方法文章

记录小鼠超声波发声以评估社交交流

26.1K 次观看

⸱

DOI：

10.3791/53871

⸱

2016年6月5日

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Human Genetics and Cognitive Functions, University Paris Diderot, CNRS UMR 3571, Institut Pasteur, 2Neurophysiology and Behavior, University Pierre et Marie Curie Paris 6, CNRS UMR 7102, 3Bio Image Analysis, CNRS URA 2582, Institut Pasteur

本文内容

摘要

小鼠的超声波发声被用作研究神经精神疾病小鼠模型中发声交流障碍遗传基础的替代指标。本实验方案描述了三种能够可靠诱发幼鼠（贯穿发育过程）和成年小鼠（同性别互动、雄性与发情雌性互动）产生超声波发声的实验情境。

摘要

小鼠在发育期及成年期的不同情境下会发出超声波叫声。这些声音信号目前被用作模拟发声交流障碍遗传基础的替代指标。对携带与神经精神疾病（如自闭症谱系障碍）相关基因突变的小鼠模型进行发声行为表征，将有助于理解导致社交沟通障碍的机制。本文提供了可靠诱导幼鼠和成年小鼠发出超声波叫声的实验方案。该标准化流程有助于减少因实验条件差异导致的跨研究变异。在发育过程中，通过将幼鼠从母鼠及其同窝幼鼠中隔离，单独记录其隔离叫声。在成年期，通过让具有社交动机的雄性或雌性小鼠与陌生的同性别个体互动（无性成分），记录其在同性别社交互动中的叫声。此外，我们还提供了一种记录成年雄性小鼠在接触发情期雌性时发声行为的方案。在此情境下，互动具有性相关成分。这些方案旨在在实验小鼠中诱导出大量超声波叫声。然而，我们指出小鼠发声行为存在显著的个体间差异，因此应记录足够数量的个体（每组至少12只）以充分反映这种变异性。这些超声波叫声的记录可用于评估叫声频率、发声类型谱系以及叫声的声学结构。数据可结合同步视频记录的分析，从而更全面地揭示小鼠的社交沟通行为。这些方案已被用于表征缺乏ProSAP1/Shank2基因（与自闭症谱系障碍相关）的小鼠在发声交流方面的缺陷。更多超声波叫声记录数据也可在mouseTube数据库中获取，该数据库旨在促进此类数据的共享与交流。

引言

患有神经精神障碍的患者通常表现出社会交流能力缺陷（例如自闭症谱系障碍、精神分裂症或阿尔茨海默病患者1转基因小鼠被越来越多地用于模拟这些疾病的遗传病因2在这些小鼠模型中研究社会交流对于理解导致非典型社会功能障碍的基因突变机制以及测试新疗法具有重要意义。由于小鼠是社会性动物，能够通过嗅觉、触觉、视觉和听觉信号相互交流，因此是评估社会交流的合适模型。

小鼠的超声波发声目前被用作研究发声交流障碍遗传基础的替代模型3,4（尽管该物种是否存在发声学习仍存在争议5,6，即使最近的大多数研究支持其缺乏发声学习能力7）。已发现实验室小鼠在母体与幼崽之间的关系中、两性之间的社会性互动中、同性个体之间的社交互动中（详见参考文献8）以及幼年个体之间的社交互动中9均会发出超声波叫声。小鼠幼崽在出生后前两周内，当与母鼠及同窝幼崽分离时会发出隔离叫声10。雄性小鼠在遇到处于动情期的雌性（或其尿液线索）时会发出超声波叫声11,12。雄性和雌性小鼠在与同性陌生同种个体互动时也会发出超声波叫声13,14。这些叫声的组织结构和功能尚未完全明确，仍需进一步研究。目前关于其功能的认识仅限于：母鼠听到幼崽的隔离叫声后会产生回收行为；成年雌性在听到成年雄性叫声后更倾向于接近发声者15；成年雄性在听到成年雌性叫声后探索行为增加16。

在神经精神疾病小鼠模型中，对发声交流异常的表征应在标准化条件下进行，以排除实验条件带来的主要干扰。将此类表征与同步的社会互动评估及神经生物学研究相结合，在多种遗传模型中开展，将有助于加深我们对遗传因素在小鼠超声波交流不同方面所起作用的理解。从长远来看，这将有助于进一步揭示人类社会交流的一些神经生物学基础。目前，我们的目标是提供简单可靠的实验方案，以在实验室条件下稳定诱发雄性和雌性小鼠在发育期及成年期的超声波发声。这些方案应有助于录音过程的标准化，从而更可靠地在不同品系和不同实验室之间比较超声波发声特征。同时，这些方案也有助于尚无小鼠超声波发声录音经验的实验室快速建立相关实验流程。我们还强调，目前已有条件将成年小鼠在社会互动过程中同步采集的超声波发声数据与详细的行为学数据相结合，从而获得有关社会功能障碍以及超声波发声情境背景的关键信息。此类联合分析将为小鼠超声波发声的组织结构与功能提供新的认识。最后，我们还推荐将超声波发声录音数据共享至整个科学界，可通过 mouseTube 数据库（http://mousetube.pasteur.fr）实现。音频数据的开放获取将推动小鼠超声波交流研究的发展，使科研人员能够将自己的数据与其他实验室记录的超声波发声数据（使用相同或不同的品系/方案）进行比对，或利用在不同条件下录制的文件来验证和优化自身的分析方法。

方案

伦理声明：涉及动物受试者的实验程序已获得动物实验伦理委员会（Comité d'Ethique en Expérimentation animale, CETEA）编号°巴黎巴斯德研究所89号

