一种用于评估血管内皮生长因子的简易生物测定法

摘要

我们描述了一种简单的基于细胞的生物测定法，用于检测、定量和监测血管内皮生长因子配体家族成员的活性。该检测方法利用在因子依赖性细胞系中表达的嵌合受体，对配体介导的受体结合与交联提供半定量或定量评估。

摘要

血管生物学中受体酪氨酸激酶及其相互作用配体的分析常常具有挑战性，原因在于相关受体家族的组成型表达、多种相关的配体以及难以处理特化内皮细胞的原代培养。本文描述了一种用于检测血管内皮生长因子受体-2（VEGFR-2）配体的生物测定方法，VEGFR-2是促进血管生成和淋巴管生成信号转导的关键分子。我们将编码VEGFR-2胞外区（配体结合区）与促红细胞生成素受体（EpoR）跨膜区及胞质区融合蛋白的cDNA，导入依赖细胞因子生长的Ba/F3细胞系中进行表达。该细胞系在白细胞介素-3（IL-3）存在条件下生长，撤除IL-3后细胞将在24小时内死亡。表达VEGFR-2/EpoR融合受体后，当存在能够结合并交联该融合蛋白胞外部分的配体时，可为稳定转染的Ba/F3细胞提供一种替代性的存活乃至增殖机制即，一种能够交联 VEGFR-2 胞外区的配体）。该检测可采用两种方式进行：一种是半定量方法，使用少量配体和细胞，可在 24 小时内快速获得结果；另一种是定量方法，通过检测细胞活力数量的替代标志物进行分析。该检测操作相对简便，对已知的 VEGFR-2 配体具有高度响应性，并可兼容 VEGFR-2 信号通路的胞外抑制剂，例如针对受体或配体的单克隆抗体以及可溶性配体捕获剂。

引言

分泌型蛋白生长因子血管内皮生长因子（VEGF）家族及其相应的细胞表面受体是一类重要且多样化的可溶性配体和膜结合受体，分别在跨细胞膜信号转导中发挥功能。它们主要在内皮细胞中发挥作用，同时也存在于上皮来源的细胞以及免疫系统细胞中^1,2。由配体激活的VEGF受体（VEGFRs）所介导的信号通路在多种重大疾病中具有关键作用，例如年龄相关性黄斑变性和癌症，目前已有靶向这些通路的治疗药物广泛应用于临床（如靶向VEGF-A的单克隆抗体贝伐珠单抗）^3,4。

VEGF 家族的复杂性之一在于自然界中存在的多种可溶性配体（VEGF-A、VEGF-B、VEGF-C、VEGF-D、副痘病毒家族 orf 编码的 VEGF 蛋白以及蛇毒 VEGF，此外还有 VEGF-A 的其他抑制性异构体）²。

这些配体与受体酪氨酸激酶家族中的三个成员相互作用，即 VEGFR-1、VEGFR-2 和 VEGFR-3。这些受体在不同类型的细胞上表达程度各异，但通常共同表达于所有大小的血管和淋巴管内壁的内皮细胞表面⁵。VEGFR-2 可结合哺乳动物配体 VEGF-A⁶、VEGF-C⁷ 和 VEGF-D^8,9，以及 orf 病毒 VEGF¹⁰ 和蛇毒 VEGF¹¹。VEGFR-....

方案

IL-3 的来源及 WEHI-3D 条件培养基的制备

注意：培养小鼠粒细胞性白血病细胞系 WEHI-3D，以生成含有 IL-3 的条件培养基。

1. 在杜氏改良伊格尔培养基（DMEM）中培养 WEHI-3D 细胞，添加 10% 胎牛血清（FBS）、1% 长效谷氨酰胺补充剂和 50 μg/ml 庆大霉素。将处于对数生长期的 5 × 10⁶ 个细胞接种至 T175 cm³ 培养瓶中的 50 ml 新鲜培养基中，培养约 7 天，或直至细胞生长对数期过后 24–48 小时（避免培养物中出现大量细胞死亡）。条件培养基可在 −20 °C 下保存多年，因此可一次性制备 200–500 ml 的批次。
2. 将培养瓶中的液体和细胞倾出，以 1,000 × g 离心 15 分钟以去除细胞及细胞碎片。弃去上层 90% 的上清液，剩余液体经 0.22 μm 滤器过滤。
3. 将 WEHI-3D 条件培养基（CM）分装为 1 ml、50 ml 和 200 ml 等不同体积，于 −20 °C 或 −70 °C 保存。小体积分装适用于实验前准备，中等体积用于因子依赖性细胞系传代培养基的配制，大体积则适合长期储存。IL-3 在 4 °C 下相对稳定，因此在无菌条件下使用时，解冻后的培养基可保存数周。
4. 或者，可将重组小鼠 IL-3 以 50 ng/ml 的终浓度稀释至培养基中使用，....

