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方法文章

使用基于FRET的共聚焦成像技术测量培养的平滑肌细胞肌浆网内的钙离子波动

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DOI：

10.3791/53912

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2016年6月20日

 ,  , 
1Department of Anaesthesiology, Pharmacology, and Therapeutics, University of British Columbia, 2Department of Biomedical Sciences, Midwestern University

本文内容

摘要

目前，大多数可用的钙离子指示剂用于定量培养的平滑肌细胞中胞质钙瞬变，以此作为肌浆网释放钙离子的间接测量方法。本方案描述了一种基于FRET的特异性指示剂的使用，该指示剂可直接测量肌浆网腔内的钙信号。

摘要

维持血管平滑肌细胞（VSMCs）肌浆网（SR）内钙离子（Ca2+）稳态水平对其整体健康至关重要。VSMCs 内大部分细胞内 Ca2+ 储存于 SR 中。作为唯一通过质膜-SR 连接结构与胞外空间密切关联的细胞内细胞器，SR 可被视为应对任何 Ca2+ 瞬变异常或细胞所受应激的第一道防线。在 SR 的多种功能中，最重要的一项是介导 Ca2+ 调控信号在细胞内的传递，从而引发广泛的下游细胞反应。目前普遍使用的胞质 Ca2+ 指示剂在研究肌腔内 SR Ca2+ 储存库高度动态变化方面仍显不足，而这些变化尚未被充分表征。本文提供了一种直接、清晰测定 SR 腔内 Ca2+ 水平的详细实验方案。该工具可用于研究 SR Ca2+ 的细微变化，这些变化对细胞正常功能和健康具有重要后续影响。特异性地监测 SR Ca2+ 含量的波动，可为我们提供大量有关细胞对疾病或应激条件响应的信息。本方法采用一种经修饰的靶向 SR 的 Ca2+ 指示剂 D1SR，用于检测在向培养的大鼠主动脉平滑肌细胞（SMCs）引入刺激因子后 Ca2+ 的动态变化。在用 D1SR 指示剂孵育后，通过共聚焦荧光显微镜和基于荧光共振能量转移（FRET）的成像技术，直接观察在基础条件下以及加入可诱导细胞内 Ca2+ 转移的激动剂后，SR 腔内 Ca2+ 水平的变化。

引言

Ca2+ 是体内每个细胞中都大量存在的一种非常重要的离子。它在多种不同的细胞功能中发挥着重要作用，包括细胞生长、增殖、迁移和凋亡1-4。已有充分证据表明，Ca2+ 可通过直接和间接作用影响这些过程，因此，该离子细胞内正常浓度的改变很容易对受影响细胞产生不利后果。肌浆网（SR）被认为是细胞内最大的 Ca2+ 储存库5。SR 和细胞质中 Ca2+ 的稳态水平通常通过该细胞器的 Ca2+ 转运通道持续的内流和外流来维持。细胞因任何形式的损伤或疾病所承受的应激状态，通常伴随着 SR 中 Ca2+ 的显著变化，进而对细胞健康产生长期影响。在最严重的情况下，应激细胞无法恢复并维持 SR 中 Ca2+ 的稳态水平，最终可能导致细胞通过凋亡途径死亡6-8。

当前关于细胞钙的研究2+ 其动态受限于仅有少数研究对细胞器钙进行检测2+ 存储内容直接9-11最常见的做法是测量细胞质中的Ca2+ 水平作为肌浆网Ca变化的间接测量指标2+ 内容 12-14. 在这些实验中，Ca2+ 通常通过使用药物试剂诱导其从肌浆网（SR）中释放，从而导致该细胞器的耗竭（例如 毒胡萝卜素）。随后根据肌质网钙离子变化得出结论2+ 基于细胞质 Ca 的波动2+ 浓度。尽管研究者仍可通过间接方式得出此类结论，但这种SR Ca2+ 测量显然是一种获取此类信息的间接方法，在解释所收集数据方面存在诸多局限性。为了克服这一明显限制，有必要直接测量 Ca 的含量2+ 直接位于肌质网腔内网络中。