1. 动物准备

  1. 为记录幼鼠隔离叫声，需从目标小鼠品系中获取怀孕雌鼠。注意：将杂合子雄鼠与雌鼠交配，以获得至少10窝后代，包括野生型、杂合子和基因敲除幼鼠，从而获得足够数量的对照动物。
  2. 获取两类成年小鼠，用于记录同性互动期间的发声。
    1. 从目标品系中获取每种基因型的至少12只雄性或12只雌性成年小鼠作为测试鼠（以考虑个体间差异）。注意：本方案适用于成年小鼠，但也可调整用于幼年小鼠，仅需缩短实验前的隔离时间9。该测试适用于雄性或雌性小鼠。然而，应避免使用在雄性-雄性社交互动测试中表现出明显攻击性表型的小鼠品系进行雄性测试。
    2. 为最大化亲社会性互动的发生频率，实验前需对测试动物进行隔离。将雄性单独饲养3周（以将攻击性互动降至最低14,17），雌性单独饲养3天（E. Ey，未发表数据），以增强其社交动机。
    3. 获取能代表测试品系遗传背景的其他品系雄性或雌性小鼠，作为新来者（e.g., 作为互动小鼠，见3.1.3）。例如，若所研究的突变品系是在C57BL/6J背景上构建的，则使用C57BL/6J小鼠作为新来者。计算所需动物数量，确保每只小鼠每天作为新来者使用不超过2次。将这些新来者小鼠群养。
  3. 获取两类成年小鼠，用于记录雄性在处于动情期雌性存在时的发声。
    1. 从目标品系中获取每种基因型的至少12只性成熟雄性小鼠（以考虑个体间差异）。注意：若雄性此前从未与雌性接触过，应将其单独饲养，并在测试前两天让其与一只雌性共处一晚，以提高其发出超声发声的动机6。
    2. 获取与待测雄性相同遗传背景品系的性成熟雌性小鼠。例如，若所研究的突变雄性是在C57BL/6J背景上构建的，则使用C57BL/6J雌性小鼠。计算所需雌性数量，确保每只雌性每天使用不超过3次。将这些雌性小鼠群养。

2. 幼崽分离叫声

  1. 幼崽识别
    1. 在预计分娩日前3天，将怀孕的雌性小鼠单独隔离饲养。
    2. 每天早晨和傍晚检查雌鼠是否分娩，并将分娩日记为P0。
    3. 在P1日使用持久性脚掌纹身（用0.3 mm × 13 mm [30 G ½"]针头皮下注射绿色纹身膏）对幼崽进行标记识别。通过标记一只、两只、三只或四只脚掌建立编码系统。操作应尽可能迅速，以最小程度干扰幼崽，并尽快将其放回巢中。
  2. 设置用于记录幼崽隔离叫声的笼具。
    1. 可使用自制的隔音室（图1A）或简单的聚苯乙烯泡沫箱。在箱内放置一个温度计，用于监测每次录音时的温度，确保温度保持在18 °C至22 °C之间。
    2. 将麦克风置于箱体顶部（通过箱顶的孔固定），调整麦克风高度，使麦克风振膜距离箱底（幼崽放置位置）12–15 cm。将麦克风连接至声卡，再将声卡连接至计算机。
    3. 为调节声卡增益，先使用一只不参与正式实验的幼崽进行试录音。将幼崽置于与正式实验相同的条件下（见2.3.1）。关闭箱门后，调节声卡增益，使其尽可能设置为最大值（以获得叫声信号的最高振幅），但不得引起信号过载（通过录音软件中的实时频谱图显示进行检查）。
      注意：若大多数叫声的振幅已尽可能调至最高，少数叫声可能出现过载。
    4. 记录每次录音会话的增益水平，并在同一批次幼崽、同窝幼崽或同次实验会话中保持增益不变。增益水平的变化将导致在后续分析中（使用自动检测与测量方法，见5.1至5.4）因阈值一致而造成叫声检测不准确及声学参数测量误差。

带隔音室的声学分析装置；图示为以 kHz 为单位的频率模式。
图 1：记录小鼠幼崽隔离叫声的装置及超声波发声的声谱图。 （A）用于记录幼崽隔离叫声的自制隔音室示例。（B）本研究中用于叫声类型分类的不同叫声类型的声谱图；详见表 1 中的描述。 请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 每两天进行一次幼崽隔离叫声的录制。对于夜间出生的幼崽，在早晨进行录制；对于白天出生的幼崽，则在下午进行录制，以避免将年龄相差半天的幼崽归入同一龄期。这一点在非常年幼的阶段（P2 和 P4）尤为明显。
    1. 从一窝幼崽中取出一只，尽快且轻柔地将其放入一个用10%乙醇清洗并干燥过的塑料容器中（直径：9 cm；高度：10 cm，以防止较年长的幼崽逃出麦克风覆盖区域）。将容器置于麦克风正下方。
    2. 尽快且安静地关闭录音箱。在录音软件中开始录制幼崽的超声发声（16位格式，采样频率300 kHz，以高质量捕捉最高达150 kHz的声波振幅）。
    3. 在完成所需录制时间后（最长5分钟），停止录音。将幼崽从箱中取出，并记录其脚掌上的纹身标记。
    4. 使用探头式体温计测量幼崽的腋下温度。用无味笔（水性墨水）在其背部标记一个微小的点，以便在下次选择幼崽时更容易识别已录制过的个体，避免每次选择新个体时反复操作全部幼崽。随后将幼崽放回巢中。
    5. 用10%乙醇清洗塑料容器及其底部的塑料垫片，并充分干燥，再放入下一只幼崽。
    6. 选择同窝中的下一只幼崽，重复步骤2.3。
  2. 在录制结束后让幼崽休息1小时，使其从超声发声带来的疲劳中恢复，然后检测其体重、运动协调性、负向趋地性以及发育标志（关于简化测试组合的详细信息，请参见Schmeisser et al.18 和 Ey et al.19 的方法部分）。若需进行如Chadman et al.20 和 Scattoni et al.21 中所述的完整发育测试组合，则应使用另一批动物。
  3. 在P2至P12期间每两天重复一次上述录制，以表征幼崽在整个出生后前两周内的发声行为及其发育过程。

