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方法文章

真正的基因沉默：七聚体型小向导RNA文库筛选潜在癌症治疗药物

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DOI：

10.3791/53879

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2016年6月2日

 ,  ,  , 
1Research Institute for Healthy Living, Niigata University of Pharmacy and Applied Life Sciences

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文介绍了一种针对血液系统恶性肿瘤潜在治疗药物的七聚体类型sgRNA文库筛选方案。

摘要

TRUE基因沉默（以tRNase ZL-utilizing efficacious gene silencing命名）是一种RNA导向的基因沉默技术，该技术利用人工合成的小向导RNA（sgRNA）引导tRNA 3′端加工内切核糖核酸酶tRNase ZL识别靶标RNA。sgRNA可在无需任何转染试剂的情况下被细胞摄取，并能够下调靶标RNA水平和/或在人源癌细胞中诱导细胞凋亡。我们已筛选包含156种七聚体型sgRNA的sgRNA文库，评估其对人源骨髓瘤和白血病细胞存活率的影响，发现其中20种sgRNA可有效诱导至少一种癌细胞系发生凋亡。本文提供了一项针对血液系统恶性肿瘤潜在治疗药物的七聚体型sgRNA文库筛选方案。该方案包括sgRNA文库的构建方法、各sgRNA对细胞活力影响的评估方法，以及通过流式细胞术进一步验证有效sgRNA的操作流程。通过筛选由16,384种七聚体组成的全规模sgRNA文库，预计可获得约2,000个阳性结果。

引言

TRUE基因沉默（以tRNase ZL-utilizing efficacious gene silencing命名）是一种RNA导向的基因沉默技术1。该技术基于tRNase ZL（或3′ tRNase，即tRNA 3′端加工内切核糖核酸酶）的特性而开发：在人工设计的小向导RNA（sgRNA）引导下，通过识别靶RNA与sgRNA之间形成的类似前体tRNA（pre-tRNA）或微小前体tRNA（micro-pre-tRNA）的结构，可在任意预期位点切割任何靶RNA2-9。sgRNA通常长度为7–31 nt，可分为四类：5′-半tRNA、七聚体RNA、14-nt线性RNA和钩状RNA（hook RNA）。

我们已通过将多种人工设计的sgRNA导入活细胞，证明了TRUE基因沉默的有效性10-15。我们还表明，sgRNA可在无需任何转染试剂的情况下被细胞摄取，并可在人癌细胞中下调其靶标RNA水平和/或诱导细胞凋亡16-18。TRUE基因沉默似乎通过tRNase ZL和天然sgRNA作用于细胞内和细胞间的基因调控网络系统19-21。

我们构建了一个包含156种七聚体型sgRNA的文库，用于筛选针对血液系统恶性肿瘤的潜在治疗性七聚体型sgRNA22。我们对该文库在人骨髓瘤和白血病细胞活力方面的影响进行了筛选，发现其中20种可有效诱导至少一种癌细胞系发生凋亡。此外，有4种sgRNA已在小鼠异种移植实验中被证实可降低肿瘤生长速率。

本文介绍了一种针对血液系统恶性肿瘤潜在治疗药物的七聚体类型sgRNA文库筛选方案。该方案包括sgRNA文库的构建方法、如何评估每条sgRNA对细胞活力的影响，以及如何通过流式细胞术进一步验证有效sgRNA的功能。对于sgRNA的细胞靶标RNA分析，以及在小鼠异种移植模型中对有效sgRNA的评估，可依据常规方法进行17,22，但这些步骤未包含在本方案中。

