻。
   2. 将样本置于组织托上，使用基于乙二醇和树脂的包埋介质，仅将样本的一小部分嵌入介质中。对于脑组织，应将脑垂直固定，以便进行冠状面切片。
2. 将组织托安装在冷冻切片机内的切片机上，并牢固固定。确保脑组织的左右两侧处于相同的前后坐标位置，且背腹轴方向与常用脑图谱的坐标系垂直。
3. 开始以所需厚度（推荐 20 µm）进行切片，并将切片以垂直方向贴附于载玻片上，以在载玻片上获得更大的可用空间。将切片按连续顺序每五张为一组收集到载玻片上，即第一组载玻片标记为 1-1、1-2、1-3、1-4 和 1-5（图 3）。
4. 完成一组载玻片....

结果

肾素-血管紧张素系统代谢途径的概览如下所示 图1 以及对血管紧张素II受体亚型（AT₁R 和 AT₂R）的描述见于 图2. 图3 展示将冠状面脑切片转移至显微镜载玻片的过程，随后使用预设的受体放射自显影步骤进行处理 ¹²⁵I-SIAng II 浓度如图所示 图4. 图5 展示受体放射自显影中载玻片的干燥步骤，随后将其固定在纸板上，如图所示 图6， 随后进行发育。 表 2 列出用于载玻片组织切片硫堇染色步骤的试剂，该切片如文中所述 图7定量所用的校准标准单位根据检测日期确定，如图所示。 表3. 图8 显示建立标准曲线以关联 ¹²⁵I浓度（fmol/g组织）与胶片曝光（相对光密度）之间的关.......

讨论

所述方案旨在对先前采集并储存在 -80 °C 的啮齿类动物脑冠状切片的相邻切片中，放射性配体的“总结合”与“非特异性结合”进行可视化观察，该方法可广泛适用于几乎所有具有解剖学上可分辨亚结构且表达不同数量受体或放射性配体结合位点的组织。本方案所描述的操作步骤简便，而分析过程对于正确解读实验结果至关重要。20 µm 的切片厚度被确定为最优值；若切片过厚，非特异性结合将增加，从而难以分辨放射性配体与其靶点的结合信号；若切片过薄，则难以在无变形的情况下连续切取并保存连续切片。最佳切割温度因组织性质和切片厚度而异，通常需通过经验确定。当刀片与组织接触后，可检查样本方向，并通过将组织样本从刀片处轻微后移并重新调整包埋球的方向进行校正。在切割啮齿类动物脑组织时，必须确保脑左右两侧处于相同的前-后坐标位置，且背-腹轴与常用脑图谱的坐标系垂直。载玻片组需预先标记，以便对组织的相邻切片进行研究。前五张载玻片标记为 1-1、1-2、1-3、1-4 和 1-5。第一张切下的切片置于 1-1 载玻片的左上角（当磨砂面向下时，此位置为载玻片的右上角）；第二张切片置于 1-2 载玻片上， 等等。 第五个切片置于1-5号载玻片上。第六个切片置于1-1.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
500 ml 塑料烧杯	Fisher	02-591-30
24 mm x 60 mm 盖玻片	Fisher	22-050-25
放射自显影成像胶片 24 mm × 30 cm	Carestream-Biomax MR 胶片	891-2560
杆菌肽（源自地衣芽孢杆菌）	Sigma	B-0125
8 x 11 纸板片	新月形插图板 #201	201
考普林罐	Fisher Scientific	E94
商用吹风机	Conair	Model SD6X
一次性培养管	Fisher	14-961-26
EDTA（二钠盐，二水合物）	USB公司	15-699
乙醇	Fisher	16-100-210
D-19显影液的配方替代品	Photographers Formulary, Inc.	01-0036
冰醋酸	Fisher	A38 SI-212
Histoprep/OCT	Fisher	SH75-125D
显影定影液	柯达	5160320
光漂白	柯达	1464502
氯沙坦	Fisher/Tocris	37-985-0
MCID™ Core 7.0	MCID	N/A
NaCl	Fisher	S271
Peel-A-Way 切片夹	VWR	48440-003
佩尔蒙特	Fisher	SP15-100
PD123319	Fisher	13-615-0
优质带电载玻片，精细磨边	首映显微镜载玻片	9308W
125I 配体	Perkin Elmer	NEX-248
125SI-Ang II	乔治·华盛顿大学	由 Speth 博士进行放射性碘标记
幻灯片邮寄袋	Fisher Scientific	HS15986
无水磷酸氢二钠（Na2PO4	Fisher	RDCS0750500
乙酸钠（无水）	Fisher	BP333-500
硫堇	Fisher	T409-25
X射线暗盒（10 x 12）	Spectronics 公司	四格法
二甲苯	Fisher	X3P-1GAL