3. 同性社会互动期间的超声波发声

  1. 发声记录
    1. 准备一个测试笼（50 x 25 cm x 30 cm）3；亚克力箱，100 勒克斯（低强度白光），在隔音室内用肥皂水清洗、晾干，并铺入 2 厘米新鲜垫料。
      1. 将麦克风放置在测试笼的角落处（可固定在笼子上或三脚架上），确保能够记录来自笼子各个角落的发声。调整麦克风与笼底之间的角度，以覆盖笼子的整个表面。
        注意：超声波具有很强的方向性。
      2. 在隔音室顶部放置一台摄像机，以记录测试笼的整个表面。
        注意：检查麦克风是否在视频中遮挡了测试笼的某个角落。
      3. 测试前，使用一个备用的雄性和一个备用的雌性个体（后续实验中不再使用）来调节声卡增益。将这些动物放入录音隔间内的测试笼中。调节声卡的增益水平，使记录到的发声信号幅度最大化，同时尽量减少录音软件实时频谱图显示中的过载现象。
        注意：增益取决于麦克风与发声动物之间的距离。
    2. 将待测试的动物（雄性或雌性；以下简称“占据者”）放入铺有新鲜垫料的测试笼中。将其置于隔音室内，适应测试笼环境20分钟，以最大程度地提高其对3.1.3步骤中引入的未知同种个体的兴趣。
    3. 经过这段适应期后，引入2nd 用于互动的动物（雄性或雌性，与原笼内动物性别相同，但耳标或脚掌纹身不同，以便后续识别；该动物称为“新来者”）。
      1. 开始记录超声波发声（16位格式，300 kHz采样频率，以高质量捕获最高达150 kHz的声波振幅）以及视频，以记录新个体进入测试笼的过程。如果需要比较动物在笼内探索期间的基线发声水平与社交互动期间的发声水平，则应在适应阶段（仅居住动物在笼内）即开始记录超声波发声。
      2. 通过在新进入小鼠的后爪接触地面的瞬间，准确按下计时器（靠近麦克风处发出“哔”声），手动/视觉同步音频和视频记录。
      3. 让两只动物相互接触所需的时间（例如4 min，该时长足以采集到足够的超声 vocalizations）。
    4. 将受试动物和新引入的动物放回各自的饲养笼中。清空测试笼中使用过的垫料，用肥皂水清洗测试笼，并用纸巾擦干。加入新鲜垫料后，将测试笼放回隔音室，准备下一次实验。

4. 雄性在与发情雌性互动期间的发声行为

  1. 测试当天清晨，对每只雌性小鼠采集阴道涂片，以确定其在动情周期中的性周期状态。
    1. 用镊子夹住雌鼠的尾巴，使其固定在笼具网格上。用移液器以 20 µl PBS（即，注射并重新收集相同的 20 µl PBS 多次）。重新收集 20 µl 使用同一支移液器吸头将 PBS 加入。若需对雌性动物进行连续数天的检测，应使用无菌 PBS，以避免任何感染。
    2. 将含有阴道细胞悬液的 PBS 滴加到载玻片上，每张载玻片放置四个样本（用铅笔在载玻片一侧标记个体编号）。待载玻片干燥后再进行染色。
    3. 在实验室通风橱中操作。
      1. 准备一份纯May-Grünwald染液，一份磷酸盐缓冲液（0.1 M），以及一份吉姆萨R染液（以磷酸盐缓冲液按1/20比例稀释）。
      2. 将载玻片放入纯May-Grünwald染液中染色3分钟，随后在磷酸盐缓冲液中冲洗1分钟，最后转移至磷酸盐缓冲液稀释1/20的Giemsa R染液中染色10分钟。
      3. 然后，将载玻片再次在磷酸盐缓冲液中冲洗10秒，并使其自然干燥。
    4. 在显微镜下观察染色后的载玻片。可用于白天实验的雌性动物，其样本应仅显示大的角化上皮细胞（无细胞核，染成蓝色；处于完全发情期）。
  2. 将雄性个体放入测试房间，至少在测试前30分钟。
  3. 发声记录
    1. 如有必要，重复步骤 3.1。
    2. 将待测雄性小鼠放入新垫料的笼具中，置于隔音室内适应测试笼具环境10分钟。
    3. 经过这段适应期后，引入一只处于发情期的雌性小鼠（从染色筛选出的个体中选择）。
      1. 开始记录超声波发声和视频，以捕捉测试笼中引入雌性动物的过程。如果需要比较雄性动物在笼内探索期间的基线发声水平与社交互动期间的发声水平，则应在适应期（仅雄性动物）开始记录超声波发声。
      2. 通过在雌性小鼠后爪接触地面的瞬间，准确按下计时器（靠近麦克风处的“哔”声），手动/视觉同步音频和视频记录。
      3. 让两只动物相互接触所需的时间（例如4 min，该时长足以采集到足够的超声 vocalizations）。
    4. 将雄性和雌性分别放回各自的饲养笼中。清空测试笼中使用过的垫料，用肥皂水清洗测试笼，并用纸巾擦干。放入新鲜垫料后，将测试笼放回隔音室，以备下次测试使用。
      注意：最好每天每只动情期雌性小鼠仅使用一次（但如有必要，可在同一天内使用最多3次，但不可连续使用）。