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方案

1. 七聚体类型sgRNA文库的构建

  1. 除非需要构建全规模文库，否则从 16,384（47）种 7-nt 序列中选择一个子集。
    注意：这些序列可以是随机的，也可以设计为靶向特定的细胞 RNA。对于后者，可借助适当的计算机程序和/或目视方法，在靶标 RNA 中寻找类似 tRNA T 臂的发夹结构，并选择与这些发夹结构下游紧邻的 7-nt 序列互补的序列4,10,17,18。
  2. 使用 DNA/RNA 合成仪，将每个选定的七聚体合成为完全 2′-O-甲基化、5′-和 3′-磷酸化的 RNA。采用亚磷酰胺法在可控孔径玻璃（CPG）载体上进行合成，并在合成的最后一个循环（即添加 5′ 磷酸基团）中保留 5′-末端的 4,4′-二甲氧基三苯甲基（DMT）保护基23。
    注意：也可从寡核苷酸供应商处定制合成 RNA。
  3. 完成最后一个合成循环后，将带有合成寡核苷酸的 CPG 从柱子转移至带聚四氟乙烯衬垫螺帽的玻璃小瓶中，加入 1 ml 29% 氨水，于 55 °C 孵育 8 小时，以使寡核苷酸从 CPG 上切割下来，并去除碱基和磷酸基团上的保护基。
  4. 在 40 °C 下使用离心浓缩仪蒸发去除氨水，然后将寡核苷酸重新溶解于 0.2 ml 0.1 M 正己基乙酸铵溶液中。
  5. 使用含有 10–50% 乙腈/0.1 M 正己基乙酸铵缓冲液的聚苯乙烯-二乙烯基苯柱，通过反相高效液相色谱纯化合成的寡核苷酸。在 80 °C 下以 2.0 ml/min 的流速运行色谱柱 25 分钟。
  6. 向分步收集的样品（1–2 ml）中加入 0.25–0.5 ml 浓乙酸，配制成 20% 乙酸溶液，并在室温下孵育 1 小时，以去除 DMT 基团。
  7. 在 40 °C 下使用离心浓缩仪将样品干燥，重新溶解于 1 ml 29% 氨水中，并在室温下孵育 15 分钟，以去除 5′ 磷酸基团的侧链保护基。
  8. 在 40 °C 下使用离心浓缩仪将样品体积（1 ml）浓缩至约 0.3 ml。
  9. 将全部浓缩后的样品置于截留分子量为 1,000 的透析管中，在 4 °C 下与 500 ml 蒸馏水透析过夜。
  10. 用移液器将透析后的样品从透析管转移至 1.5 ml 离心管中，在 40 °C 下使用离心浓缩仪干燥，随后重新溶解于注射用水中，溶解体积应足够小，以获得浓度高于 100 µM 的溶液。
  11. 使用分光光度计测定 RNA 样品在 260 nm 处的光密度，并通过添加注射用水将浓度调整至 100 µM。使用前将 RNA 溶液储存于 -20 °C 以下。

2. 细胞活力的sgRNA文库筛选

  1. 制备103 细胞/99 μl/孔例如， 在96孔板中，使用添加了10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素溶液的RPMI-1640培养基培养HL60和RPMI-8226细胞。设置仅含培养基的孔用于背景信号扣除。为消除边缘效应，在样品孔周围的空孔中加入无菌水。
  2. 向每孔中加入 1 μl 溶解于注射用水中的 heptamer-type sgRNA（100 μM）。每个 sgRNA 设三个复孔进行检测。将培养板置于 37 °C、5% CO₂ 条件下孵育。2 湿润培养箱中培养3天。
  3. 向每个孔中加入适量的市售WST-8溶液。将培养板置于同一培养箱中，在37 °C孵育1至4小时。
  4. 使用酶标仪在450 nm处测定吸光度。
    注意：在大多数情况下，吸光度与活细胞数量之间呈线性关系，除非吸光度值超过1.0。

3. 通过流式细胞术评估有效sgRNA

  1. 准备103 细胞/99 µl/孔例如， 在96孔板中，用添加10%胎牛血清和1%青霉素-链霉素溶液的RPMI-1640培养基培养HL60细胞。每检测一种sgRNA，至少准备10个孔。为消除边缘效应，在样品孔周围的空孔中加入无菌水。
  2. 向每个孔中加入1 µl溶于注射用水中的heptamer型sgRNA（100 µM）。将培养板置于37 °C、5% CO₂条件下孵育。2 湿润培养箱中培养3天。
  3. 用移液器从至少10个孔中收集经相同sgRNA处理的细胞至一个5 ml离心管中。在离心机中以300 × g离心5分钟，弃去培养基。
  4. 加入 2 ml 1× 磷酸盐缓冲液（PBS）至离心管中，重悬细胞。在离心机中以 300 × g 离心 5 分钟，弃去 PBS。向管中加入 150 µl 1× Annexin V 结合缓冲液，重悬细胞。
  5. 加入 2 µl 藻红蛋白（PE）标记的膜联蛋白 V 溶液和 1 µl 7-氨基放线菌素 D（7AAD）溶液至离心管中，充分混匀，室温避光孵育 15 分钟。使用流式细胞仪分析样品。24.