能够直接记录肌浆网腔内 Ca2+ 水平的最终结果，关键在于所使用的细胞培养工具和 Ca2+ 指示剂。对于本文所引用的数据，需要特别指出的是，所用的血管平滑肌细胞（VSMCs）来源于一个冻存的细胞系。在所述实验中，细胞在 Dulbecco 改良 Eagle 培养基（DMEM）+ 10% 新生牛血清（NCS） 中培养，传代次数为 22–26 代，并在恒定的 37 °C 及 5% CO2 条件下孵育。例如，采用当前方法，细胞已成功地在一种模拟多种不同类型组织细胞外环境的蛋白混合物上生长15。在肌浆网 Ca2+ 研究中取得成功的关键之一是所用蛋白混合物的类型；在此情况下，必须使用低生长因子型的混合物，以避免该工具中的成分干扰被测细胞内持续发生的正常 Ca2+ 信号传导和离子移动。在实验细胞成功生长后，还需将 Ca2+ 指示剂有效导入这些培养细胞中。这一目标现已可通过使用携带定位于肌浆网的 Ca2+ 指示剂 D1SR 的腺病毒载体实现。为了获得较高的转染效率，细胞必须在成像前至少与病毒载体共孵育 36–48 小时。该制备方法提供了一种可靠的技术手段，可用于高精度、高重复性地测量肌浆网腔内的 Ca2+ 瞬变。

本方案中使用的D1SR指示剂是D1ER Ca2+指示剂的一种改良变体，最初由美国加利福尼亚大学圣地亚哥分校Roger Y. Tsien博士的实验室研发9,16。原始的D1ER属于第二代基因编码的Ca2+指示剂，称为“cameleon”（变色龙型指示剂），其Ca2+敏感范围（0.5–160 µM）远比之前的Ca2+指示剂更宽广9,16。新的变体D1SR由加拿大阿尔伯塔大学Wayne Chen博士慷慨提供，其携带一种突变型钙联接蛋白（calsequestrin）序列（取代了原始D1ER中的钙网蛋白calreticulin序列）。该突变型钙联接蛋白对Ca2+的结合能力降低，从而避免了与肌浆网（SR）腔内内源性钙联接蛋白竞争结合Ca2+的问题11。D1SR指示剂包含截短的增强型青色荧光蛋白（CFP）和黄色荧光蛋白（YFP），二者通过一个含有修饰型钙调蛋白（CaM）和M13序列（肌球蛋白轻链激酶的26个氨基酸残基肽段，可与CaM结合）的连接蛋白相连。CaM-M13序列经过修饰，以防止M13与内源性钙调蛋白结合。此外，为确保指示剂保留在肌浆网内，在CFP的5´端添加了一段钙联接蛋白序列11。当Ca2+结合时，CaM-M13结构域发生构象变化，导致两侧CFP与YFP之间的能量转移增强，表现为FRET信号强度的增加。相反，当肌浆网腔内Ca2+浓度下降时，CaM-M13结构域发生逆向构象变化，导致CFP与YFP之间的能量转移减少，FRET信号强度显著降低。

