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一种用于评估血管内皮生长因子的简易生物测定法

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DOI：

10.3791/53867

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2016年3月15日

 ,  ,  ,  , 
1Tumour Angiogenesis Program, Peter MacCallum Cancer Centre

本文内容

摘要

我们描述了一种简单的基于细胞的生物测定法，用于检测、定量和监测血管内皮生长因子配体家族成员的活性。该检测方法利用在因子依赖性细胞系中表达的嵌合受体，对配体介导的受体结合与交联提供半定量或定量评估。

摘要

血管生物学中受体酪氨酸激酶及其相互作用配体的分析常常具有挑战性，原因在于相关受体家族的组成型表达、多种相关的配体以及难以处理特化内皮细胞的原代培养。本文描述了一种用于检测血管内皮生长因子受体-2（VEGFR-2）配体的生物测定方法，VEGFR-2是促进血管生成和淋巴管生成信号转导的关键分子。我们将编码VEGFR-2胞外区（配体结合区）与促红细胞生成素受体（EpoR）跨膜区及胞质区融合蛋白的cDNA，导入依赖细胞因子生长的Ba/F3细胞系中进行表达。该细胞系在白细胞介素-3（IL-3）存在条件下生长，撤除IL-3后细胞将在24小时内死亡。表达VEGFR-2/EpoR融合受体后，当存在能够结合并交联该融合蛋白胞外部分的配体时，可为稳定转染的Ba/F3细胞提供一种替代性的存活乃至增殖机制即，一种能够交联 VEGFR-2 胞外区的配体）。该检测可采用两种方式进行：一种是半定量方法，使用少量配体和细胞，可在 24 小时内快速获得结果；另一种是定量方法，通过检测细胞活力数量的替代标志物进行分析。该检测操作相对简便，对已知的 VEGFR-2 配体具有高度响应性，并可兼容 VEGFR-2 信号通路的胞外抑制剂，例如针对受体或配体的单克隆抗体以及可溶性配体捕获剂。

引言

分泌型蛋白生长因子血管内皮生长因子（VEGF）家族及其相应的细胞表面受体是一类重要且多样化的可溶性配体和膜结合受体，分别在跨细胞膜信号转导中发挥功能。它们主要在内皮细胞中发挥作用，同时也存在于上皮来源的细胞以及免疫系统细胞中1,2。由配体激活的VEGF受体（VEGFRs）所介导的信号通路在多种重大疾病中具有关键作用，例如年龄相关性黄斑变性和癌症，目前已有靶向这些通路的治疗药物广泛应用于临床（如靶向VEGF-A的单克隆抗体贝伐珠单抗）3,4。

VEGF 家族的复杂性之一在于自然界中存在的多种可溶性配体（VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、副痘病毒家族 orf 编码的 VEGF 蛋白以及蛇毒 VEGF，此外还有 VEGF-A 的其他抑制性异构体）2。

这些配体与受体酪氨酸激酶家族中的三个成员相互作用，即 VEGFR-1、VEGFR-2 和 VEGFR-3。这些受体在不同类型的细胞上表达程度各异，但通常共同表达于所有大小的血管和淋巴管内壁的内皮细胞表面5。VEGFR-2 可结合哺乳动物配体 VEGF-A6、VEGF-C7 和 VEGF-D8,9，以及 orf 病毒 VEGF10 和蛇毒 VEGF11。VEGFR-2 在胚胎发育、伤口愈合、癌症和眼病等过程中促进血管生成（即从已有血管生长出新血管）中发挥主要作用。在这些情况下，VEGF-A、-C 和 -D 等配体结合并激活血管内皮细胞上的该受体12-15。在淋巴管内皮细胞上，VEGFR-2 参与淋巴管生成，即新淋巴管的形成16。VEGFR-2 还可在健康组织和疾病状态下促进主要动脉和淋巴管的扩张和延伸17。因此，全面理解 VEGFR-2 与配体之间的相互作用，对于开发用于治疗依赖血管生成疾病的抑制剂具有重要意义18。尽管大多数 VEGF-A 亚型均可结合 VEGFR-2，但 VEGF-C 和 VEGF-D 需经蛋白水解切割，释放出包含 VEGF 同源结构域的片段，才能以高亲和力结合 VEGFR-219,20。

