清醒小鼠神经元活动的细胞外记录与神经活性物质的微电泳给药相结合

摘要

我们介绍了用于构建电极的方法，可在清醒小鼠中同时记录细胞外神经活动，并在记录位点附近释放多种神经活性物质。该技术能够对目标神经元的潜在局部突触输入进行详细分析。

摘要

在麻醉和清醒动物之间，神经递质与神经调质的活性存在差异，从而导致不同的神经反应。因此，需要能够在清醒动物中操控突触系统的方法，以确定突触输入对神经元信息处理的贡献，同时避免麻醉剂的干扰。本文介绍了用于制备电极的技术方法，可在清醒小鼠中同步记录细胞外神经活动，并在记录位点附近释放多种神经活性物质。通过结合这些操作步骤，我们在头部固定的小鼠下丘神经元中实施了微离子电泳注射 gabazine，以选择性阻断 GABA_A 受体。Gabazine 成功改变了神经元的反应特性，如频率反应区和刺激特异性适应。因此，我们证明了本方法适用于记录单个神经元活动，并可用于解析特定神经递质受体在听觉信息处理中的作用。

所述实验方法的主要局限性在于记录时间相对较短（约3小时），这取决于动物对记录过程的习惯化程度。然而，可在同一只动物上进行多次记录。与用于调控神经传递或神经调制水平的其他实验方法（如全身给药或光遗传学模型）相比，该技术的优势在于药物效应局限于目标神经元的局部突触输入。此外，电极可定制生产，能够根据目标神经结构和神经元类型（例如，调整尖端电阻以提高记录信号的信噪比）调节特定参数。

引言

神经元兴奋与抑制之间的相互作用对于感觉信息的处理至关重要¹。已知麻醉对皮层激活的动力学特性以及突触输入的时间模式具有显著影响^2,3。例如，已有研究发现麻醉剂会改变皮层神经元视觉诱发电反应的持续时间^3,4。此外，麻醉状态与清醒状态下兴奋性和抑制性突触输入之间的比例存在差异^4,5，从而改变了诱发电活动和自发活动的速率^6,7。通过测量突触电导，Haider 及其同事⁴发现，在麻醉状态下，抑制与兴奋的幅度相当；而在清醒状态下，抑制强于兴奋。这些发现促使人们发展出新的实验方法，以研究特定突触输入对清醒动物感觉处理的影响。

通过施加微小电流（数量级为纳安，nA）来精确控制带电神经活性物质的喷射，已被广泛用于研究突触输入的贡献以及假定细胞受体在感觉信息处理中的作用^8-13。该技术称为微离子电渗法（microiontophoresis），可在记录神经元附近局部施加药物，从而实现快速且局限的作用效果。与其他实验干预方法（如系统性注射、微透析或光遗传技术）引起的广泛效应相比，该方法更适用于研究神经活性物质的局部效应。通常采用“背负式”电极配置^14,15，以同时记录目标神经元并递送感兴趣的神经活性物质。该配置由一个记录电极与携带神经活性物质的多通道移液管组合而成。已有多种对Havey和Caspary¹⁴最初描述的实验流程的改进方法被采用。例如，可使用钨电极代替玻璃电极 来记录神经活动¹⁶。已有文献报道的钨电极制备方法^17,18主要包括三个步骤：钨丝尖端的电解蚀刻、玻璃绝缘层包被，以及调节尖端暴露长度以满足记录需求。

听觉神经科学中一个有趣且新兴的研究领域是刺激特异性适应（stimulus-specific adaptation，SSA¹⁹）的研究。SSA 是指神经对重复出现的声音刺激反应特异性降低，而对其他罕见呈现的声音刺激的反应并不产生类似降低。SSA 的重要性在于其可能作为听觉脑中偏差检测的神经机制，以及可能作为听觉诱发电位中晚期失匹配负波成分的神经相关基础^20,21。SSA 现象从下丘（IC）一直延伸至听觉皮层^19,22-24。已有研究表明，GABA_A 受体介导的抑制作用可作为调控 SSA 的增益控制机制^7,16,25，且该过程也被证实会受到麻醉的影响²⁶。本文介绍了一种实验方案，结合了先前描述的方法，用于在清醒小鼠中记录下丘神经元的单细胞放电活动，并在选择性 GABA_A 受体拮抗剂给药前后进行比较。首先，我们描述了“背负式”电极的制备方法，随后介绍了手术操作与记录技术。为验证药物释放的有效性，我们比较了微离子电渗给药加巴嗪（gabazine）前后下丘神经元的感受野特性及其 SSA 水平。

