需要JoVE订阅才能观看此内容。 请登录或开始免费试用

方法文章

血管紧张素II受体定位可视化的受体放射自显影实验方案

17.5K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/53866

⸱

2016年6月7日

 ,  ,  , 
1Farquhar College of Arts and Sciences, Nova Southeastern University, 2Department of Pharmaceutical Sciences, College of Pharmacy, Nova Southeastern University, 3School of Medicine, University of Colorado

本文内容

摘要

本文介绍了一种通过定量、密度测定法、体外受体放射自显影技术，使用碘-125标记的血管紧张素II类似物，来描述血管紧张素II 1型受体在大鼠脑内定位的实验方案。

摘要

本方案描述了使用特异性放射性配体对大鼠脑内血管紧张素II（Ang II）受体进行受体自显影定位，以研究Ang II在大鼠脑中的受体结合模式。

采集组织样本并保存于 -80 °C。使用冷冻切片机对组织（脑组织）进行冠状切片，并将切片 thaw-mount 到带电荷的载玻片上。将载玻片上的组织切片与 125I-SI-Ang II 孵育，以放射性标记 Ang II 受体。相邻的载玻片分为两组：一组用于检测“非特异性结合”（NSP），在含有受体饱和浓度的非放射性标记 Ang II 或 AT1 Ang II 受体亚型（AT1R）选择性拮抗剂的条件下进行；另一组用于检测“总结合”（total binding），不添加 AT1R 拮抗剂。在孵育缓冲液中同时加入饱和浓度的 AT2 Ang II 受体亚型（AT2R）拮抗剂（PD123319，10 µM），以限制 125I-SI-Ang II 仅与 AT1R 亚型结合。在约 22 °C 下进行 30 分钟预孵育，NSP 组载玻片暴露于 10 µM PD123319 和氯沙坦（losartan），而“总结合”组载玻片仅暴露于 10 µM PD123319。随后，载玻片在含有 PD123319 的缓冲液中与 125I-SI-Ang II 孵育用于“总结合”检测，或在含有 PD123319 和氯沙坦的缓冲液中孵育用于 NSP 检测，之后用缓冲液多次“洗涤”，再用水冲洗以去除盐分和非特异性结合的放射性配体。载玻片经吹干后，置于专用胶片和暗盒中进行放射自显影。胶片显影后，图像被扫描进入计算机，使用专有成像系统和电子表格软件进行可视化及定量密度分析。另设一组载玻片进行硫堇染色，用于组织学比较。

使用受体放射自显影技术的优势在于能够可视化血管紧张素II受体 原位在组织标本的某一区域中，通过与相邻的组织学参考切片进行比较，解剖学上识别该组织区域。

引言

心血管疾病仍然是美国死亡和残疾的首要原因，2011年导致了美国超过30%的死亡病例1。美国心脏协会的最新统计数据显示，超过三分之一的美国人患有一种或多种类型的心血管疾病。心血管研究在深入理解该疾病方面持续取得进展，但随着人口老龄化加剧，继续推进这些研究工作显得尤为迫切。肾素-血管紧张素系统（RAS）在心血管系统的调节中起着核心作用，主要通过促进动脉粥样硬化、炎症反应、全身性血管收缩以及交感神经系统的激活来发挥作用（图1）2-8。