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方案

伦理声明：所有实验和操作均符合加拿大不列颠哥伦比亚大学温哥华校区的实验室生物安全指南。

1. 用于基于FRET的共聚焦显微镜的35 mm玻璃底培养皿的制备

  1. 在实验前36-48小时，按照以下步骤制备平板。
  2. 从-20 °C保存处取出选定的明胶状蛋白质混合物和0.25%胰蛋白酶-EDTA，置于移动冰浴中保存直至使用。
    注意：包被蛋白混合物在室温下暴露的时间应尽可能短暂，以防止其在使用前凝固。胰蛋白酶溶液也应保持冷藏至使用时；或者，可在完成步骤1.5后从-20 °C保存条件下取出胰蛋白酶。
  3. 制备蛋白混合物与DMEM的1:25稀释液（不含血清，预冷）。将适量体积的蛋白混合物/DMEM转移至各待用培养板中。对于35 mm玻璃底培养皿，加入约200 µl，以完全覆盖皿底内侧的玻璃圆区。
  4. 将培养板置于生物安全柜内室温条件下静置至少30分钟。在此期间，将含10% NCS的DMEM在水浴中预热至37 °C。
  5. 将胰蛋白酶在下一步操作前立即于37 °C水浴中预热。
  6. 使用玻璃移液管和抽吸装置移除培养瓶中现有的DMEM。用温热的无菌PBS清洗瓶底，以去除残留的DMEM。
  7. 从培养瓶底部脱落先前培养的平滑肌细胞：
    注意：在进行此步骤前数天已将细胞接种于培养瓶中，以使细胞在制备培养板前达到所需的汇合度（约80%）。细胞最初悬浮于含10% NCS的20 ml DMEM培养基中，并在37 °C、5% CO₂条件下孵育。2 供应24小时后，更换DMEM培养基，将细胞放回培养箱。此后每48小时更换一次DMEM培养基，直至细胞达到汇合状态。
    1. 用1 ml胰蛋白酶快速冲洗锥形瓶，然后用抽吸法移除1 ml胰蛋白酶。
    2. 加入另外1 ml胰蛋白酶，继续孵育较长时间（约30-60秒），轻轻晃动培养瓶，确保酶液与瓶底全部接触。
    3. 在显微镜下观察细胞脱落程度，直至对从培养瓶表面分离的细胞比例满意为止。反复轻摇胰蛋白酶溶液并检查细胞脱落情况，直至获得满意的细胞分离比例。
      注意：可将烧瓶放回培养箱中约30-60秒，以在37 °C下加快此过程。
    4. 待细胞经胰蛋白酶消化脱落后，向培养瓶中加入含10% NCS的新鲜DMEM以终止胰蛋白酶反应（加入足够体积，使胰蛋白酶终浓度为1/8）th （烧瓶中的总体积）
      注意：例如，使用250 ml培养瓶时，需向1 ml胰蛋白酶中加入7 ml DMEM，最终得到8 ml细胞悬液。
  8. 将所得细胞悬液从培养瓶转移至洁净的（已标记的）50 ml锥形离心管中。
  9. 向每块待处理的培养板中加入1 ml新鲜DMEM培养基（含10% NCS）（培养基量足以维持24小时）。
  10. 轻轻翻转含有细胞溶液的离心管数次，以充分分散可能形成的沉淀。
  11. 将充分混匀的细胞悬液用移液器吸取所需体积加入每孔板中。
    注意：本方案推荐的接种SMCs数量为0.5–0.8 × 106 每35 mm培养皿的细胞数量。具体数目可能因细胞类型而异，各实验室应进行测试并调整。
  12. 沿顺时针/逆时针方向充分旋转每块培养板，确保细胞在玻璃底面均匀分布。

2. 使用携带 D1SR Ca2+ 指示剂的腺病毒载体进行瞬时转染

  1. 向每块培养板中加入培养基和细胞悬液后，将培养板置于37 °C、5% CO2条件下孵育至少1小时，以使细胞充分贴附于培养皿底部的玻璃表面。每隔15分钟在显微镜下观察一次培养板，直至确认细胞已明显贴壁。
  2. 从-80 °C冰箱中取出腺病毒-D1SR分装样品，并置于移动冰浴中，运送至生物安全柜内操作。
  3. 用移液器将所需剂量（感染复数为100）的预冷D1SR加入每块培养板中。
    注意：每块培养板所需腺病毒溶液的体积计算取决于原始储存液的病毒滴度，该滴度以空斑形成单位（PFU）表示。根据我们的经验，推荐使用感染复数（MOI）为100，即每培养板中每个平滑肌细胞（SMC）需感染100个病毒颗粒。
  4. 将感染后的细胞在37 °C、5% CO2条件下孵育过夜。
  5. 次日，更换新鲜培养液，每孔加入1 ml含10% NCS的新鲜DMEM培养基。
  6. 将培养板置于37 °C、5% CO2的湿化培养箱中孵育过夜。

