使用基于FRET的共聚焦成像技术测量培养的平滑肌细胞肌浆网内的钙离子波动

摘要

目前，大多数可用的钙离子指示剂用于定量培养的平滑肌细胞中胞质钙瞬变，以此作为肌浆网释放钙离子的间接测量方法。本方案描述了一种基于FRET的特异性指示剂的使用，该指示剂可直接测量肌浆网腔内的钙信号。

摘要

维持血管平滑肌细胞（VSMCs）肌浆网（SR）内钙离子（Ca²⁺）稳态水平对其整体健康至关重要。VSMCs 内大部分细胞内 Ca²⁺ 储存于 SR 中。作为唯一通过质膜-SR 连接结构与胞外空间密切关联的细胞内细胞器，SR 可被视为应对任何 Ca²⁺ 瞬变异常或细胞所受应激的第一道防线。在 SR 的多种功能中，最重要的一项是介导 Ca²⁺ 调控信号在细胞内的传递，从而引发广泛的下游细胞反应。目前普遍使用的胞质 Ca²⁺ 指示剂在研究肌腔内 SR Ca²⁺ 储存库高度动态变化方面仍显不足，而这些变化尚未被充分表征。本文提供了一种直接、清晰测定 SR 腔内 Ca²⁺ 水平的详细实验方案。该工具可用于研究 SR Ca²⁺ 的细微变化，这些变化对细胞正常功能和健康具有重要后续影响。特异性地监测 SR Ca²⁺ 含量的波动，可为我们提供大量有关细胞对疾病或应激条件响应的信息。本方法采用一种经修饰的靶向 SR 的 Ca²⁺ 指示剂 D1SR，用于检测在向培养的大鼠主动脉平滑肌细胞（SMCs）引入刺激因子后 Ca²⁺ 的动态变化。在用 D1SR 指示剂孵育后，通过共聚焦荧光显微镜和基于荧光共振能量转移（FRET）的成像技术，直接观察在基础条件下以及加入可诱导细胞内 Ca²⁺ 转移的激动剂后，SR 腔内 Ca²⁺ 水平的变化。

引言

Ca²⁺ 是体内每个细胞中都大量存在的一种非常重要的离子。它在多种不同的细胞功能中发挥着重要作用，包括细胞生长、增殖、迁移和凋亡^1-4。已有充分证据表明，Ca²⁺ 可通过直接和间接作用影响这些过程，因此，该离子细胞内正常浓度的改变很容易对受影响细胞产生不利后果。肌浆网（SR）被认为是细胞内最大的 Ca²⁺ 储存库⁵。SR 和细胞质中 Ca²⁺ 的稳态水平通常通过该细胞器的 Ca²⁺ 转运通道持续的内流和外流来维持。细胞因任何形式的损伤或疾病所承受的应激状态，通常伴随着 SR 中 Ca²⁺ 的显著变化，进而对细胞健康产生长期影响。在最严重的情况下，应激细胞无法恢复并维持 SR 中 Ca²⁺ 的稳态水平，最终可能导致细胞通过凋亡途径死亡^6-8。

当前关于细胞钙的研究²⁺ 其动态受限于仅有少数研究对细胞器钙进行检测²⁺ 存储内容直接^9-11最常见的做法是测量细胞质中的Ca²⁺ 水平作为肌浆网Ca变化的间接测量指标²⁺ 内容 ^12-14. 在这些实验中，Ca²⁺ 通常通过使用药物试剂诱导其从肌浆网（SR）中释放，从而....