肾素-血管紧张素系统（RAS）是一种激素系统，当肾脏的球旁细胞在血压降低、交感神经刺激增强或致密斑处钠离子流量减少的情况下向血液中分泌肾素时，该系统即被激活。肾素将由肝脏合成的血管紧张素原代谢为血管紧张素I（Ang I）。随后，Ang I被主要存在于肺部和肾脏血管内皮细胞管腔侧的膜外酶——血管紧张素转换酶（ACE）进一步代谢，生成RAS的主要效应肽血管紧张素II（Ang II）。Ang II能够激活两种受体亚型：1型受体（AT1R）和2型受体（AT2R），二者均参与调节心血管系统、维持体液和电解质稳态，目前也被认为影响认知功能及神经退行性疾病过程8,9。已有研究报道，脑内存在一个局部的、脑特异性的RAS，可独立合成Ang II。在脑组织中，前体蛋白血管紧张素原由星形胶质细胞合成10，经一种类似肾素的酶3（可能是与前肾素受体结合的前肾素）转化为Ang I11，再由在脑内神经元细胞外表面高表达的血管紧张素转换酶转化为Ang II12。这种脑内生成的Ang II是脑内AT1和AT2受体的激动剂，这些受体与血液中的Ang II相互隔离。

尽管AT1R具有重要的生理功能，但它更为人所知的是在全身范围内的病理生理作用，主要影响心血管系统和肾脏（图2）。当血管紧张素II（Ang II）与AT1R结合时，会引起血管收缩，增加血流阻力并升高血压。此外，它还能促进醛固酮和血管加压素的合成与分泌，导致钠和水的重吸收增加。这些效应还可能诱发缺血性脑损伤和认知功能障碍，并与帕金森病、阿尔茨海默病、糖尿病相关，且最近被发现会影响学习和记忆能力13-15。肾素-血管紧张素系统（RAS）中存在一个反馈环路，即肾脏内球旁细胞上的AT1R可抑制肾素的分泌。有趣的是，AT2R通常对AT1R的作用起负向调节作用，引起血管舒张、神经突起生长、轴突再生、抗增殖以及神经保护等多种效应16-20。AT2R还被确认为抗高血压药物的作用靶点，最近也被发现是抗癌药物的潜在靶点21。通过定量密度测定受体放射自显影技术，确定血管紧张素II受体在不同组织中的定位和密度，以及各种治疗干预和疾病状态下对其的影响，将有助于揭示RAS在特定疾病中所起的作用。

受体放射自显影技术已被用作一种有效方法超过30年，用于在多种实验条件下指示血管紧张素II受体及其他肾素-血管紧张素系统（RAS）组分在大鼠、小鼠、豚鼠、狗及人类的脑组织和其他组织中的存在22-34。定位脑内Ang II受体的重要性在于，可将功能神经解剖学应用于Ang II在脑内的作用，例如，下丘脑室旁核（PVN）中AT1R的存在提示Ang II在脑内具有刺激加压素、催产素或促肾上腺皮质激素释放激素（CRH）释放，或激活交感神经系统的作用。因此，阻断AT1R的药物可能减轻与脑内RAS过度激活相关的某些由PVN介导的效应。正在进行的研究表明，使用AT1R拮抗剂可减少创伤后应激障碍（PTSD）诱导的CRH释放，并改善PTSD症状（Hurt et al.，已投稿待发表）。本示范性研究的目标区域包括在调节稳态、食欲/渴觉、睡眠、记忆和情绪反应中起重要作用的室旁核（PVN）、穹窿下器官（SFO）和杏仁核。这些区域通过在显微镜载玻片上收集脑的冠状切片，并用特异性抑制剂与针对Ang II受体的特异性放射性配体共同处理切片进行检测。本研究中列出了所有材料和试剂以及建议的供应商，使用碘-125对Ang II受体拮抗剂——1- sarcosine1, 8-异亮氨酸8 Ang II（SI Ang II）进行放射性标记，随后通过高效液相色谱法（HPLC）纯化为单碘125I-SI Ang II，方法如前所述35。使用这种高比活性的放射性配体，可在放射性标记切片曝光于X光胶片后，可视化受体密度低、中等及高的区域。通过使用含有已知量碘-125的脑组织糊标准品对胶片进行校准，可定量特定区域中Ang II受体结合的精确量。在实验研究中，可将实验组受试者脑内的Ang II受体结合水平与对照组受试者进行比较，从而判断Ang II的作用是否因遗传状况、表型异常、疾病状态或药物处理而发生改变。这些知识可进一步应用于开发治疗与RAS失调相关疾病的疗法。另一种可识别受体结合位点但解剖分辨率较低的技术是结合实验，该方法使用来源于组织匀浆的组织膜制备物，将其与放射性配体在一系列浓度下孵育，以评估放射性配体的结合亲和力（解离常数KD）和组织的最大结合容量（Bmax）。