我们开发了一种用于监测 VEGFR-2 配体的生物测定方法，该方法旨在避免使用原代内皮细胞。原代内皮细胞在技术上难以传代，购买和培养成本高昂（需要特殊培养基）21，并且表达多种 VEGFR 及其相关共受体22。当旨在研究受体与配体之间的二元相互作用、评估特定受体介导的活性或检测抑制性试剂的作用时，VEGFR-2 与其他 VEGF 受体或共受体之间的异源二聚化可能带来不必要的复杂性23。该生物测定方法保留了相关受体在细胞膜上的流动性，可评估配体结合并交联 VEGFR-2 胞外区的能力。

该生物测定依赖于构建一种嵌合受体，其中血管内皮生长因子受体（VEGF受体）的胞外区域（此处为VEGFR-2）与促红细胞生成素受体（EpoR）的跨膜区和胞内区融合，而EpoR属于细胞因子受体家族8,24。该融合蛋白随后在依赖生长因子的前B细胞系Ba/F3中表达；当有配体能够结合并交联该受体的胞外结构域时，即可激活其胞质效应区域，后者可通过Janus激酶（JAKs）传导存活信号，从而促进细胞存活和/或增殖。相比之下，在相同细胞类型中表达全长VEGFR-2并给予配体刺激，则不能促进细胞存活与增殖，表明该细胞类型中缺乏VEGFR-2信号通路的近端信号效应分子。

我们已在多种情境下应用该检测方法，以研究新型 VEGFR-2 配体的结合特性10,19,20,24-29。结合 VEGFR-3-EpoR-Ba/F3 检测法，我们比较了 VEGF-C 和 VEGF-D 生长因子在结合及交联 VEGFR-2 与 VEGFR-3 方面的相对活性30。该检测方法已被用于表征抗 VEGFR-2 或抗 VEGF-D 的中和性单克隆抗体、可溶性 VEGFR-2 捕获剂以及靶向 VEGF 家族的肽模拟物的抑制活性31。此外，该检测还用于评估不同 orf 病毒株来源的 VEGF 与 VEGFR-2 结合并使其交联的能力，从而在进入原代内皮细胞实验前进行初步验证10,26。该检测方法特别适用于对 VEGF 突变体进行快速筛选，可在将其引入更为繁琐的内皮细胞检测25或评估生长因子纯化方案27之前，迅速判断其活性。

我们所描述的检测方法易于操作，其半定量版本可用于快速测定，在监测生长因子、抗体或可溶性受体结构域的制备或纯化过程中，这类测定有时是必需的。该检测方法操作简便，可作为针对特定组织或器官系统来源的血液或淋巴管原代内皮细胞进行更深入和更全面研究的理想补充。