5. 需提取的变量

  1. 准备用于分析的音频文件。注意：以下步骤专属于 Avisoft SASLab Pro 并可能因所使用的软件而异。
    1. 将文件剪辑为恰好从秒表的“滴”声开始，并在所需时长后结束（幼鼠记录为5分钟，成年鼠记录为4分钟）。
    2. 使用高通滤波器滤除30 kHz以下的振幅（编辑>过滤>FIR时域滤波器；高通滤波，截止频率30 kHz。使用批处理功能对所有目标文件进行滤波（操作>批量处理>FIR 滤波器
    3. 使用软件对每一段超声波发声进行标注以识别。
      1. 使用自动检测进行幼鼠记录（工具>标签>根据波形事件创建区段标签。调整阈值、保持时间和边距以实现最准确的检测。手动检查检测结果，并在必要时调整标签（推荐）。
      2. 使用视觉检测法（手动插入标签）对存在背景噪声的成年动物录音进行标注（选中发声片段，右键单击，从标记中插入片段标签）。
    4. 生成频谱图。启动自动参数测量（工具>自动参数测量>自动参数测量设置
    5. 勾选“启用自动测量”、“从整个频谱图计算参数”和“自动更新”选项。选择“元素分离”：交互式（节标签）。
    6. 勾选复选框以计算所需的时间参数（元素持续时间、间隔、起始/结束时间）和基于频谱的参数（峰值频率），以及测量位置（元素起始点、元素结束点、均值、最大值、最小值）。
    7. 将测量数据复制并粘贴到电子表格中。
      注意：在对成人进行录音时，由于背景噪声的存在，基于频谱的参数测量可能无法实现。此时应通过手动测量峰值频率，即直接在频谱图上点击不同的频率值，并将数值手动复制到表格中。
  2. 确定检出率， 即， 通过首先确定发出的叫声次数（标签总数），计算每分钟的叫声次数。然后，将记录的总叫声次数除以文件时长（分钟），计算叫声频率。
  3. 确定时间组织， 即，通过分析呼叫之间的时间间隔分布来确定序列的组织结构。
    1. 使用每个标签的起始/结束时间，计算第 n 次发声结束与第 n+1 次发声开始之间的时间间隔。
    2. 建立超声波发声之间时间间隔的分布密度。
  4. 确定鸣叫图谱， 即， 定义录音中存在的叫声类型。参考所提供的分类示例进行分类。 表1 和 图1B.
    1. 在5.1.3中对每种发声进行标注时，应在标签中写入该叫声类型的名称。
    2. 计算每种叫声类型的精确数量和比例，以构建声音图谱。
  5. 确定每次发声的声学特征， 即， 持续时间，峰值频率（即， 频率最高幅度）在呼叫开始和结束时的频率、峰值频率的最大值和最小值，以及在可进行自动测量情况下的平均频率（图1B).
    1. 使用软件中的自动参数测量功能，自动测量持续时间、峰值频率特征（例如，开始，结束，平均值，最大值，最小值）在幼鼠记录中的应用。
    2. 将标签的持续时间用作成年个体录音中发声的持续时间。在频谱图窗口中手动测量峰值频率特征（例如， 开始、结束、最大值、最小值
  6. 将超声波发声数据与社交互动数据相结合（MiceProfiler 来自 ICY 平台的插件22).
    1. 确保按照方案所述，尽可能精确地同步音频和视频记录。
    2. 使用以下方法对社交互动视频进行编码 小鼠行为分析追踪器 ICY 平台的插件，如 de Chaumont 所述 等.22当引入动物的后爪接触地面时，立即开始追踪。
    3. 上传编码后的视频文件及其对应的 xml 文件（由 小鼠行为分析追踪器）在 小鼠行为分析视频标签生成器 ICY 平台的插件，如 de Chaumont 所述 等.22.
      注意：该 小鼠行为分析视频标签生成器 如果视频文件和由音频文件分析生成的文本文件具有相同的名称，该插件将自动将其关联（参见：http://icy.bioimageanalysis.org/plugin/Mice_Profiler_Video_Label_Maker）。
    4. 在确认小鼠体重秤读数准确后，对每个文件点击“创建USV统计”以分别获得各社交事件期间发出的发声次数及其比例的独立文件。

6. 在 mouseTube 数据库上传文件

  1. 确保文件存储在机构外部可访问的存储服务器上。
    注意：一些安全级别较高的机构托管的服务器需要特定配置，才能让机构外部的人员访问。
  2. 前往 mouseTube 网站（http://mousetube.pasteur.fr）。登录（用户名和密码由管理员为每位用户分配）。
  3. 检查记录的小鼠品系是否已存在于 mouseTube 通过点击“菌株”按钮进入数据库。如果没有，请要求管理员创建。
  4. 使用“主题”创建主题>创建”按钮。输入已记录动物的识别代码，并将其分组，以便于后续数据检索。
  5. 输入使用“Protocols”记录超声波发声的实验方案描述>创建”按钮。
  6. 为每次记录会话创建一个实验，使用“实验”>创建”按钮。指定实验方案、已记录的受试者群体、所使用的硬件和软件及其具体参数。
    注意：该实验收集与发声文件对应的所有元数据。
  7. 使用“Vocalisations”创建声音文件的链接>“创建”按钮。在列表中选择实验。将发声文件的网址（以 http://… 开头的链接）复制并粘贴到“要链接的文件”列的相应字段中。点击“在 mouseTube 与文件之间创建链接”按钮以确认输入。
    注意：无需同时为每个文件填写所有方框。
  8. 如有必要，可随时修改已输入的链接，并在“备注”部分添加详细信息。请随时记录备注以提供更详细的说明。例如，若已输入指向与音频文件同步录制的视频文件的链接，可在“备注”中予以说明。

结果

通过本实验方案，我们对缺乏ProSAP1/Shank2基因的小鼠的发声行为进行了表征，该基因与自闭症谱系障碍（ASD）相关23-25。ASD的特征是社交沟通障碍和刻板行为1。我们的Shank2-/-小鼠表现出活动过度、焦虑增加以及异常的发声交流行为18,26。事实上，我们注意到，与野生型同窝小鼠典型的倒U型曲线相比，Shank2-/-小鼠在幼鼠隔离叫声的发出率上表现出异常的发育模式。Shank2-/-小鼠在出生后第4天（P4）叫声频率升高，而在第6天（P6）叫声频率降低，与野生型同窝小鼠相比存在差异（图2）。在包含Shank2-/-雌性小鼠的雌性互动中，我们也观察到叫声频率较包含野生型同窝小鼠的互动降低（图2）。我们进一步分析了5种不同叫声类别的发声谱系。结果显示，幼鼠（例如P2、P6和P10）与成年小鼠之间的发声谱系存在差异（图3）。基因型相关差异主要在成年期显著。在成年Shank2-/-雄性或雌性与C57BL/6N雌性互动过程中，记录到的短叫声和非结构化叫声多于其野生型同窝小鼠的互动情况（图3D和E）。在成年Shank2-/-雌性与C57BL/6N雌性互动过程中，复杂叫声和频率跳跃叫声也少于Shank2+/+雌性参与的互动（图3E）。最后，我们还手动测量了声学参数。在发育过程中未发现显著的基因型相关差异。相反，在成年Shank2-/-雌性参与的互动中记录到的叫声持续时间短于其野生型同窝小鼠（图4A）。我们还发现，幼鼠超声发声的峰值频率随发育而升高，但无显著的基因型差异26。在Shank2-/-雄性或雌性与C57BL/6N雌性互动过程中，超声发声的峰值频率低于其野生型同窝小鼠互动时记录到的叫声（图4B）。