本文所述方案可分为五个主要部分：受体放射自显影组织切片制备；受体放射自显影；胶片曝光与显影；组织学染色；以及密度计量图像分析。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

方案

本研究中进行的所有动物实验均经诺瓦东南大学机构动物护理和使用委员会批准，符合《实验动物护理与使用指南》第8版的要求。th （美国国家科学院出版社，华盛顿特区，2011年版）

1. 受体放射自显影组织切片的制备

  1. 处死后立即采集新鲜脑组织，用铝箔包裹，并尽快放入 -20 °C 冰箱中。为保持脑组织的正确形态，可将脑组织置于模拟颅腔内部结构的脑模中，再用铝箔包裹，放入 -20 °C 冰箱。30 分钟后，将组织转移至可密封的冷冻储存袋中，并移至 -80 °C 冰箱进行长期保存。
    1. 从 -80 °C 冰箱中取出所需的新鲜冷冻组织样本，转移至设定温度为 -10 °C 至 -18 °C 的冷冻切片机中，以避免样本解冻。
    2. 将样本置于组织托上，使用基于乙二醇和树脂的包埋介质，仅将样本的一小部分嵌入介质中。对于脑组织，应将脑垂直固定，以便进行冠状面切片。
  2. 将组织托安装在冷冻切片机内的切片机上，并牢固固定。确保脑组织的左右两侧处于相同的前后坐标位置，且背腹轴方向与常用脑图谱的坐标系垂直。
  3. 开始以所需厚度（推荐 20 µm）进行切片，并将切片以垂直方向贴附于载玻片上，以在载玻片上获得更大的可用空间。将切片按连续顺序每五张为一组收集到载玻片上，即第一组载玻片标记为 1-1、1-2、1-3、1-4 和 1-5（图 3）。
  4. 完成一组载玻片的收集后，让载玻片在空气中干燥最多 1 小时，然后将载玻片放入塑料玻片盒中，再将盒子装入自封式冷冻储存袋，于 -20 °C 保存。

2. 受体放射自显影

警告：放射性物质。操作时需穿戴防护装备以处理放射性物质。废弃物处置须根据所在机构的规定进行，必须遵循相关指南，通过适当衰变（半衰期为60天）或由有资质的公司回收处理。 