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方案

IL-3 的来源及 WEHI-3D 条件培养基的制备

注意：培养小鼠粒细胞性白血病细胞系 WEHI-3D，以生成含有 IL-3 的条件培养基。

  1. 在杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中培养 WEHI-3D 细胞，添加 10% 胎牛血清（FBS）、1% 长效谷氨酰胺补充剂和 50 μg/ml 庆大霉素。将处于对数生长期的 5 × 106 个细胞接种至 T175 cm3 培养瓶中的 50 ml 新鲜培养基中，培养约 7 天，或直至细胞生长对数期过后 24–48 小时（避免培养物中出现大量细胞死亡）。条件培养基可在 −20 °C 下保存多年，因此可一次性制备 200–500 ml 的批次。
  2. 将培养瓶中的液体和细胞倾出，以 1,000 × g 离心 15 分钟以去除细胞及细胞碎片。弃去上层 90% 的上清液，剩余液体经 0.22 μm 滤器过滤。
  3. 将 WEHI-3D 条件培养基（CM）分装为 1 ml、50 ml 和 200 ml 等不同体积，于 −20 °C 或 −70 °C 保存。小体积分装适用于实验前准备，中等体积用于因子依赖性细胞系传代培养基的配制，大体积则适合长期储存。IL-3 在 4 °C 下相对稳定，因此在无菌条件下使用时，解冻后的培养基可保存数周。
  4. 或者，可将重组小鼠 IL-3 以 50 ng/ml 的终浓度稀释至培养基中使用，使用前需经 0.22 µm 滤器过滤。

2. VEGFR-2-EpoR-Ba/F3 细胞系及对照 Ba/F3 细胞系的培养与评估

  1. 在DMEM培养基中培养Ba/F3细胞，添加10% FBS、50 µg/ml庆大霉素或青霉素/链霉素、1%稳定型L-谷氨酰胺和10% WEHI-3D-CM。每约三天将处于对数生长期的细胞按1:15比例传代。
  2. 在DMEM培养基中培养VEGFR2-EpoR-Ba/F3细胞，添加10% FBS、50 µg/ml庆大霉素、1%稳定型L-谷氨酰胺、10% WEHI-3D-CM和1 mg/ml G418。取对数生长期细胞，按1:15比例传代。参见 24 有关嵌合受体构建与表达的更多细节。
  3. 从对数中期培养物中收获 Ba/F3 或 VEGFR2-EpoR-Ba/F3 细胞。轻轻吹打，使这些非贴壁细胞从培养瓶底部脱落。用鼠等渗磷酸盐缓冲液（pH 7.3，PBS）洗涤三次（每次 10 ml，750 × g 离心） g 5 分钟，以回收细胞沉淀），去除含有 IL-3 的培养基。
  4. 用不含WEHI-3D-CM或重组IL-3的DMEM及添加剂洗涤细胞一次，然后将细胞重悬于该培养基中，浓度为7.4 × 104 细胞/毫升（即， 每13.5 µl含1,000个细胞；每135 µl含10,000个细胞，通过血细胞计数板计数确定，分别用于该检测的半定量或定量版本。
  5. 通过台盼蓝排斥法检测细胞活力（注意）。将台盼蓝与 PBS（0.4%）按 1:1 比例与细胞悬液混合，在血细胞计数板上至少计数 100 个细胞。能够摄取染料的细胞视为死亡或即将死亡。进行实验前，细胞活力须高于 98%。

3. 半定量分析

  1. 将洗涤后的细胞（1,000 个细胞）重悬于 13.5 μl 不含 IL-3 的培养基中，在室温下加入 72 孔微孔板的各孔。分装过程中需注意混匀细胞悬液，以避免细胞因重力沉降导致浓度不均。使用校准准确的 P20 自动移液器及经高压灭菌的吸头。
  2. 使用校准的P20移液器或更优的P2移液器，将待测样本和对照加入孔板中，体积为10%（1.5 μl），最终体积为15 µl，每孔含1,000个细胞。需注意确保样本在pH、盐分及其他潜在细胞毒性或细胞抑制性物质方面与Ba/F3细胞的培养条件相容。在可能的情况下，使用相容的培养基或缓冲液（例如， 分别用DMEM或PBS，或在上述培养基或缓冲液中稀释。使用同一枪头反复吹打可确保混匀。
  3. 对照样品应包括：(i) 不含IL-3的培养基；(ii) 将WEHI-3BD-CM以10%终体积加入不含IL-3的培养基；和/或 (iii) 将VEGF-A用不含IL-3的培养基稀释至100 ng/ml。
  4. 在微孔板的未使用孔中加入无菌水、PBS 或培养基，并将微孔板置于加湿容器内（容器内放置浸水的纸巾），允许气体交换。将细胞在加湿环境中，于 10% CO₂ 培养箱中孵育。2如果测试样品和培养基成分已备妥，一个人可在3小时内轻松完成该检测的设置。
  5. 通常在培养16小时后观察平板，此时阳性与阴性样本之间的差异已明显可见。参见 图3 参见培养细胞的形态示例。使用标准倒置相差显微镜在40−100×放大倍数下观察培养板。
    注意：含有支持性生长因子（如 IL-3 或 VEGF-A）的孔中将含有呈圆形且透明的细胞。不含支持性生长因子或仅含培养基的孔中，圆形细胞数量较少，并可见死亡或濒死细胞及细胞碎片（例如 图3C孵育后24−48小时进行检测可获得最佳灵敏度。