此外，本方案还可通过将音频记录数据与从 MiceProfiler（ICY 软件，巴黎巴斯德研究所）提取的行为数据相结合，用于研究小鼠超声发声所发生的背景情境。例如，在雌性-雌性互动中，大多数超声发声发生在动物相互接触时，更具体地说，是原住小鼠嗅探新来者肛生殖区，或至少原住小鼠位于新来者后方时。当原住小鼠接近新来者时，小鼠也会发出大量超声发声（图5，上图）。当原住小鼠为 Shank2-/- 小鼠时，其与新来者发生身体接触（例如，嗅探新来者的肛生殖区）时记录到的发声数量少于原住小鼠为野生型小鼠时。当位于新来者后方的原住小鼠为 Shank2-/- 小鼠时，引发的发声也少于原住小鼠为野生型小鼠时。当新来者处于原住小鼠的视野范围内时，记录到的发声也更多，且在野生型小鼠中比在突变型小鼠中更为明显（图5，下图）。

野生型与Shank2 -/- 小鼠的叫声率比较图，星号表示统计学显著性。
图2：发育过程中及成年雄性和雌性Shank2-/-小鼠与其野生型同窝小鼠超声发声的发射率。幼鼠（从P2至P12每隔两天记录一次，n = 18–19 Shank2+/+，n = 15–16 Shank2-/-）以及成年小鼠在雄性与发情期雌性互动期间（n = 15 Shank2+/+，n = 16 Shank2-/-）和雌性与雌性互动期间（n = 15 Shank2+/+，n = 13 Shank2-/-）的叫声率，分别显示于左图（野生型小鼠）和右图（Shank2-/-小鼠）。数据以均值±标准误（SEM）及单个数据点表示（非配对Wilcoxon检验：*p <0.05，**p <0.01，***p <0.001）。请点击此处查看该图的放大版本。

野生型与Shank2-/-小鼠发声呼叫比例；多组柱状图；发声行为分析
图3：鸣叫行为的发声图谱 Shank2-/- 小鼠及其野生型同窝仔鼠。 P2幼崽发出的五种不同叫声类型的占比A；n = 20 Shank2+/+，n = 18 Shank2-/-），P6幼鼠（B；n = 19 Shank2+/+，n = 18 Shank2-/-），P10幼鼠（C；n = 20 Shank2+/+，n = 18 Shank2-/-），与发情期雌性同处的成年雄性（D；n = 16 Shank2+/+，n=16 Shank2-/-）以及另一只雌性成年个体（E；n = 15 Shank2+/+，n=13 Shank2-/-) 在野生型小鼠中（左侧面板）和 Shank2-/- 小鼠（右侧面板）。数据以均值±标准误（SEM）及单个数据点表示（卡方检验：*p <0.05，**p <0.01，***p <0.001). 请点击此处查看此图的放大版本。

叫声持续时间与最大峰值频率比较；野生型与Shank2-/-。柱状图；统计分析。
图4：从Shank2-/-小鼠及其野生型同窝仔鼠的超声发声中提取的声学参数。（A）P2幼鼠（n = 20 Shank2+/+，n = 18 Shank2-/-）、P6幼鼠（n = 19 Shank2+/+，n = 18 Shank2-/-）、P10幼鼠（n = 20 Shank2+/+，n = 18 Shank2-/-）、成年雄性与发情期雌性配对（n = 16 Shank2+/+，n = 16 Shank2-/-）以及成年雌性与另一雌性配对（n = 15 Shank2+/+，n = 13 Shank2-/-）所发出的所有类型叫声的持续时间（野生型小鼠在左图，Shank2-/-小鼠在右图）。（B）在上述相同组别（P2幼鼠、P6幼鼠、P10幼鼠、成年雄性与发情期雌性配对、成年雌性与另一雌性配对，样本量同上）所有类型叫声混合后测得的最大峰值频率。数据以均值±标准误（SEM）表示，并显示单个数据点（非配对Wilcoxon检验：*p <0.05，**p <0.01，***p <0.001）。请点击此处查看该图的放大版本。

超声波发声百分比，Shank2 基因型，柱状图分析，统计比较。
图 5：成年雌性小鼠社交互动中发出超声波发声的情境分布。 由 Shank2+/+ 小鼠与 C57BL/6N 小鼠配对（n = 16，A）以及 Shank2-/- 小鼠与 C57BL/6N 小鼠配对（n = 13，B）在以下行为事件期间发出的超声波发声比例（红色：原居小鼠，绿色：新来小鼠）：社交接触、口-口接触、原居小鼠对新来小鼠的肛-生殖区嗅探、新来小鼠对原居小鼠的肛-生殖区嗅探、原居小鼠位于新来小鼠后方、新来小鼠位于原居小鼠后方、原居小鼠静止不动、新来小鼠静止不动、原居小鼠接近而新来小鼠逃离、新来小鼠接近而原居小鼠逃离、原居小鼠同时接近并逃离、新来小鼠同时接近并逃离、原居小鼠跟随新来小鼠、新来小鼠处于原居小鼠视野范围内、原居小鼠处于新来小鼠视野范围内。数据以均值±标准误（SEM）及单个数据点表示（非配对 Wilcoxon 检验：*p <0.05，**p <0.01）。未发表数据。 请点击此处查看该图的放大版本。

叫声类型描述
短促叫声持续时间 ≤5 msec，频率范围 ≤6.25 kHz
简单叫声持续时间 >5 msec 且频率范围 ≤6.25 kHz（平坦），或仅在一个方向（上升或下降）进行频率调制且频率范围 >6.25 kHz
复杂叫声在多个方向上进行频率调制且频率范围 >6.25 kHz（调制型），或包含一个或多个附加频率成分（谐波或非线性现象，但无饱和），对频率范围无限制（复杂型）
频率跳跃在纯音叫声中，连续频率成分之间无时间间隔地包含一个（单次频率跳跃）或多个频率跳跃（频率跳跃，其他类型），可包含或不包含任何噪声部分（混合型）
非结构化叫声无法识别出纯音成分；“噪声样”叫声