  1. 从 -20 °C 冰箱中取出所需的 "-1" 和 "-2" 载玻片，装入载玻片夹中（图 5）。将 "-1" 载玻片组合用于“非特异性”处理，"-2" 载玻片用于“总量”处理。“非特异性”染色缸中将含有 10 µM 终浓度的 PD123319（AT2R 拮抗剂）和 losartan（AT1R 拮抗剂）溶于测定缓冲液（AM5）中（表 1），“总量”结合染色缸中仅含 10 µM PD123319 溶于 AM5 中。
  2. 将载玻片夹倒置，使载玻片浸入已装有 35–40 ml AM5 缓冲液及相应抑制剂的预孵育 Coplin 染色缸中，在室温下孵育 30 分钟。后续各组在预孵育水浴中每隔 4 分钟依次开始。
  3. 将载玻片立即从预孵育溶液转移至孵育载玻片邮寄盒中，其中含有 10 ml AM5 缓冲液，以及预定浓度的 125I-SI-Ang II（计算方法见 图 4）和相应的抑制剂，在室温下孵育 60–90 分钟。若放射性配体充足，可将 10 张载玻片（背对背）放入改良的载玻片夹中，并在 Coplin 染色缸中用 125I-SI-Ang II 进行孵育。
  4. 将载玻片重新放回载玻片夹中（如需要），吸干并轻轻晃动，在两个独立容器中各用 400 ml 去离子水冲洗 1–2 秒。
  5. 将载玻片依次转移至四个装有 35–40 ml AM5 缓冲液的 Coplin 染色缸中，每缸准确冲洗 1 分钟（如 图 4 所示）。
  6. 最后一次 1 分钟冲洗后，将切片在四次更换的冰冻去离子水中轻轻晃动 1–2 秒。
  7. 使用从不同角度设置的四个吹风机，以冷风（注意：热风会使放射性化合物挥发）吹干载玻片 4 分钟（图 5），直至所有切片完全干燥，然后将其放置在纸巾上。
  8. 用双面胶带将组织面朝上的载玻片固定在硬纸板上，用于与 X 射线胶片贴片曝光。
  9. 在每块硬纸板上至少固定一个 125I 碘校准标准品载玻片（图 6）。
    注：校准标准品由脑组织匀浆与结合了 125I 碘的含酚环化合物充分混合后，通过离心在 1 ml 结核菌素注射器中压制成型，再使用冷冻切片机切片至与脑组织切片相同厚度，并贴附于载玻片上。或者，也可商业购买以塑料树脂包埋并切成 20 µm 厚度的 125I 校准标准品。此类标准品中的塑料树脂会部分屏蔽辐射，因此在校准中应考虑约 40% 的组织等效性。

3. 薄膜曝光与显影

  1. 进入暗室，携带一个带背带的X射线片盒和放射自显影胶片。打开片盒，将载有切片的纸板放入其中（图6）。
    1. 关闭室内灯光，打开安全灯。小心打开X射线胶片盒，取出一张胶片，将光面朝上（锯齿边位于右下角）放置在片盒内的切片上方。仔细合上片盒，并旋转锁紧杆以确保完全避光（图6）。在-20 °C条件下曝光数天至数周。
  2. 在暗室中打开片盒，开始进行胶片显影。
    1. 依次将胶片放入各托盘中：显影液中2分钟，含5%冰醋酸的水中30秒，定影液中5分钟。随后将胶片置于流动水中的托盘内清洗20分钟，再放入Photoflo溶液中不超过10秒，取出后悬挂晾干。
      注意：曝光时间需通过实验经验确定，可能需要使用多张胶片进行不同时间的曝光：时间应足够长以检测到低结合区域的可测量信号，但又不能过长导致高结合区域使胶片饱和。一旦获得理想的曝光结果，即可进行下一步操作。

4. 组织学

  1. 制备天青素染色液及染色试剂（表2，图7）。
    1. 将"-3"载玻片放入载片架中，依次转移至去离子水中浸泡1 min，随后放入天青素染色液中染色10 min，再在去离子水中浸洗三次，最后用去离子水冲洗30秒。
    2. 水洗后，将载片架依次浸入乙醇中洗涤：50%、70%和90%乙醇各30秒，随后在100%乙醇中洗涤两次，每次1分钟。最后将载片架放入二甲苯中3分钟，再转移至第二份二甲苯溶液中5分钟。
  2. 从最后一个二甲苯浴中逐个取出载玻片，用含有机溶剂的树脂封片剂覆盖载玻片上缘，然后将24 mm × 60 mm的盖玻片盖在载玻片上。让载玻片充分干燥约48小时，随后以2,400 dpi的灰度模式扫描入计算机。