4. 定量生物测定

  1. 在室温下，将洗涤后的细胞（10,000 个细胞，135 μl）加入至标准的 96 孔微孔板的各孔中，使用 IL-3 缺乏的培养基。分装过程中需注意混匀细胞悬液，以确保重力沉降不会影响细胞浓度。
  2. 使用校准的移液器（P20）向各孔中加入测试样品和对照，体积为 10%（15 μl）。需注意确保样品在 pH、盐分或其他潜在细胞毒性/细胞抑制性物质方面与 Ba/F3 细胞的培养条件相容。尽可能使用相容的培养基或缓冲液（例如，DMEM 或 PBS），或在该类培养基或缓冲液中进行稀释。使用 0.22 µm 孔径的醋酸纤维素离心管滤器对小体积液体进行过滤除菌。
  3. 将细胞、生长因子和/或抑制剂的混合物置于含 10% CO2 的湿润环境中孵育 48 小时。实验应在内含浸水滤纸并允许气体交换的湿润容器中进行。孵育结束后，采用下述替代方法之一检测，这些方法均为反映孔中活细胞数量的替代性指标。
  4. 替代方法#1：3H-胸苷掺入法
    注意：该定量方法适用于 96 孔板格式。
    1. 在实验板于 37 °C 孵育 48 小时后（每孔 150 µl 体积），向每孔加入 50 µl 含 3H-胸苷的培养基（不含 IL-3/WEHI-3D CM 的 Ba/F3 培养基），终浓度为 20 µCi/ml，使每孔最终剂量为 1 µCi。
    2. 继续在 37 °C 孵育 4 小时，随后使用细胞收集器收获细胞。将滤膜置于闪烁液中提取各样品，并使用液体闪烁计数器进行定量。
  5. 替代方法#2：细胞 ATP 的生物发光检测
    注意：该方法使用一种 ATP 检测试剂，当其与细胞裂解液混合时可产生反映群体中活细胞数量的生物发光信号。
    1. 裂解细胞以提取 ATP，并根据制造商说明书使用 ATP 检测试剂生成发光信号。使用适用于 96 孔板格式的发光检测仪读取发光值。
  6. 替代方法#3：活细胞对指示染料的酶促还原
    注意：基于刃天青（resazurin）的检测方法与细胞活力具有良好相关性。
    1. 将培养的细胞与基于刃天青的染料混合，并根据制造商说明书使用荧光酶标仪对检测结果进行定量。

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结果

在本节中，我们展示了验证VEGFR-2-EpoR-Ba/F3生物测定法关键特性的实验结果（测定原理见图1）。其他已发表的研究表明，该测定法还可广泛应用于其他VEGFR-2配体、突变型VEGF分子以及抑制性单克隆抗体8,10,19,24-30。

本文展示的数据来自一项检测实验，该实验采用 VEGFR-2-EpoR-Ba/F3 生物学检测法，在存在抗 VEGF-A165 的抑制性单克隆抗体（贝伐珠单抗）的条件下，定量分析三种重组人源配体（VEGF-A165、VEGF-C 和 VEGF-D）对 VEGFR-2 的特异性活性。数据已相对于仅使用 VEGF-A165 刺激的反应进行了归一化处理（图 2）。正如预期，贝伐珠单抗在实验中阻断了 VEGF-A165 的作用，但对 VEGF-C ...

