方法文章

大鼠初次摄入糖和脂肪后从中脑边缘和中脑皮层多巴胺奖赏区域同时检测c-Fos激活

DOI：

10.3791/53897

⸱

2016年8月24日

 ,  , 
1Behavioral and Cognitive Neuroscience Cluster, Psychology Doctoral Program, The Graduate Center, CUNY, New York, NY, 2Department of Psychology, Queens College, CUNY, Flushing, NY, 3Behavioral and Cognitive Neuroscience Cluster, Psychology Doctoral Program, The Graduate Center, CUNY, Flushing, NY

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究的目的是通过建立一种可靠的免疫组织化学技术，利用细胞c-fos激活来检测大鼠首次摄入脂肪和糖后多巴胺通路及其终末位点的同步变化，从而鉴定与奖赏相关的分布式脑网络。

摘要

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究利用细胞c-fos激活来评估大鼠初次摄入脂肪和糖类对脑内多巴胺（DA）通路的影响。糖类和脂肪的摄取行为既受其固有吸引力的驱动，也受到后天习得偏好的调节。脑内多巴胺，特别是源自腹侧被盖区（VTA）的中脑边缘和中脑皮层投射通路，已被证实参与介导这两种先天及后天的反应。尽管已有研究提出“分布式脑网络”的概念，认为多个脑区及神经递质/肽类系统相互作用以调节可口食物的摄入，但目前尚缺乏足够的实验证据来明确支持这一机制。因此，摄入糖类可引起多巴胺释放，并增加VTA多巴胺投射区域的c-fos样免疫反应性（FLI），这些区域包括伏隔核（NAC）、杏仁核（AMY）、内侧前额叶皮层（mPFC）以及背侧纹状体。此外，向上述脑区中枢给予特异性多巴胺受体拮抗剂，可差异性地降低由糖类或脂肪诱导的条件性风味偏好的获得与表达。为确定这些脑区是否在摄入糖类或脂肪后以分布式脑网络的形式协同作用，一种可行的方法是同步评估VTA及其主要中脑端脑多巴胺投射区（前边缘和下边缘mPFC、伏隔核核心与壳部、基底外侧及中央-皮质-内侧杏仁核）以及背侧纹状体，在口服摄入无条件刺激的玉米油（3.5%）、葡萄糖（8%）、果糖（8%）和糖精（0.2%）溶液后，是否表现出协调且同步的FLI激活。该方法是成功识别利用细胞c-fos激活在多个相关脑区同步研究啮齿类动物摄食奖赏相关学习可行性的第一步。

引言

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

脑内多巴胺（DA）被认为通过享乐机制1,2、与努力相关的机制3以及基于习惯的作用机制4,5 ，参与对可口糖类摄入的中枢反应。介导这些效应的主要DA通路起源于腹侧被盖区（VTA），并投射至伏隔核（NAC）的核心与壳部、基底外侧及中央皮质内侧杏仁核（AMY），以及前边缘和下边缘内侧前额叶皮层（mPFC）（参见综述6,7）。VTA已被证实参与蔗糖摄入过程8,9，且在糖摄入后可在NAC10–15、AMY16,17和mPFC18–20中观察到DA的释放。脂肪摄入同样可刺激NAC中DA的释放21，而另一富含DA的投射区域——背侧纹状体（尾状壳核）——也与DA介导的摄食行为相关22,23。Kelley24–27提出，该DA介导系统的多个投射区域通过广泛而紧密的相互连接，构成了一个整合性、交互性的分布式脑网络28–34。

除了多巴胺D1和D2受体拮抗剂能够减少糖类35-37和脂肪38-40的摄入外，多巴胺（DA）信号传导还被认为参与介导糖类和脂肪引发条件性风味偏好的能力（CFP）41-46。将多巴胺D1受体拮抗剂微量注射至伏隔核（NAC）、杏仁核（AMY）或内侧前额叶皮层（mPFC）可消除由胃内葡萄糖引发的条件性风味偏好的获得47-49。将多巴胺D1或D2受体拮抗剂微量注射至mPFC可消除果糖引发的条件性风味偏好的获得50，而在伏隔核和杏仁核中，多巴胺拮抗剂对果糖引发的条件性风味偏好的获得和表达则表现出差异性阻断作用51,52。