5. 密度测定图像分析

  1. 将胶片有光泽的一面朝下放置，锯齿状边缘位于左下角，使用专有扫描仪进行扫描，确保将胶片密度信息传输至成像系统计算机时，图像无任何失真。
  2. 打开专有成像系统，利用校准条建立校准标准，用于后续对胶片上图像的密度分析（图9-12）。
  3. 通过建立模板或手动勾画感兴趣区域来测量目标区域。数据按胶片（对照或野生型（切片））及区域分别收集和分类。测量时需包含密度（fmol/g）、扫描面积和总目标面积（图9）。
    1. 调整扫描区域标尺，确保感兴趣区域位于高亮显示的参数范围内（图10）。
    2. 将数据导出至电子表格（表4）。将密度乘以总目标面积，再除以扫描面积，以获得该特定区域的结合值。对所有测量值完成此计算后，用总结合值减去已确定的非特异性结合值，得到特异性结合值。也可对这些数值进行平均处理。

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

结果

肾素-血管紧张素系统代谢途径的概览如下所示 图1 以及对血管紧张素II受体亚型（AT1R 和 AT2R）的描述见于 图2. 图3 展示将冠状面脑切片转移至显微镜载玻片的过程，随后使用预设的受体放射自显影步骤进行处理 125I-SIAng II 浓度如图所示 图4. 图5 展示受体放射自显影中载玻片的干燥步骤，随后将其固定在纸板上，如图所示 图6， 随后进行发育。 表 2 列出用于载玻片组织切片硫堇染色步骤的试剂，该切片如文中所述 图7定量所用的校准标准单位根据检测日期确定，如图所示。 表3. 图8 显示建立标准曲线以关联 125I浓度（fmol/g组织）与胶片曝光（相对光密度）之间的关...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

讨论

所述方案旨在对先前采集并储存在 -80 °C 的啮齿类动物脑冠状切片的相邻切片中，放射性配体的“总结合”与“非特异性结合”进行可视化观察，该方法可广泛适用于几乎所有具有解剖学上可分辨亚结构且表达不同数量受体或放射性配体结合位点的组织。本方案所描述的操作步骤简便，而分析过程对于正确解读实验结果至关重要。20 µm 的切片厚度被确定为最优值；若切片过厚，非特异性结合将增加，从而难以分辨放射性配体与其靶点的结合信号；若切片过薄，则难以在无变形的情况下连续切取并保存连续切片。最佳切割温度因组织性质和切片厚度而异，通常需通过经验确定。当刀片与组织接触后，可检查样本方向，并通过将组织样本从刀片处轻微后移并重新调整包埋球的方向进行校正。在切割啮齿类动物脑组织时，必须确保脑左右两侧处于相同的前-后坐标位置，且背-腹轴与常用脑图谱的坐标系垂直。载玻片组需预先标记，以便对组织的相邻切片进行研究。前五张载玻片标记为 1-1、1-2、1-3、1-4 和 1-5。第一张切下的切片置于 1-1 载玻片的左上角（当磨砂面向下时，此位置为载玻片的右上角）；第二张切片置于 1-2 载玻片上， 等等。 第五个切片置于1-5号载玻片上。第六个切片置于1-1...

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

披露

Robert Speth 已将血管紧张素 II 受体的抗体授权给一家商业供应商，并从这些抗体的销售中获得专利使用费。其他作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作由美国国立卫生研究院（NIH）资助项目HL-113905支持

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
500 ml 塑料烧杯Fisher02-591-30
24 mm x 60 mm 盖玻片Fisher22-050-25
放射自显影成像胶片 24 mm × 30 cmCarestream-Biomax MR 胶片891-2560
杆菌肽（源自地衣芽孢杆菌）SigmaB-0125
8 x 11 纸板片新月形插图板 #201201
考普林罐Fisher ScientificE94
商用吹风机ConairModel SD6X
一次性培养管Fisher14-961-26
EDTA（二钠盐，二水合物）USB公司15-699
乙醇Fisher16-100-210 
D-19显影液的配方替代品Photographers Formulary, Inc. 01-0036
冰醋酸FisherA38 SI-212
Histoprep/OCTFisherSH75-125D
显影定影液柯达5160320
光漂白柯达1464502
氯沙坦Fisher/Tocris37-985-0
MCID™ Core 7.0MCIDN/A
NaClFisherS271
Peel-A-Way 切片夹VWR48440-003
佩尔蒙特FisherSP15-100
PD123319Fisher13-615-0
优质带电载玻片，精细磨边首映显微镜载玻片9308W
125I 配体Perkin ElmerNEX-248
125SI-Ang II 乔治·华盛顿大学由 Speth 博士进行放射性碘标记
幻灯片邮寄袋Fisher ScientificHS15986
无水磷酸氢二钠（Na2PO4FisherRDCS0750500
乙酸钠（无水）FisherBP333-500
硫堇 FisherT409-25
X射线暗盒（10 x 12）Spectronics 公司四格法
二甲苯Fisher X3P-1GAL