3. 使用基于FRET的共聚焦成像测量肌浆网腔内Ca2+

  1. 过夜后 孵育后，从培养板中移除培养基。
  2. 用 1 ml 含有（单位：mmol·L⁻¹）的温热生理 HEPES-PSS 缓冲液洗涤培养板−1NaCl 140，葡萄糖 10，KCl 5，HEPES 5，CaCl2 1.5 和 MgCl2 1 次（pH 7.4）。
  3. 记录开始前立即加入1 ml新鲜温热的HEPES-PSS缓冲液。
  4. 使用共聚焦显微镜配套软件中的FRET SE（敏化发射）应用程序（或类似功能）进行初步成像。
    1. 应用打开后，点击进入 "设置" 按 Tab 键调整设置，以达到所需的实验条件。
    2. 手动调整通道设置，使细胞依次在440 nm（用于供体和FRET通道）和513 nm（用于受体通道）处被激发。采集488 nm（供体）和535 nm（FRET和受体）的发射波长。
    3. 将光照强度设置为15%透光率，细胞激发曝光时间为150 ms（依次记录CFP供体、FRET和YFP受体三个通道），两次曝光间隔为10秒。
  5. 将培养板固定在显微镜载物台上。
  6. 使用 "活体" 点击按钮以检查图像分辨率。进一步调整设置，直至达到所需分辨率。
  7. 仍在以下 "设置" 标签，使用该设备对样品进行成像 "捕获图像" 按钮
  8. 接下来是 "评估" 标签，选择适用于当前实验的FRET效率计算方法。方法3，使用比率计算法 [EA(i) = B/A]，建议用于涉及如D1SR指示剂等变构蛋白的实验。
  9. 切换至 "图表" 以便在实验过程中以图表形式观察记录的强度值。
  10. 在图像查看器中绘制一个感兴趣区域（ROI），以观察实验过程中该区域在图表上对应的平均强度变化。
    注意：研究者也可选择绘制多个感兴趣区域（ROI），并同时在图表上记录和显示相应的强度值。或者，研究者可先为初始记录划定单个感兴趣区域，之后通过在软件的数据分析版本中打开实验文件，再继续添加多个感兴趣区域。
    注意：有关设置基于FRET实验的详细步骤，可参见FRET应用向导手册。若显微镜未配备FRET向导功能，可使用以下方案手动设置采集参数。
  11. 开始记录，并持续采集数据至少3分钟，以确保在引入目标试剂前获得稳定的基线信号。
  12. 引入 Ca2+移动剂例如 2 µM 毒胡萝卜素；100 nm 内皮素-1）作为耗竭肌浆网Ca2+通过手动移液将预定剂量直接加入培养板中，加样位置应尽可能靠近记录的目标区域。处理后继续记录至所需时间。
  13. 使用共聚焦倒置显微镜的FRET SE程序，配合63倍油浸物镜，采集比率型FRET连续图像（512 × 512像素）。
  14. 采集每个感兴趣区域（ROI）内5-10个SMC细胞簇的成像数据，随后使用基于统计学的软件进行格式化与分析。
    1. 要保存数据以供后续使用，请在记录的轨迹上单击右键，然后选择 "导出" 将记录的平均信号强度电子表格保存至研究者指定驱动器的选项。
    2. 将每次实验的数据进行归一化处理，方法是将每个数据点除以在 0 秒时间点观测到的起始强度值。
    3. 从原始电子表格/部分中手动复制并粘贴相关数据行，将标准化后的数据导入统计分析软件的项目文件中。
    4. 自动生成功率谱图，对应于粘贴到程序中的数据集。
      注意：该程序的默认设置会根据导入的数据生成折线图。可通过点击来修改所显示图形的类型 "选择其他类型的图表" 按钮位于下方 "改变" 主工具栏中找到的标题
    5. 将同一组相同实验中多次独立试验的数据汇总到单个数据表中，以生成针对特定检测的平均曲线。