c-fos 技术53,54已被用于研究可口食物摄入所诱导的神经激活。本文通篇使用术语"c-fos 激活"，其操作性定义为神经元去极化过程中 c-Fos 转录水平的升高。蔗糖摄入可增加杏仁核中央核（AMY）、腹侧被盖区（VTA）以及伏隔核（NAC）壳部而非核部的 fos 样免疫反应性（FLI）55-57。在假饲大鼠中，蔗糖摄入显著增加了杏仁核和伏隔核的 FLI，但未增加腹侧被盖区的 FLI58；而经胃内灌注蔗糖或葡萄糖可显著增加伏隔核以及杏仁核中央核和基底外侧核的 FLI59,60。在定时给予饲料的基础上反复添加蔗糖，可增加前额叶内侧皮质（mPFC）以及伏隔核壳部和核部的 FLI61。采用蔗糖浓度下调范式发现，基底外侧杏仁核和伏隔核的 FLI 增加最为显著，而腹侧被盖区则无明显变化62。在条件反射建立后，糖相关自然奖赏行为的消退过程可增加基底外侧杏仁核和伏隔核的 FLI63。此外，将糖的出现与声音配对后，该声音随后可引起基底外侧杏仁核 FLI 水平的升高64。高脂饮食摄入同样可增加伏隔核和前额叶内侧皮质区域的 FLI65-67。

先前引用的大多数研究仅考察了糖和脂肪对单一脑区c-fos激活的影响，无法提供有关奖赏相关分布式脑网络识别的信息24-27。此外，许多研究也未明确界定伏隔核（NAC，包括核心区和壳区）、杏仁核（AMY，包括基底外侧核和中央-皮质-髓质区）以及内侧前额叶皮层（mPFC，包括前肢核和下肢核）内部亚区的相对作用，而这些亚区的差异本可通过c-Fos图谱所具备的优异空间分辨率和单细胞分辨率加以分析68。本实验室69近期利用c-fos激活技术，同时检测了大鼠初次摄入脂肪和糖类后，腹侧被盖区多巴胺（VTA DA）通路及其投射区域（NAC、AMY和mPFC）发生的变化。本研究详细描述了实验操作与方法步骤，旨在同时分析急性暴露于六种不同溶液（玉米油、葡萄糖、果糖、糖精、水以及脂肪乳剂对照）是否会在NAC、AMY、mPFC以及背侧纹状体的各个亚区中差异性地激活即刻早期基因标记（FLI）。这种对差异的同步检测，使得我们能够确认各脑区FLI的显著变化，并判断某一特定脑区的变化是否与其他相关脑区的变化存在相关性，从而为分布式脑网络的存在提供支持证据24-27。这些实验程序用于检验在口服、非条件性摄入葡萄糖（8%）、果糖（8%）、玉米油（3.5%）和糖精（0.2%）溶液后，VTA、前肢核和下肢核mPFC、NAC的核心区与壳区、AMY的基底外侧核与中央-皮质-髓质区，以及背侧纹状体是否表现出协调且同步的FLI激活。

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方案

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

这些实验方案已获得机构动物照护与使用委员会的批准，证实所有实验对象和操作均符合美国国立卫生研究院《实验动物照护与使用指南》的要求。

1. 受试者

  1. 购买和/或繁育雄性Sprague-Dawley大鼠（260 - 300 g）。
  2. 将大鼠单只饲养在金属网笼中，维持12小时光照/12小时黑暗循环，自由供应大鼠饲料和水 随意摄取.
  3. 分配适当的样本量 例如，n ≈ 6 - 8）随机分组。

2. 测试设备与摄入程序

  1. 使用带有橡胶塞和45°角金属吸管的校准离心管，以准确测量（±0.1 ml）所提供的溶液。用一根拉紧的金属弹簧将其固定在动物的饲养笼上，以便能够清晰观察到刻度。
  2. 限制大鼠的食物供给量（约15 g/天），使其体重减少至原始体重的85%，以增强其摄入溶液的动机。注意：体重下降过程应控制在3至5天内完成。
  3. 在训练前连续四天，每天提供一次1小时的预训练溶液（10 ml，0.2%糖精），以最大程度提高大鼠在后续测试中快速（潜伏期小于1分钟）采样测试溶液的可能性。
  4. 通过滴出少量液体来确认离心管中的液体流动通畅。
  5. 每次实验前后均称量离心管重量，以获得摄入量数据。
  6. 在第五天对接受以下六种溶液之一的亚组进行摄入测试（每种溶液10 ml，测试时间1小时）：a) 水，b) 新口味（0.05%樱桃香精）的0.2%糖精溶液，c) 8%果糖，d) 8%葡萄糖，e) 3.5%玉米油悬浮于0.3%黄原胶中，f) 0.3%黄原胶。
  7. 确保各营养溶液之间热量相等；因此，3.5%玉米油溶液的热量应与8%糖溶液相等。
  8. 确保大鼠在极短时间内（小于1分钟）开始采样溶液。若未满足此条件，则将该动物从研究中剔除。