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讨论

本实验方法依赖于使用高活力且依赖生长因子的细胞。因此，必须仔细培养细胞，以确保其具有因子依赖性，并维持嵌合受体的表达。确保培养基新鲜配制、未长期存放，以及 WEHI-3D 条件培养基具有高活性，均至关重要。在将细胞从含有 IL-3 的培养基转移至检测培养基时，必须充分洗涤，以避免残留的 IL-3 在加入挽救性配体时对检测造成污染。由于配体可能以多种不同形式存在，在制备用于检测的配体时需格外注意。防腐剂、抗菌剂、不同 pH 的盐类或缓冲液均可能影响检测结果，因此平行检测未转染的 Ba/F3 细胞有助于判断是否存在缓冲液相关的问题。

我们同时采用半定量和定量两种实验方案。半定量检测可在进行耗时较长且需要更多样本的完全定量检测之前，快速评估样品的活性。在生成用于发表的数据时，则 exclusively 使用定量方法。检测细胞培养物活力的替代方法相对简单直接。定量检测方法已被改进并适用于多种不同的增殖定量形式，我们已成功使用了（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐） MTT 30、细胞ATP的生物发光检测法（未...

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披露

Steven A. Stacker 和 Marc M. Achen 是 Circadian Technologies Ltd. 的股东，该公司致力于通过靶向 VEGF 生长因子家族来开发治疗药物。

致谢

SAS 和 MGA 得到澳大利亚国家健康与医学研究理事会（NHMRC）的项目资助、项目计划资助和研究基金以及澳大利亚维多利亚州政府提供的运营基础设施支持计划资金的支持。MMH 获得彼得·麦卡勒姆基金会资助的支持。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
台盼蓝Sigma-AldrichT8154使用PBS配制的0.4%溶液，按1:1比例与细胞悬液混合，用于测定活细胞数量。危险性——可能致癌
G418硫酸盐（遗传霉素）Invivogenant-gn-5用于筛选转染的真核细胞。危险性——可能引起过敏或哮喘症状或呼吸困难
3H-胸苷PerkinElmerNET-027该放射性核苷在有丝分裂期间被整合入染色体DNA中。危险性——放射性
Vialight Plus试剂盒LonzaLT07-221利用ATP监测试剂通过生物发光法检测细胞内ATP，以定量细胞活力
PrestoBlue细胞活力检测试剂InvitrogenA13261基于刃天青的细胞活力指示剂，在细胞的还原性环境中变为红色
Nunc微型培养板（72孔），表面为Nunclon Delta材质Thermo Scientific136528小型微孔板
96孔组织培养板Falcon, Corning Inc.353072
DMEM（1X）Gibco11965-92
GlutaMAX（100X）Gibco35050-061
胎牛血清Gibco 10099-141
细胞收集器Tomtec Life SciencesTomtec细胞收集器，96孔Mach 3M细胞收集器
液体闪烁计数器LKB Wallac1205LKB Wallac 1205 Betaplate闪烁计数器
UniFilter-96 GF/BPerkin Elmer6005177白色96孔Barex微孔板，配备孔径为1 µm的GF/B滤膜
庆大霉素Gibco, Life Technologies15750-060
青霉素/链霉素Gibco, Life Technologies15140-122
0.22 µm孔径醋酸纤维素离心管滤器Costar, Corning Inc.8160离心管滤器内含0.22 µm孔径的醋酸纤维素膜滤单元，置于容量为500 µl的聚丙烯微量离心管中
荧光读板仪BioTekBioTek Synergy 4杂合微孔板读数仪 

参考文献

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VEGFR 2 Ba F3 IL 3

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