表1：小鼠超声波发声五种类型的特征。 用于确定小鼠超声波发声中五种不同发声类型的持续时间、频率范围、频率调制和频率跳跃的标准示例。

讨论

本文介绍的实验方案提供了在实验室中采集小鼠超声 vocalizations 的标准化且可靠的方法。这些高度受控的实验条件具有标准化的优势，已成功用于比较不同品系或同一品系内不同基因型的小鼠18,19,26,27。如代表性结果所示，这些方法能够识别在 Shank2 基因突变小鼠中出现的异常社交交流行为，该基因与自闭症谱系障碍相关。随着 mouseTube 数据库中更大规模数据集的可用，将促进不同小鼠品系之间、不同实验情境之间，甚至不同实验室之间的比较研究。该工具将有助于推动小鼠超声 vocalizations 的多变量分析研究。

本文所述方案经过优化，适用于在同一品系内测试不同基因型的小鼠，这也是目前大多数研究神经精神疾病遗传因素模型的常用方法。建议在实验设计中尽可能设置最佳对照。事实上，同窝效应可能会掩盖或人为夸大遗传效应28,29。因此，建议为每种基因型设置同窝出生的对照小鼠。应优先选择杂合子亲本进行繁殖，因为这样可以在同一窝仔鼠中实现突变小鼠与对照小鼠的准确匹配。为此，应对所有仔鼠（基因型设盲）进行足部纹身标记，以便在每两天一次的记录过程中追踪个体。基因分型在断奶时进行，通过采集尾部组织样本完成。当从出生后第2天（P2）开始记录仔鼠隔离叫声时，我们不建议在此阶段即对仔鼠采集尾部样本，因为该操作会增加额外的操作和应激，且在时间上过于接近记录过程。

本文建议的诱导成年动物发出超声波发声的方案无法明确识别发声的个体。这解释了为何我们需要操控测试动物的动机。实际上，在同性互动中，测试小鼠会被隔离，而新引入的个体则不会被隔离，且测试动物会在测试笼中长时间适应。在雌雄互动中，引入的雌性小鼠不进行隔离，而测试雄性小鼠的适应时间较短，因为在这种性行为情境下其动机可能更高。这些对动机的操控应能最大程度地提高测试小鼠而非引入个体发出超声波发声的概率。为了在性行为情境下记录雄性小鼠的超声波发声，也可在笼内引入一根带有新鲜（即，未冷冻）动情期雌性尿液的棉签30。该方法可100%确定超声波发声来自测试雄性，但无法获取有关这些发声实际社会情境的任何具体信息。因此，我们更倾向于采用本文所述的方案（使用自由活动的动情期雌性）。我们还建议，在测试突变品系小鼠时，始终使用相同品系的引入小鼠，并将数据作为一对小鼠共同发声的情况进行分析。最近一项研究提倡使用三角定位法来确定发声个体31。该研究发现，雌性在与雄性相遇期间也会发出超声波发声。这可能是因为它们在录音前已被隔离至少两周。尽管如此，若视频记录能够准确同步，推广该研究中提出的三角定位法应能在大多数情况下实现对发声个体的识别。

在发育过程中记录的幼鼠隔离叫声不会受到垫料背景噪音的干扰。通常，自动分析能够很好地提取主要变量。相比之下，成年鼠发出的叫声在记录时会受到动物在垫料中活动所产生的背景噪音干扰。自动分析可能失败，因此应采用人工分析。尽管如此，在测试笼中添加垫料可为动物提供比裸露地面（小鼠通常不喜欢）更少应激的环境。目前学界正进一步努力改进在各种条件下（包括存在背景噪音的情况）对超声发声进行自动检测的方法。例如，VoICE 软件可用于分析经人工筛选、排除了背景噪音的发声信号32。该软件可自动提取声学参数，但需要事先进行人工筛选。

需要注意的是，小鼠发声行为的个体间差异非常重要。例如，成年雄性小鼠在发情期雌性小鼠存在时的发声频率分布非常广泛（图1）。我们建议采用这些标准化方案来诱发超声发声，以尽量减少与实验环境相关的变异性。然而，我们想特别强调，在样本量较小的情况下，不仅应报告数据的均值和标准误（SEM），更重要的是展示每个个体的数据点33。此外，对每组/每种基因型至少记录12只个体，以获取具有代表性的数据，这一点也极为重要，甚至可以说是必需的。在许多情况下，个体间的差异不应被掩盖（通常也无法掩盖），识别出携带所研究基因突变但未表现出任何异常表型的个体可能具有重要意义。这类个体可能为代偿机制提供线索，从而为遗传性疾病的治疗开辟新的途径。

在大多数针对神经精神疾病小鼠模型的行为表征研究中，发声行为与社交接触通常被分别考虑（例如，19,27,34,35）。近年来的分析方法现已能够对社交事件及其事件序列进行半自动化的详细刻画（例如使用 MiceProfiler）36，并可将此类分析与音频记录数据相结合。该方法的主要优势在于能够全面地观察自闭症谱系障碍（ASD）小鼠模型中的社交交流，从而更精确地识别社交交流中哪些方面受到损害。在本实验方案中，视频与音频的同步仍为手动操作，但可通过音频记录软件触发视频录制以进一步改进。此类分析方法应成为标准流程，以更全面地揭示神经精神疾病小鼠模型中社交交流缺陷的特征。此外，迄今为止，对发声信号的研究主要集中在信号发出者一侧（即，实验设计通常倾向于促进被测小鼠发出声音信号，如本方案所示）。当前的研究重点也应扩展至信号接收者，以更准确地阐明这些声学信号的功能。可通过在成年小鼠中评估新引入小鼠的行为（例如使用 MiceProfiler）36、采用回放实验16，或建立新的实验方案来实现这一目标。事实上，现有方案所构建的情境较为受限，可能无法真实反映小鼠发声行为的自然行为学条件。未来需借助连续的音频与视频记录，对超声波发声的自发性发射进行更深入的刻画，以进一步阐明小鼠自发发声行为的特征。