4. 胞质 Ca2+ 指示剂的制备

  1. 在避光的微量离心管中，将 0.0125 g 普流罗尼克酸（PA）溶于 1 ml 二甲基亚砜（DMSO）中（可将管子置于流动水浴中加热以促进 PA 溶解）。
  2. 从 -20 °C 保存条件下取出一管（50 µg）细胞质 Ca2+ 荧光指示剂染料（Fluo-4 AM）。
  3. 用铝箔包裹染料管，尽可能避免其接触光照。
  4. 用移液器将 45 µl DMSO+PA 溶液加入含有染料的管中。将剩余的 DMSO+PA 溶液用铝箔包裹，室温保存。
  5. 通过反复吹打溶液多次，充分混匀管内成分。或者，将染料管超声处理 10 分钟。
    注意：上述两种方法均可有效使染料在 DMSO+PA 溶液中均匀分散；具体选择取决于研究人员的偏好。若选择超声处理，应在独立区域或房间内进行，以免噪音影响他人。研究人员还应佩戴隔音效果良好的耳罩以保护听力。
    1. 若进行超声处理，先将包裹好铝箔的染料管插入泡沫管架中，然后放入装有约三分之二体积去离子水（dH2O）的超声水浴槽内。
    2. 将超声水浴槽置于独立区域或房间内，开启电源（在启动超声前确保已佩戴防护头戴设备）。随后离开房间，让设备运行 10 分钟后再关闭并取出管子（取出时仍需保持铝箔包裹，尽可能避免光照）。
  6. 将充分混匀的溶液分装至避光微量离心管中（每管 5 µl，共可分装约 10 管）。
  7. 每管均用铝箔包裹，标记后置于干燥剂中，并在 -20 °C 条件下保存，直至使用。

5. 胞质 Ca2+ 的测定

  1. 按照步骤1.1-1.12制备大鼠主动脉平滑肌细胞的培养板。
  2. 在培养48小时后，从培养板中移除培养基。
  3. 移除先前制备的细胞质 Ca 分装样品2+ 从-20 °C保存条件下取出指示剂（5 µl），置于移动冰浴中保存直至使用。
  4. 用 1 ml 含有（单位：mmol·L⁻¹）的温热生理 HEPES-PSS 缓冲液洗涤培养板−1NaCl 140，葡萄糖 10，KCl 5，HEPES 5，CaCl2 1.5 和 MgCl2 1 次（pH 7.4）。
  5. 将指示剂与1 ml温热的HEPES-PSS混合，然后加入培养板中。
  6. 将SMCs与指示剂在室温（24 °C）下孵育1小时。
  7. 从培养板中移除指示剂，并用1 ml温热的生理Hepes-PSS缓冲液洗涤三次。
  8. 记录开始前立即加入1 ml新鲜温热的HEPES-PSS缓冲液。
  9. 使用共聚焦倒置显微镜的63倍油镜采集序列图像（512 × 512像素）。
    1. 手动调整设置，使细胞在488 nm波长下激发，并在555 nm波长处以700 Hz的扫描速度收集发射光信号。
    2. 将光照强度设置为15%透光率，细胞激发曝光时间为150毫秒（即在记录过程中，细胞在指定时间间隔内暴露于光照的时间），两次曝光间隔为5秒。
  10. 将培养板固定在显微镜载物台上并开始记录。
  11. 至少记录3分钟，以确保在引入目标试剂前获得稳定的基线信号。
  12. 引入 Ca2+移动剂例如 2µM 毒胡萝卜素）作为耗竭肌浆网钙的工具2+ （如步骤3.16所述）并在处理后继续记录所需时长。
  13. 使用显微镜专用软件通过平均荧光信号（F/F）记录信号强度0从每个感兴趣区域（ROI）的5-10个SMC细胞簇中采集数据。使用数据分析软件收集、整理和分析成像所得数据。有关使用该软件进行数据采集与分析的详细说明，请参见步骤3.18.1-3.18.5。