3. 组织制备

  1. 在初次暴露于每种测试溶液后90分钟，通过腹腔注射戊巴比妥麻醉每只动物。通过检测动物对足部夹捏引起的回缩反射、直接角膜压迫引起的眨眼反射或深部耳廓刺激引起头部晃动等反射是否消失，确认动物已充分麻醉。
  2. 按照先前所述方法对每只动物进行经心脏灌注69。
    1. 使用过量戊巴比妥钠（65 mg/kg）麻醉大鼠，打开胸腔并暴露心脏以便操作69。
    2. 将针头插入左心室心尖部位，同时剪开下腔静脉。先灌注磷酸盐缓冲液（PBS，约180 ml），随后灌注含4%多聚甲醛的磷酸盐缓冲固定液（约180 ml）。
    3. 通过观察液体是否从鼻腔、口腔或生殖区域等其他腔隙流出，确认动物是否正确灌注。注意：使用多聚甲醛进行充分固定时，通常伴随明显的肌肉收缩运动。若未出现该反应，应重新调整针头位置直至出现此现象。
  3. 迅速剪开颅骨表面的毛发和皮肤，取出脑组织。使用咬骨钳从后向前逐步敲开并移除颅骨。操作起始于小脑下方及后方区域，确保咬骨钳位于颅骨与软脑膜之间。当颅顶和颅侧骨质被完全去除后，用小刮匙从颅底轻轻抬起脑组织，并用小剪刀剪断脑神经。在去除颅骨过程中需小心避免损伤脑组织。
  4. 将脑组织置于4%多聚甲醛溶液中，在4 °C条件下固定过夜。随后将脑组织转移至30%蔗糖与70% PBS的混合溶液中，室温孵育直至脑组织沉降至容器底部。
  5. 修整脑组织
    1. 在嗅球后方横向切断，去除脑的前部（吻侧部分）。
    2. 在小脑与脑桥水平横向切断，去除脑的后部（尾侧部分）。
  6. 将脑组织按冠状面方向固定于切片机载物台上，尾侧朝下，对前额叶内侧皮质（mPFC，位于前囟前+2.86至+2.20 mm）、伏隔核核心与壳部及背侧纹状体（位于前囟前+1.76至+1.60 mm）、杏仁核（AMY，位于前囟后-2.12至-2.92 mm）以及腹侧被盖区（VTA，位于前囟后-5.20至-5.60 mm）进行冠状切片（厚度40 µm）。可参考大鼠脑图谱70进行定位。
  7. 将游离切片收集至盛有PBS的24孔板各孔中，以备后续免疫组织化学分析71。使用Parafilm密封24孔板，防止PBS蒸发导致脑组织干燥。将脑组织样本储存于4 °C环境中。