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结果

六种七聚体类型的sgRNA 5′-AUCUUCA-3′（H1885）、5′-ACACACA-3′（H3277）、5′-GGGGGCG-3′（H10927）、5′-GGGGCCC-3′（H10944）、5′-GCCCCCG-3′（H12287）和5′-CACCAGC-3′（H13260）被化学合成为含有5′-和3′-磷酸基团的2′-O-甲基RNA。

这些sgRNA对人白血病细胞系HL60和人骨髓瘤细胞系RPMI-8226的存活率影响进行了检测。细胞活力检测的代表性结果如图所示 图1. 四种sgRNA H1885、H3277、H10927和H13260效果显著，可降低HL60和RPMI-8226细胞的存活率 >80% 和 >70%。此外，还检测了七聚体H3277和H10927对非癌性HEK293细胞活力的影响，结果显示二者几乎不影响细胞活力。22.

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讨论

在大多数情况下，完全2′-O-甲基化、5′和3′端磷酸化的七聚体型sgRNA溶于注射级水（浓度为100 µM）后，根据其在癌细胞中诱导凋亡的活性判断，于-20 °C以下保存至少一年仍保持稳定。然而，其稳定性会因序列、质量和纯度的不同而有所变化。根据质谱分析，在某些情况下，部分sgRNA分子的5′或3′端磷酸基团在储存过程中可能发生自发性脱落，尽管这通常不会严重影响其活性。

当通过文库筛选获得有效的sgRNA后，可通过DNA微阵列和/或高通量测序进行转录组分析，以确定其在细胞内的靶标RNA。然而，目前获得的数据表明，无论是否存在转染试剂，七聚体型sgRNA介导的靶标RNA下调水平通常较为温和10,12,14,17,18。

靶向BCL2和WT1 mRNA的七聚体类型sgRNA的优势在于，尽管对靶mRNA的下调作用较弱，仍能有效诱导人白血病细胞发生凋亡17,18，这提示可能存在其他RNA靶点和/或除真正的基因沉默之外的其他作用机制。

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披露

新泻药科大学应用生命科学学院对部分七聚体类型sgRNA拥有待审批的专利申请。

致谢

本工作由“以目标为导向的可适应与无缝技术转移计划”（Adaptable and Seamless Technology Transfer Program through Target-driven R）资助。&日本科学技术振兴机构（Japan Science and Technology Agency）、日本私立学校振兴与共济事业团科学研究促进基金，以及日本学术振兴会（JSPS）科研费资助项目编号24300342和15H04313。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
定制七聚体RNANippon Bioservice
OligoSep Prep HC 羧酸酯柱Transgenomic99-3860
注射用水Otsuka Pharmaceutical 7131400A2129
RPMI-1640 培养基Wako189-02025
胎牛血清SIGMA-ALDRICH172012-500ML
青霉素-链霉素混合溶液Nacalai Tesque26253-84
96孔板Greiner Bio-one655 180
细胞计数试剂盒-8DOJINDO343-07623WST-8 溶液
酶标仪，Sunrise Thermo RC-RTEKAN510-82851
FACS 圆底管BD Falcon60819-820
磷酸盐缓冲液SIGMA-ALDRICHP7059-1L
PE 标记Annexin V 结合缓冲液BD Biosciences51-66121E
PE 标记Annexin VBD Biosciences51-65875X
7AADSIGMA-ALDRICHA9400-1MG
流式细胞仪，FACSCaliburBD Biosciences342973

参考文献

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