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结果

本部分提供了使用所述方法捕获肌浆网腔内 Ca2+ 浓度数据所能获得的结果示例，并与通常采用的通过观察细胞质 Ca2+ 波动来间接测量细胞器 Ca2+ 储存浓度变化的方法进行了比较。

图1A 显示了转染D1SR腺病毒的平滑肌细胞（SMC）培养物在YFP通道（514 nm激发/535 nm发射）中感兴趣区域（ROI）的快照图像。如图所示，尽管所有SMC均表达D1SR，但在同一ROI内不同细胞间的D1SR指示剂表达水平存在明显差异。图1B 展示了一个转染D1SR腺病毒（YFP通道）的SMC荧光图像的二维投影，清晰呈现了广阔的肌浆网（SR）腔内网络中Ca2+的分布情况。图1C 使用CFP（440/488 nm）、FRET（440/535 nm）和YFP（514/535 nm...

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讨论

本方案描述了利用D1SR腺病毒转染VSMC以研究Ca2+ 肌浆网腔内的钙离子浓度。该方法可实现对钙离子的直接测量2+ 该细胞器内的钙离子动态及其在不同钙调节剂作用下向肌质网（SR）内/外的移动情况。该方法对于致力于全面理解肌质网和胞质Ca²⁺变化机制的研究人员具有诸多优势。2+ 水平影响整体细胞健康，以及这些变化之间的相互关系。传统上对细胞内 Ca2+ 运动涉及仅对细胞质 Ca 的变化进行追踪2+ 水平。因此，使用 D1SR 或类似构建体的一个重要优势在于能够监测涉及特定细胞器（如肌质网，SR）的该离子运动，而无需通过间接观察胞质 Ca²⁺ 的变化来对激动剂作用于 SR 的效应做出模糊推断。2+ 由此类操作诱导的水平。同样，一些作用于影响SR Ca2+ 可更高效地用于评估其对细胞器及全细胞范围内钙离子水平的影响2+ 浓度和整体健康状况。正是由于这些优势，通过转染培养细胞表达 D1SR 可提供一种更为直接且互补的方法，用于检测肌浆网腔内 Ca²⁺ 的变化2...

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披露

作者声明不存在任何竞争性经济利益。

致谢

本工作获得了加拿大卫生研究院基金 [MOP-1112666 至 CVB & ME] 的资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
DMEM高糖培养基（含丙酮酸）Life technologies11995-065使用前在37 °C水浴中预热
Matrigel基底膜基质（生长因子减少型，5 ml）Corning356230使用前保存于-20 °C
新生牛血清Sigma-Aldrich使用前保存于-20 °C
35 mm玻璃底培养皿MatTek CorporationP35G-1.5-14-C
250 ml 0.2 μM通气蓝色密封盖锥形瓶BD Falcon353136
胰蛋白酶/EDTA溶液Life technologies25200056使用前保存于-20 °C
50 ml聚丙烯圆锥形离心管BD Falcon352070
D1SRN/AN/A赠品
二甲基亚砜（DMSO）Sigma-AldrichD8779
Pluronic F-127Sigma-AldrichP2443
Fluo 4-AMLife technologiesF-23917使用前保存于-20 °C
1.5 ml黑色微量离心管Argos TechnologiesT7100BK
Leica TCS SP5共聚焦显微镜Leica Microsystems
Leica Application Suite 2.6.3（含FRET SE向导应用）Leica Microsystems
GraphPad Prism 5.0GraphPad Software, Inc.

参考文献

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