参考文献

  1. Mozaffarian, D., et al. Heart disease and stroke statistics--2015 update: a report from the American Heart Association. Circulation. 131 (4), 29-322 (2015).
  2. Peart, W. S. The Renin-Angiotensin System. Pharmacol Rev. 17, 143-182 (1965).
  3. Ganten, D., et al. Angiotensin-forming enzyme in brain tissue. Science. 173 (3991), 64-65 (1971).
  4. Ganten, D., Fuxe, K., Phillips, M. I., Mann, J. F. E., Ganten, U. Frontiers in Neuroendocrinology. Ganong, W. F., Martini, L. , Raven Press. N.Y. Vol. 5 61-99 (1978).
  5. Fyhrquist, F., Metsarinne, K., Tikkanen, I. Role of angiotensin II in blood pressure regulation and in the pathophysiology of cardiovascular disorders. J Hum Hypertens. 9, Suppl 5 19-24 (1995).
  6. von Bohlenund und Halbach, O., Albrecht, D. The CNS renin-angiotensin system. Cell Tissue Res. 326 (2), 599-616 (2006).
  7. Speth, R., Giese, M. Update on the renin-angiotensin system. J Pharmacol Clin Toxicol. 1 (1), 1004(2013).
  8. de Kloet, A. D., Liu, M., Rodriguez, V., Krause, E. G., Sumners, C. Role of neurons and glia in the CNS actions of the renin-angiotensin system in cardiovascular control. Am J Physiol Regul Integr Comp Physiol. , (2015).
  9. Saavedra, J. M., Sanchez-Lemus, E., Benicky, J. Blockade of brain angiotensin II AT1 receptors ameliorates stress, anxiety, brain inflammation and ischemia: Therapeutic implications. Psychoneuroendocrinology. 36 (1), 1-18 (2011).
  10. Stornetta, R. L., Hawelu-Johnson, C. L., Guyenet, P. G., Lynch, K. R. Astrocytes synthesize angiotensinogen in brain. Science. 242, 1444-1446 (1988).
  11. Li, W., Peng, H., Seth, D. M., Feng, Y. The Prorenin and (Pro)renin Receptor: New Players in the Brain Renin-Angiotensin System. Int.J.Hypertens. 2012, 290635(2012).
  12. Strittmatter, S. M., Kapiloff, M. S., Snyder, S. H. [3H]captopril binding to membrane associated angiotensin converting enzyme. Biochem. Biophys. Res. Commun. 112, 1027-1033 (1983).
  13. Bild, W., Hritcu, L., Stefanescu, C., Ciobica, A. Inhibition of central angiotensin II enhances memory function and reduces oxidative stress status in rat hippocampus. Prog Neuropsychopharmacol Biol Psychiatry. 43, 79-88 (2013).
  14. Wright, J. W., Harding, J. W. Brain renin-angiotensin-A new look at an old system. Progress in Neurobiology. 95 (1), 49-67 (2011).
  15. Tashev, R., Stefanova, M. Hippocampal asymmetry in angiotensin II modulatory effects on learning and memory in rats. Acta Neurobiol Exp (Wars). 75 (1), 48-59 (2015).
  16. Reudelhuber, T. L. The continuing saga of the AT2 receptor: a case of the good, the bad, and the innocuous. Hypertension. 46 (6), 1261-1262 (2005).
  17. Carey, R. M. Cardiovascular and renal regulation by the angiotensin type 2 receptor: the AT2 receptor comes of age. Hypertension. 45 (5), 840-844 (2005).
  18. Valero-Esquitino, V., et al. Direct angiotensin type 2 receptor (AT2R) stimulation attenuates T-cell and microglia activation and prevents demyelination in experimental autoimmune encephalomyelitis in mice. Clin Sci (Lond). 128 (2), 95-109 (2015).