4. c-fos 实验步骤（改编自71）

  1. 每个切片用 5 ml 含 5% 正常山羊血清和 0.2% Triton X-100 的 PBS 溶液处理 1 小时。
  2. 将处理后的切片与一抗（兔抗 c-fos，1:5,000）在含有 1 ml PBS 的孔板中于 4 °C 孵育 36 小时。
  3. 用 PBS（5 ml）清洗切片 3 次，每次 10 分钟。
  4. 在含有 1 ml PBS 的孔板中，室温下与二抗（生物素化山羊抗兔 IgG；1:200）孵育 2 小时。
  5. 每个切片用 PBS（5 ml）清洗 3 次，每次 10 分钟。
  6. 将清洗后的切片在商品化的亲和素-辣根过氧化物酶混合液中孵育 2 小时，该试剂盒包含 Avadin DH（100 µl）和生物素化辣根过氧化物酶 H（100 µl）溶于 5 ml PBS 中。
  7. 再次用 PBS（5 ml）清洗切片 3 次，每次 10 分钟。
  8. 在含有 5 ml DAB 溶液的孔板中，用含 0.0015% H2O2 的 0.05% 二氨基联苯胺（DAB）反应 5–10 分钟，具体时间根据组织反应性而定。
  9. 对 VTA 切片进行双重标记。在 5 ml PBS 中加入酪氨酸羟化酶（TH）抗体（兔抗大鼠 TH，1:2,000），4 °C 过夜孵育。
  10. 用 PBS（5 ml）清洗切片 3 次，每次 10 分钟。
  11. 在 5 ml PBS 中，室温下与二抗（生物素化山羊抗兔 IgG；1:200）孵育 2 小时。
  12. 用 PBS（5 ml）清洗切片 3 次，每次 10 分钟。
  13. 使用二抗-过氧化物酶复合物显影抗体信号。在含有 5 ml DAB/NiCl 溶液的孔板中，用 0.05% DAB 与 0.3% 硫酸镍溶液混合液反应 5–10 分钟，具体时间根据组织反应情况而定。
  14. 确保 DAB 溶液因与 0.3% 硫酸镍反应而呈现乳白色微绿色。若溶液过绿，则显色反应会过深。
  15. 将所有切片贴附于明胶包被的载玻片上，室温干燥过夜，然后滴加数滴甲苯溶液（TBS）封片。
  16. 对载玻片进行编码，使观察者不知晓实验分组情况。

5. c-fos 免疫反应阳性细胞计数的测定

  1. 指派两名无偏倚的观察者，对以下感兴趣区域（ROI）中的 Fos 阳性神经元进行计数：前边缘内侧前额叶皮层（prelimbic mPFC）、下边缘内侧前额叶皮层（infralimbic mPFC）、伏隔核核心区（NAC core）、伏隔核壳区（NAC shell）、基底外侧杏仁核（basolateral AMY nuclei）、中央-皮质-内侧杏仁核（central-cortico-medial AMY）、背侧纹状体以及腹侧被盖区（VTA）。需明确 VTA 中 c-Fos 免疫反应性是否存在于 TH+ 和 TH- 细胞中。图 1 展示了显微镜下伏隔核区域的屏幕截图。

突出显示伏隔核（NAC）区域和结构的脑解剖图，用于神经科学研究。
图1. 伏隔核（NAC）代表性切片，显示由网格划定的兴趣区域，用于c-fos计数。 伏隔核壳部位于伏隔核核心的内侧和腹侧。伏隔核核心环绕前连合（Anterior Comm.）。侧脑室（Lateral Vent.）的腹侧边界清晰可见。请点击此处查看该图的放大版本。

  1. 在所有测试条件下，每只动物每个共同位点至少分析三个具有代表性的切片。
  2. 使用软件和光学显微镜，通过勾画轮廓来分析每个感兴趣区域（ROI）的整个区域（图1）。
    1. 对于特定位点，打开应用程序，点击采集下拉菜单，选择“实时图像”（Live Image）。将感兴趣区域调至清晰，点击屏幕以建立参考点。然后以网格为参考勾画选定的脑区。完成勾画后，开始计数细胞（步骤 5.3.1.1 - 5.3.1.3）。
      1. 双击软件图标。进入菜单栏，点击“Acquisition”（采集），然后选择“Live Image”（实时图像）。将感兴趣区域调至清晰，点击屏幕以建立参考点。
      2. 进入网格工具栏，点击“Display Grid”（显示网格）和“Use grid labels”（使用网格标签）。按照预设的轨迹勾画感兴趣区域。
      3. 统计每个感兴趣区域内的所有细胞，在左侧边栏中选择“+”以记录c-fos阳性细胞数量。逐一点击每个细胞进行计数。当观察到明确的深红色圆形信号时，判定该细胞为c-fos阳性（图1）。
    2. 对每个位点重复上述过程。
    3. 将计数结果记录在实验记录本和计算机中，以供后续分析。进入菜单栏，点击“File”（文件），选择“Save Data File”（保存数据文件），以保存勾画结果和计数数据。
  3. 确保两名不知情评分者对每个感兴趣区域各切片的评分者间信度（以计数相关性衡量）始终高于0.8。