方案

伦理声明：所有实验和操作均符合加拿大不列颠哥伦比亚大学温哥华校区的实验室生物安全指南。

1. 用于基于FRET的共聚焦显微镜的35 mm玻璃底培养皿的制备

1. 在实验前36-48小时，按照以下步骤制备平板。
2. 从-20 °C保存处取出选定的明胶状蛋白质混合物和0.25%胰蛋白酶-EDTA，置于移动冰浴中保存直至使用。
   注意：包被蛋白混合物在室温下暴露的时间应尽可能短暂，以防止其在使用前凝固。胰蛋白酶溶液也应保持冷藏至使用时；或者，可在完成步骤1.5后从-20 °C保存条件下取出胰蛋白酶。
3. 制备蛋白混合物与DMEM的1:25稀释液（不含血清，预冷）。将适量体积的蛋白混合物/DMEM转移至各待用培养板中。对于35 mm玻璃底培养皿，加入约200 µl，以完全覆盖皿底内侧的玻璃圆区。
4. 将培养板置于生物安全柜内室温条件下静置至少30分钟。在此期间，将含10% NCS的DMEM在水浴中预热至37 °C。
5. 将胰蛋白酶在下一步操作前立即于37 °C水浴中预热。
6. 使用玻璃移液管和抽吸装置移除培养瓶中现有的DMEM。用温热的无菌PBS清洗瓶底，以去除残留的DMEM。
7. 从培养瓶底部脱落先前培养的平滑肌细胞：
   注意：在进行此步骤前数天已将细胞接种于培养瓶中，以使细胞在制备培养板前达到所需的汇合度（约80%）。细胞最初悬浮于含10% NCS的20 ml DMEM培养基中，并在3....

结果

本部分提供了使用所述方法捕获肌浆网腔内 Ca²⁺ 浓度数据所能获得的结果示例，并与通常采用的通过观察细胞质 Ca²⁺ 波动来间接测量细胞器 Ca²⁺ 储存浓度变化的方法进行了比较。

图1A 显示了转染D1SR腺病毒的平滑肌细胞（SMC）培养物在YFP通道（514 nm激发/535 nm发射）中感兴趣区域（ROI）的快照图像。如图所示，尽管所有SMC均表达D1SR，但在同一ROI内不同细胞间的D1SR指示剂表达水平存在明显差异。图1B 展示了一个转染D1SR腺病毒（YFP通道）的SMC荧光图像的二维投影，清晰呈现了广阔的肌浆网（SR）腔内网络中Ca²⁺的分布情况。图1C 使用CFP（440/488 nm）、FRET（440/535 nm）和YFP（514/535 nm.......

讨论

本方案描述了利用D1SR腺病毒转染VSMC以研究Ca²⁺ 肌浆网腔内的钙离子浓度。该方法可实现对钙离子的直接测量²⁺ 该细胞器内的钙离子动态及其在不同钙调节剂作用下向肌质网（SR）内/外的移动情况。该方法对于致力于全面理解肌质网和胞质Ca²⁺变化机制的研究人员具有诸多优势。²⁺ 水平影响整体细胞健康，以及这些变化之间的相互关系。传统上对细胞内 Ca²⁺ 运动涉及仅对细胞质 Ca 的变化进行追踪²⁺ 水平。因此，使用 D1SR 或类似构建体的一个重要优势在于能够监测涉及特定细胞器（如肌质网，SR）的该离子运动，而无需通过间接观察胞质 Ca²⁺ 的变化来对激动剂作用于 SR 的效应做出模糊推断。²⁺ 由此类操作诱导的水平。同样，一些作用于影响SR Ca²⁺ 可更高效地用于评估其对细胞器及全细胞范围内钙离子水平的影响²⁺ 浓度和整体健康状况。正是由于这些优势，通过转染培养细胞表达 D1SR 可提供一种更为直接且互补的方法，用于检测肌浆网腔内 Ca²⁺ 的变化^2.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
DMEM高糖培养基（含丙酮酸）	Life technologies	11995-065	使用前在37 °C水浴中预热
Matrigel基底膜基质（生长因子减少型，5 ml）	Corning	356230	使用前保存于-20 °C
新生牛血清	Sigma-Aldrich		使用前保存于-20 °C
35 mm玻璃底培养皿	MatTek Corporation	P35G-1.5-14-C
250 ml 0.2 μM通气蓝色密封盖锥形瓶	BD Falcon	353136
胰蛋白酶/EDTA溶液	Life technologies	25200056	使用前保存于-20 °C
50 ml聚丙烯圆锥形离心管	BD Falcon	352070
D1SR	N/A	N/A	赠品
二甲基亚砜（DMSO）	Sigma-Aldrich	D8779
Pluronic F-127	Sigma-Aldrich	P2443
Fluo 4-AM	Life technologies	F-23917	使用前保存于-20 °C
1.5 ml黑色微量离心管	Argos Technologies	T7100BK
Leica TCS SP5共聚焦显微镜	Leica Microsystems
Leica Application Suite 2.6.3（含FRET SE向导应用）	Leica Microsystems
GraphPad Prism 5.0	GraphPad Software, Inc.