  19. Chen, J., et al. Neuronal over-expression of ACE2 protects brain from ischemia-induced damage. Neuropharmacology. 79, 550-558 (2014).
  20. Kalra, J., Prakash, A., Kumar, P., Majeed, A. B. Cerebroprotective effects of RAS inhibitors: Beyond their cardio-renal actions. J Renin Angiotensin Aldosterone Syst. , (2015).
  21. Zhao, Y., et al. Activation of intracellular angiotensin AT(2) receptors induces rapid cell death in human uterine leiomyosarcoma cells. Clin Sci (Lond). 128 (9), 567-578 (2015).
  22. Gehlert, D. R., Speth, R. C., Wamsley, J. K. Quantitative autoradiography of angiotensin II receptors in the SHR brain. Peptides. 7 (6), 1021-1027 (1986).
  23. Mendelsohn, F. A., Quirion, R., Saavedra, J. M., Aguilera, G., Catt, K. J. Autoradiographic localization of angiotensin II receptors in rat brain. Proc Natl Acad Sci U S A. 81 (5), 1575-1579 (1984).
  24. Gehlert, D. R., Speth, R. C., Wamsley, J. K. Autoradiographic localization of angiotensin II receptors in the rat brain and kidney. Eur J Pharmacol. 98 (1), 145-146 (1984).
  25. Speth, R. C., et al. Angiotensin II receptor localization in the canine CNS. Brain Res. 326 (1), 137-143 (1985).
  26. Santos, R. A. S., et al. Angiotensin-(1-7) is an endogenous ligand for the G protein-coupled receptor Mas. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (14), 8258-8263 (2003).
  27. Karamyan, V. T., Gembardt, F., Rabey, F. M., Walther, T., Speth, R. C. Characterization of the brain-specific non-AT(1), non-AT(2) angiotensin binding site in the mouse. Eur J Pharmacol. 590 (1-3), 87-92 (2008).
  28. Karamyan, V. T., Speth, R. C. Distribution of the non-AT1, non-AT2 angiotensin-binding site in the rat brain: preliminary characterization. Neuroendocrinology. 88 (4), 256-265 (2008).
  29. Karamyan, V. T., Stockmeier, C. A., Speth, R. C. Human brain contains a novel non-AT1, non-AT2 binding site for active angiotensin peptides. Life Sci. 83 (11-12), 421-425 (2008).
  30. Miller-Wing, A. V., et al. Central angiotensin IV binding sites: distribution and specificity in guinea pig brain. J Pharmacol Exp Ther. 266 (3), 1718-1726 (1993).
  31. Castren, E., Kurihara, M., Saavedra, J. M. Autoradiographic localization and characterization of angiotensin II binding sites in the spleen of rats and mice. Peptides. 8 (4), 737-742 (1987).
  32. MacGregor, D. P., et al. Angiotensin II receptor subtypes in the human central nervous system. Brain Res. 675 (1-2), 231-240 (1995).
  33. Plunkett, L. M., Correa, F. M. A., Saavedra, J. M. Quantitative autoradiographic determination of angiotensin-converting enzyme binding in rat pituitary and adrenal glands with 125I-351/A, a specific inhibitor. Regul Pept. 12, 263-272 (1985).
  34. Armando, I., et al. Increased angiotensin II AT(1) receptor expression in paraventricular nucleus and hypothalamic-pituitary-adrenal axis stimulation in AT(2) receptor gene disrupted mice. Neuroendocrinology. 76 (3), 137-147 (2002).
  35. Speth, R. C., Harding, J. W. Angiotensin Protocols Vol. 51 Methods in Molecular Medicine. Wang, D. H. , Humana Press. 275-295 (2001).