6. 统计学

  1. 使用重复测量单因素方差分析（ANOVA）评估前四天的基础糖精摄入量，比较第1、2、3和第4天的糖精摄入量69。
  2. 采用随机区组双因素方差分析（ANOVA）比较六组动物在第4天的糖精摄入量与第5天的测试摄入量69。
  3. 使用Tukey多重比较（p < 0.05）确定各组间的显著性差异69。
  4. 确定评分者间信度，然后采用共同观察者的计数结果。
  5. 对每个脑区的三个代表性切片的c-fos计数取平均值69。
    1. 对摄入六种溶液（3.5%玉米油、8%葡萄糖、8%果糖、0.2%调味糖精、黄原胶对照及水）后边缘下前额叶皮层（perilimbic mPFC）的c-fos激活情况进行单因素方差分析（ANOVA）69。
    2. 对下边缘前额叶皮层（infralimbic mPFC）、伏隔核核心（NAC core）、伏隔核壳部（NAC shell）、基底外侧杏仁核（basolateral AMY）、中央-皮质-髓质杏仁核（central-cortico-medial AMY）、腹侧被盖区（VTA）和背侧纹状体进行平行的六组分析。使用Tukey比较（p < 0.05）揭示各组间的显著性差异69。
  6. 将玉米油摄入量分别与水摄入量及其悬浮剂黄原胶的摄入量进行比较。将果糖和葡萄糖摄入量分别与水摄入量及非营养性甜味剂糖精的摄入量进行比较。
  7. 使用Bonferroni校正的r相关分析（p < 0.05）确定各脑区的溶液摄入量与c-fos激活之间是否存在显著相关性。
    1. 系统性地比较3.5%玉米油组每只动物在边缘下前额叶皮层和下边缘前额叶皮层的c-fos计数。
    2. 对3.5%玉米油条件下，上述六个脑区（VTA、背侧纹状体、下边缘mPFC、边缘下mPFC、NAC core、NAC shell、基底外侧AMY、中央-皮质-髓质AMY）中的每一对脑区进行系统性的平行分析。
    3. 对其他五种实验摄入条件（8%葡萄糖、8%果糖、0.2%调味糖精、黄原胶对照及水）重复进行这六个脑区的系统性平行分析。
  8. 利用同一溶液条件下动物在所有脑区均被评估的特点，通过Bonferroni校正的r相关分析（p < 0.05）确定不同溶液间以及各溶液内部c-fos激活之间的显著相关性。

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结果

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

下文所述所有代表性结果此前均已发表69，此处重新展示旨在提供“概念验证”，以说明该技术的有效性。

溶液摄入量
在实验开始的前四天内，所有动物的基础糖精摄入量存在显著差异（F(3,108) = 57.27，p < 0.001），摄入量呈显著（p < 0.05，Tukey HSD 检验）且逐步上升趋势（第1天：1.3 (± 0.2) ml；第2天：3.9 (± 0.4) ml；第3天：5.9 (± 0.6) ml；第4天：7.1 (± 0.6) ml）。与第4天的糖精摄入量相比，第5天的果糖和葡萄糖摄入量显著增加（p < 0.05，Tukey HSD 检验），而玉米油和糖精的摄入量则无显著变化（p < 0.05，Tukey HSD 检验）；其中果糖（9.6 (± 0.4) ml）和葡萄糖（9.4 (± 0.6) ml）的摄入量显著高于糖精摄入量。此外，玉米油摄入量（7....

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讨论

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

本研究旨在利用细胞c-fos技术，确定大鼠初次摄入脂肪和糖后，多巴胺奖赏相关神经元的来源（腹侧被盖区，VTA）及其前脑投射靶区（伏隔核，NAC；杏仁核，AMY；内侧前额叶皮层，mPFC）是否同时被激活。本研究详细描述了先前发表的一项研究的实验方案69。我们假设，VTA及其向 prelimbic 和 infralimbic 区域的mPFC、NAC的核心与壳部、AMY的基底外侧部及中央-皮质-髓质区，以及背侧纹状体的主要投射区域将构成一个分布式的脑网络24–27，并在初次摄入葡萄糖（8%）、果糖（8%）或玉米油（3.5%）溶液后，相对于糖精（0.2%）、水及其他对照溶液，表现出协调且同步的即刻早期基因荧光激活（FLI）。结果表明，玉米油、葡萄糖和果糖的摄入均显著且差异性地激活了VTA、prelimbic和infralimbic mPFC、NAC的核心与壳部、AMY的基底外侧部和中央-皮质-髓质区以及背侧纹状体，而糖精摄入则未产生此类激活。除c-fos技术外，本研究还采用了行为学方法评估糖、脂肪和人工甜味剂的摄入情况。

一个关键步骤是及时采集摄...