结果

本部分展示了VEGFR-2-EpoR-Ba/F3生物活性检测实验的结果（检测原理见图1）。其他已发表的研究表明，该检测方法还可广泛应用于其他VEGFR-2配体、突变型VEGF分子以及抑制性单克隆抗体的分析^{8,10,19,24-30}。

本文展示的数据来自一项检测实验，该实验采用 VEGFR-2-EpoR-Ba/F3 生物学检测法，在存在抗 VEGF-A₁₆₅ 的抑制性单克隆抗体（贝伐珠单抗）的条件下，定量分析三种重组人源配体（VEGF-A₁₆₅、VEGF-C 和 VEGF-D）对 VEGFR-2 的特异性活性。数据已相对于仅使用 VEGF-A₁₆₅ 刺激的反应进行归一化处理（图 2）。正如预期，贝伐珠单抗在实验中阻断了 VEGF-A₁₆₅ 的作用，但对 VEGF-C 和 VEGF.......

讨论

本实验方法依赖于使用高活力且依赖生长因子的细胞。因此，必须仔细培养细胞，以确保其具有因子依赖性，并维持嵌合受体的表达。确保培养基新鲜配制、未长期存放，以及 WEHI-3D 条件培养基具有高活性，均至关重要。在将细胞从含有 IL-3 的培养基转移至检测培养基时，必须充分洗涤，以避免残留的 IL-3 在加入挽救性配体时对检测造成污染。由于配体可能以多种不同形式存在，在制备用于检测的配体时需格外注意。防腐剂、抗菌剂、不同 pH 的盐类或缓冲液均可能影响检测结果，因此平行检测未转染的 Ba/F3 细胞有助于判断是否存在缓冲液相关的问题。

我们同时采用半定量和定量两种实验方案。半定量检测可在进行耗时较长且需要更多样本的完全定量检测之前，快速评估样品的活性。在生成用于发表的数据时，则 exclusively 使用定量方法。检测细胞培养物活力的替代方法相对简单直接。定量检测方法已被改进并适用于多种不同的增殖定量形式，我们已成功使用了（3-(4,5-二甲基噻唑-2-基)-2,5-二苯基四氮唑溴盐） MTT ³⁰、细胞ATP的生物发光检测法（未.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
台盼蓝	Sigma-Aldrich	T8154	使用PBS配制的0.4%溶液，按1:1比例与细胞悬液混合，用于测定活细胞数量。危险性——可能致癌
G418硫酸盐（遗传霉素）	Invivogen	ant-gn-5	用于筛选转染的真核细胞。危险性——可能引起过敏或哮喘症状或呼吸困难
3H-胸苷	PerkinElmer	NET-027	该放射性核苷在有丝分裂期间被整合入染色体DNA中。危险性——放射性
Vialight Plus试剂盒	Lonza	LT07-221	利用ATP监测试剂通过生物发光法检测细胞内ATP，以定量细胞活力
PrestoBlue细胞活力检测试剂	Invitrogen	A13261	基于刃天青的细胞活力指示剂，在细胞的还原性环境中变为红色
Nunc微型培养板（72孔），表面为Nunclon Delta材质	Thermo Scientific	136528	小型微孔板
96孔组织培养板	Falcon, Corning Inc.	353072
DMEM（1X）	Gibco	11965-92
GlutaMAX（100X）	Gibco	35050-061
胎牛血清	Gibco	10099-141
细胞收集器	Tomtec Life Sciences		Tomtec细胞收集器，96孔Mach 3M细胞收集器
液体闪烁计数器	LKB Wallac	1205	LKB Wallac 1205 Betaplate闪烁计数器
UniFilter-96 GF/B	Perkin Elmer	6005177	白色96孔Barex微孔板，配备孔径为1 µm的GF/B滤膜
庆大霉素	Gibco, Life Technologies	15750-060
青霉素/链霉素	Gibco, Life Technologies	15140-122
0.22 µm孔径醋酸纤维素离心管滤器	Costar, Corning Inc.	8160	离心管滤器内含0.22 µm孔径的醋酸纤维素膜滤单元，置于容量为500 µl的聚丙烯微量离心管中
荧光读板仪	BioTek		BioTek Synergy 4杂合微孔板读数仪