披露

作者无任何利益冲突需要披露。

致谢

本工作得到了法国基金会（Fondation de France）、法国国家研究局（ANR）FLEXNEURIM项目[ANR09BLAN034003]、法国国家研究局（ANR）[ANR-08-MNPS-037-01-SynGen]、Neuron-ERANET（EUHF-AUTISM）、Orange基金会、FondaMentale基金会、法国基金会以及Bettencourt-Schueller基金会的资助。本文所涉及的研究还获得了创新药物计划联合计划（Innovative Medicine Initiative Joint Undertaking）第115300号资助协议的支持，该计划的资金来源于欧盟第七框架计划（FP7/2007-2013）的财政拨款以及欧洲制药工业协会联合会（EFPIA）成员公司的实物捐助。我们感谢Julie Lévi-Strauss对本文手稿提出的宝贵意见，以及六位匿名审稿人富有建设性的评论，这些意见显著提升了本文的质量。

材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
0.3 mm × 13 mm 针头 [30 G 1/2"]BD Microlance304000-
绿色纹身墨水Ketchum Manufacturing Inc., 欧塔瓦, 加拿大329AA-
温度计Fisherbrand, 沃尔瑟姆, 美国4126 (W255NA)-
自制隔音室（幼崽用）巴斯德研究所, 巴黎-吸音泡沫 + 有机玻璃；内部尺寸（宽 × 高 × 深）：32 cm × 33 cm × 32 cm
小型表面热敏电阻 + 单探头热电偶Harvard Apparatus599814 + 601956-
无气味记号笔例如：Giotto-水性墨水，可水洗：此类记号笔专为婴儿设计
无水乙醇（100%）Sigma Aldrich,  圣康坦法拉维耶, 法国24103稀释至 1/10
电容式超声麦克风 Avisoft-Bioacoustics CM16/CMPAAvisoft Bioacoustics, 柏林, 德国#40011由 Avisoft 公司提供延长电缆
Ultrasound Gate 416HAvisoft Bioacoustics, 柏林, 德国#34163声卡
Avisoft Recorder USGHAvisoft Bioacoustics, 柏林, 德国#10301; #10302适用于 Windows Vista、7 和 8 的录音软件
Avisoft SASLab ProAvisoft Bioacoustics, 柏林, 德国#10101, 10111; #10102, 10112; 适用于 Windows 10、8.1、8、7 或 Vista，包括使用 Boot Camp、Parallels 或类似虚拟化软件的 Intel 架构 Apple Macintosh 电脑
笔记本电脑或使用 Boot Camp 的 Apple Macintosh 电脑--运行 Windows 10、8.1、8、7 或 Vista；对于 Apple Macintosh 电脑，由于内存限制，推荐使用 Boot Camp 而非 Parallels 等虚拟化软件
塑料容器（幼崽录音用）Lock & Lock, 查茨伍德, 美国HPL932DLock & Lock 叠放式密封圆形容器 700 ml；使用时无需盖子；尺寸：直径 9 cm，高 10 cm
PBS 1× (pH = 7.4)Gibco (Life Technologies)10010-023-
载玻片Menzel-Gläser, Thermo ScientificJ1800AMNZSuperfrost Plus
May-Grünwald 溶液 500 mlRAL Réactifs, 马蒂拉克, 法国320070-0500-
Giemsa R 500 mlRAL Réactifs, 马蒂拉克, 法国720-1107用磷酸盐缓冲液稀释至 1/20
磷酸盐缓冲液（自制）--pH = 7，0.1 M：39 ml 0.2 M NaH2PO4 + 61 ml 0.2 M Na2HPO4 + 100 ml H2O（终体积：200 ml）
测试笼巴斯德研究所, 巴黎-50 × 25 cm，高 30 cm；有机玻璃材质
自制隔音室（成年鼠录音用）巴斯德研究所, 巴黎-吸音泡沫 + PVC；内部尺寸（宽 × 高 × 深）：66 cm × 90 cm × 46 cm
摄像机来自 Noldus Information Technologies, 瓦赫宁根, 荷兰-高分辨率 CamTech Super-Hi-Res 摄像机；25 帧/秒 
EthoVision XTNoldus Information Technology, 瓦赫宁根, 荷兰http://www.noldus.com/animal-behavior-research/products/ethovision-xt视频采集软件
ICY 平台的小鼠行为分析追踪插件（Mice Profiler Tracker）生物图像分析, 巴斯德研究所, 巴黎http://icy.bioimageanalysis.org/plugin/Mice_Profiler_Tracker用于分析社交互动期间行为事件的追踪软件