  36. Widdop, R. E., Jones, E. S., Hannan, R. E., Gaspari, T. A. Angiotensin AT2 receptors: cardiovascular hope or hype. Br J Pharmacol. 140 (5), 809-824 (2003).
  37. Michel, M. C., Wieland, T., Tsujimoto, G. How reliable are G-protein-coupled receptor antibodies. Naunyn Schmiedebergs Arch.Pharmacol. 379 (4), 385-388 (2009).
  38. Jensen, B. C., Swigart, P. M., Simpson, P. C. Ten commercial antibodies for alpha-1-adrenergic receptor subtypes are nonspecific. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 409-412 (2009).
  39. Jositsch, G., et al. Suitability of muscarinic acetylcholine receptor antibodies for immunohistochemistry evaluated on tissue sections of receptor gene-deficient mice. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 389-395 (2009).
  40. Hamdani, N., van der Velden, J. Lack of specificity of antibodies directed against human beta-adrenergic receptors. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 403-407 (2009).
  41. Bodei, S., Arrighi, N., Spano, P., Sigala, S. Should we be cautious on the use of commercially available antibodies to dopamine receptors. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 413-415 (2009).
  42. Lu, X., Bartfai, T. Analyzing the validity of GalR1 and GalR2 antibodies using knockout mice. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 417-420 (2009).
  43. Everaerts, W., et al. Where is TRPV1 expressed in the bladder, do we see the real channel. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 379 (4), 421-425 (2009).
  44. Adams, J. M., McCarthy, J. J., Stocker, S. D. Excess dietary salt alters angiotensinergic regulation of neurons in the rostral ventrolateral medulla. Hypertension. 52 (5), 932-937 (2008).
  45. Herrera, M., Sparks, M. A., Alfonso-Pecchio, A. R., Harrison-Bernard, L. M., Coffman, T. M. Lack of specificity of commercial antibodies leads to misidentification of Angiotensin type 1 receptor protein. Hypertension. 61 (1), 253-258 (2013).
  46. Rateri, D. L., et al. Endothelial Cell-Specific Deficiency of Ang II Type 1a Receptors Attenuates Ang II-Induced Ascending Aortic Aneurysms in LDL Receptor(-/-) Mice. Circ Res. 108 (5), 574-583 (2011).
  47. Benicky, J., Hafko, R., Sanchez-Lemus, E., Aguilera, G., Saavedra, J. M. Six Commercially Available Angiotensin II AT(1) Receptor Antibodies are Non-specific. Cell Mol Neurobiol. 32 (8), 1353-1365 (2012).
  48. Elliott, K. J., Kimura, K., Eguchi, S. Lack of specificity of commercial antibodies leads to misidentification of angiotensin type-1 receptor protein. Hypertension. 61 (4), 31(2013).
  49. Hafko, R., et al. Commercially available angiotensin II At(2) receptor antibodies are nonspecific. PLoS One. 8 (7), 69234(2013).
  50. Gonzalez, A. D., et al. Distribution of angiotensin type 1a receptor-containing cells in the brains of bacterial artificial chromosome transgenic mice. Neuroscience. 226, 489-509 (2012).

访问受限。请登录或开始试用以查看此内容。

重印与许可

标签

脑组织切片放射性配体结合实验非特异性结合总结合恒冷切片放射自显影胶片曝光硫堇组织学染色密度测定分析
血管紧张素II受体定位可视化的受体放射自显影实验方案
联系我们
向图书馆推荐

隐私政策

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。