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披露

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

作者无竞争性财务利益。

致谢

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

感谢戴安娜·伊卡萨-库拉基、克里斯塔尔·桑普森和特奥洛吉亚·卡拉吉奥里斯为本项目付出的辛勤努力。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
仪器设备
Sprague-Dawley 大鼠Charles River LaboratoriesCD-1
金属丝网笼Lab Products, Seaford, DE30-Cage rack
大鼠饲料PMI Nutrition International5001
张紧金属弹簧Lab Products, Seaford, DEn/a
大鼠电子秤Fisher Scientific Companyn/a
Nalgene 离心管Lab Products, Seaford, DE10-0501
橡胶塞Lab Products, Seaford, DEn/a
金属饮水管Lab Products, Seaford, DEn/a
糖精Sigma Chemical Co82385-42-0
Kool-Aid，樱桃味Kool-AidCommercial
Kool-Aid，葡萄味Kool-AidCommercial
果糖Sigma Chemical CoF0127
葡萄糖Sigma Chemical CoG8270
玉米油MazzolaCommercial
黄原胶Sigma Chemical Co11138-66-2
滑动式切片机Microm Internationaln/a
Neurolucida 成像系统MBF BioscienceSoftware application
明胶包被载玻片Fisher Scientific Company12-550-343
盖玻片Fisher Scientific Company12-545-M
金色尼龙刷Loew-Cornell 2037
天然毛松鼠毛刷 Loew-Cornell 2022
24 孔板Fisher Scientific3527
6 孔板Fisher Scientific3506
1 L Pyrex 瓶Fisher Scientific1395-1L
组织嵌入盒（组织筛）Fisher Scientific7200214
Eagle 移液器 World Precision InstrumentsE10（1–10μl）
Eagle 移液器 World Precision InstrumentsE100（20–100μl）
Eagle 移液器 World Precision InstrumentsE200（50–200μl）
Eagle 移液器 World Precision InstrumentsE1000（100–1000μl）
Eagle 移液器 World Precision InstrumentsE5000（1000–5000μl ）
通用吸头 0.1–10 μlWorld Precision Instruments500192
通用吸头 5–200 μlWorld Precision Instruments500194
通用吸头 500–5,000 μlWorld Precision Instruments500198
Blade Vibroslice 100 刀片World Precision InstrumentsBLADE
DPX 封片剂 Electron Microscopy 13510
15 ml 离心管Biologix Research Co.10-0501
载玻片盒Biologix Research Co.41-6100
旋转摇床 Madell Corporation  ZD-9556
称量舟 Fisher Scientific02-202-100
5 ml 一次性移液管Fisher Scientific13-711-5AM
Stereo Investigator 软件Micro Bright FieldSoftware application
名称公司货号备注
试剂
颗粒状多聚甲醛Fisher Scientific19210
NaClFisher ScientificS271-1
磷酸二氢钠Fisher ScientificS468-500
磷酸氢二钠Fisher ScientificBP332-500
过氧化氢 Fisher ScientificH324-500
SafeClear II Fisher Scientific23-044-192
甲醇 Fisher ScientificA412-1
正常山羊血清VectorS-1000
生物素化抗兔 IgG（H+L）VectorBA-1000
ABC 试剂盒（过氧化物酶标准型）VectorPK-4000
抗 c-Fos（Ab-5）兔单克隆抗体EMD chem/Cal BiochemPC38
吐温 X-100SigmaAldrichX-100
3,3' 二氨基联苯胺四盐酸盐 SigmaAldrichD5905
氢氧化钠SigmaAldrich5881
一抗 TH 抗体EMD MilliporeAB152
EuthosolVirbac AH

参考文献

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
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  2. Wise, R. A. Role of brain dopamine in food reward. Philos. Trans. R. Soc. Lond. B. Biol. Sci. 361, 1149-1158 (2006).
  3. Salamone, J. D., Correa, M. The mysterious motivational functions of mesolimbic dopamine. Neuron. 76, 470-485 (2012).
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