参考文献

  1. American Psychiatric Association. Diagnostic and Statistical Manual of Mental Disorders, Fifth Edition (DSM-V). , (2013).
  2. Ey, E., Leblond, C. S., Bourgeron, T. Behavioral Profiles of Mouse Models for Autism Spectrum Disorders. Autism Res. 4 (1), 5-16 (2011).
  3. Bourgeron, T., Jamain, S., Granon, S. Animal Models of Autism - Proposed Behavioral Paradigms and Biological Studies. Contemporary Clinical Neuroscience: Transgenic and Knockout Models of Neuropsychiatric Disorders. , 151-174 (2006).
  4. Scattoni, M. L., Crawley, J., Ricceri, L. Ultrasonic vocalizations: A tool for behavioural phenotyping of mouse models of neurodevelopmental disorders. Neurosci. Biobehav. Rev. 33 (4), 508-515 (2009).
  5. Portfors, C. V., Perkel, D. J. The role of ultrasonic vocalizations in mouse communication. Cur. Opin. Neurobiol. 28, 115-120 (2014).
  6. Arriaga, G., Zhou, E. P., Jarvis, E. D. Of mice, birds, and men: the mouse ultrasonic song system has some features similar to humans and song-learning birds. PLOS ONE. 7, e46610(2012).
  7. Hammerschmidt, K., Schreiweis, C., Minge, C., Pääbo, S., Fischer, J., Enard, W. A humanized version of Foxp2 does not affect ultrasonic vocalization in adult mice: Ultrasonic vocalization of "humanized" FoxP2 mice. Genes Brain Behav. , (2015).
  8. Portfors, C. V. Types and functions of ultrasonic vocalizations in laboratory rats and mice. J. Am. Assoc. Lab. Anim. Sci. 46, 28-34 (2007).
  9. Panksepp, J. B., et al. Affiliative Behavior, Ultrasonic Communication and Social Reward Are Influenced by Genetic Variation in Adolescent Mice. PLOS ONE. 2, (2007).
  10. Zippelius, H. -M., Schleidt, W. M. Ultraschall-Laute bei jungen Mäusen. Naturwissenschaften. 43, 502(1956).
  11. Whitney, G., Coble, J. R., Stockton, M. D., Tilson, E. F. Ultrasonic emissions: do they facilitate courtship of mice. J. Comp. Physiol. Psychol. 84, 445-452 (1973).
  12. Holy, T. E., Guo, Z. S. Ultrasonic songs of male mice. PLOS Biol. 3, 2177-2186 (2005).
  13. Maggio, J. C., Whitney, G. Ultrasonic vocalizing by adult female mice (Mus musculus). J. Comp. Psychol. 99, 420-436 (1985).
  14. Chabout, J., et al. Adult Male Mice Emit Context-Specific Ultrasonic Vocalizations That Are Modulated by Prior Isolation or Group Rearing Environment. PLOS ONE. 7 (1), e29401(2012).
  15. Hammerschmidt, K., Radyushkin, K., Ehrenreich, H., Fischer, J. Female mice respond to male ultrasonic "songs" with approach behaviour. Biol. Lett. 5, 589-592 (2009).
  16. Wöhr, M., Moles, A., Schwarting, R. K. W., D'Amato, F. R. Lack of social exploratory activation in male -opioid receptor KO mice in response to playback of female ultrasonic vocalizations. Soc. Neurosci. 6, 76-87 (2011).
  17. Granon, S., Faure, P., Changeux, J. -P. Executive and social behaviors under nicotinic receptor regulation. Proc. Nat. Acad. Sci. 100 (16), 9596-9601 (2003).
  18. Schmeisser, M. J., et al. Autistic-like behaviours and hyperactivity in mice lacking ProSAP1/Shank2. Nature. 486 (7402), 256-260 (2012).
  19. Ey, E., et al. Absence of Deficits in Social Behaviors and Ultrasonic Vocalizations in Later Generations of Mice Lacking Neuroligin4. Genes Brain Behav. 11, 928-941 (2012).
  20. Chadman, K. K., et al. Minimal Aberrant Behavioral Phenotypes of Neuroligin-3 R451C Knockin Mice. Autism Res. 1, 147-158 (2008).
  21. Scattoni, M. L., Gandhy, S. U., Ricceri, L., Crawley, J. N. Unusual Repertoire of Vocalizations in the BTBR T plus tf/J Mouse Model of Autism. PLOS ONE. 3, (2008).
  22. De Chaumont, F., Coura, R. D. -S., et al. Computerized video analysis of social interactions in mice. Nat. Methods. 9, 410-417 (2012).
  23. Leblond, C. S., et al. Genetic and Functional Analyses of SHANK2 Mutations Suggest a Multiple Hit Model of Autism Spectrum Disorders. PLOS Genet. 8 (2), e1002521(2012).
  24. Berkel, S., et al. Mutations in the SHANK2 synaptic scaffolding gene in autism spectrum disorder and mental retardation. Nat. Genet. 42, 489-491 (2010).
  25. Pinto, D., et al. Functional impact of global rare copy number variation in autism spectrum disorders. Nature. 466, 368-372 (2010).
  26. Ey, E., et al. The autism ProSAP1/Shank2 mouse model displays quantitative and structural abnormalities in ultrasonic vocalisations. Behav. Brain Res. 256, 677-689 (2013).
  27. Scattoni, M. L., Ricceri, L., Crawley, J. N. Unusual repertoire of vocalizations in adult BTBR T plus tf/J mice during three types of social encounters. Genes Brain Behav. 10, 44-56 (2010).
  28. Zorrilla, E. P. Multiparous species present problems (and possibilities) to developmentalists. Dev. Psychobiol. 30 (2), 141-150 (1997).
  29. Lazic, S. E., Essioux, L. Improving basic and translational science by accounting for litter-to-litter variation in animal models. BMC Neurosci. 14 (1), 37(2013).
  30. Hoffmann, F., Musolf, K., Penn, D. J. Freezing urine reduces its efficacy for eliciting ultrasonic vocalizations from male mice. Physiol. Behav. 96, 602-605 (2009).
  31. Neunuebel, J. P., Taylor, A. L., Arthur, B. J., Egnor, S. R. Female mice ultrasonically interact with males during courtship displays. eLife. 4, (2015).
  32. Burkett, Z. D., Day, N. F., Peñagarikano, O., Geschwind, D. H., White, S. A. VoICE: A semi-automated pipeline for standardizing vocal analysis across models. Sci. Rep. 5, 10237(2015).
  33. Weissgerber, T. L., Milic, N. M., Winham, S. J., Garovic, V. D. Beyond Bar and Line Graphs: Time for a New Data Presentation Paradigm. PLOS Biol. 13 (4), e1002128(2015).
  34. Jamain, S., et al. Reduced social interaction and ultrasonic communication in a mouse model of monogenic heritable autism. Proc. Nat. Acad. Sci. U. S. A. 105, 1710-1715 (2008).
  35. Won, H., et al. Autistic-like social behaviour in Shank2-mutant mice improved by restoring NMDA receptor function. Nature. 486, 261-265 (2012).
  36. Ferhat, A. -T., Le Sourd, A. -M., de Chaumont, F., Olivo-Marin, J. -C., Bourgeron, T., Ey, E. Social Communication in Mice - Are There Optimal Cage Conditions? PLOS ONE. 10 (3), e0121802(2015).

重印与许可

标签

Shank2 mouseTube
记录小鼠超声波发声以评估社交交流
联系我们
向图书馆推荐

隐私

使用条款

政策

版权所有 © 2026 MyJoVE Corporation。保留所有权利。