方案

所有实验操作均在萨拉曼卡大学进行，并获得萨拉曼卡大学动物护理委员会以及欧盟（指令 2010/63/EU）关于神经科学研究中使用动物的标准批准，且所采用的方法均符合上述机构的标准。 

1. 钨电极

注意：钨电极的制备基于Merrill和Ainsworth²⁷以及Ainsworth et al.²⁸所述的原始技术，并采用Bullock et al.¹⁷中描述的工作站装置进行。

1. 为记录IC神经元的单细胞胞外活动，应使用尖端阻抗为1.5 - 2.5 MΩ的电极。此处仅简要描述钨电极的制备步骤，详细说明可参见上述参考文献。
2. 将钨丝放入定制的对准工具中（图1A）以帮助将其切割至所需长度。对齐工具由30根针头（25 G）平行粘合而成，针头间距为2 mm，一端设有止挡，用于限制导线长度约为40 mm。用胶带小心固定导线的松散端，然后用锋利的剪刀剪去多余的导线部分。
3. 轻轻地从胶带上取下钨丝，确保所有钨丝仍附着在胶带上。将胶带卷到一根抛光的黄铜芯轴上图1B，C），将导线紧贴主轴，确保形成良好的电连接。
4. 将纺锤体连接至工作站内的5 rpm电机，并将外露的金属丝尖端浸入蚀刻液（KNO₃）中。₂，每80毫升溶液含90克）。将旋转轴倾斜至与蚀刻液表面成45°角。浸入导线尖端，使约1/3的导线与溶液接触。
5. 将碳棒电极浸入蚀刻液中以闭合电路。在主轴旋转的同时，使用弹簧铜编织刷将蚀刻电源施加到主轴上。调节通过电极和蚀刻液的电流至250 mA。当电流降至200 mA时，停止尖端蚀刻。导线尖端将被蚀刻成非常细小的尖点。
6. 将一根锋利的金属丝穿过火焰，以去除油脂和粘合剂残留物。将金属丝（钝端朝前）插入一支硼硅酸盐玻璃毛细管（外径1.5 mm，内径0.86 mm）中 下端用油泥封堵。将移液管在顶部和底部垂直夹紧。使用加热线圈（直径5 mm，深度5 mm）和悬挂的活塞牵拉移液管。当金属丝因活塞的重量被向下牵拉时，熔融玻璃在金属丝周围形成一层极细的涂层。
7. 使用四硼酸钠熔融小珠去除电极尖端锐利端部覆盖的玻璃。制备小珠时，将四硼酸钠（约0.25 g）与少量水（约0.5 ml）混合，缓慢置于加热元件上，加热至熔化形成直径约2 mm的小珠。加热元件的温度由电位计控制。将小珠和加热元件放置在固定于台面的操纵臂上，移动操纵臂，使小珠在低倍显微镜下聚焦。
8. 将带玻璃涂层的金属丝固定在载玻片上，并置于显微镜下。使用载物台调节旋钮移动载玻片，直至金属丝尖端和四硼酸盐小珠清晰对焦。加热小珠至轻微熔化，将金属丝尖端插入约10–15 µm。关闭加热电位计。随着小珠冷却，其体积收缩，从而去除电极尖端的玻璃涂层，暴露出底层的钨金属。此时钨电极已准备就绪，可供使用。

2. 多通道玻璃移液管的制备

1. 用热缩管保护多管玻璃毛细管（五管H型配置）的末端，以增强拉制仪夹具的抓握力并防止断裂，然后将一根毛细管放入垂直拉制仪中。
2. 为获得约15 mm的尖端长度，将拉制仪参数设置如下：加热温度：84，辅助磁力：49，主磁力：38。根据具体设备配置以及更换加热元件后的情况，对这些参数进行微调。
3. 拉制毛细管，得到两根尖端封闭的移液管。使用模型胶将一根移液管固定在载物片上，在显微镜下用精细剪刀或镊子，或手术刀的平面端，将移液管尖端折断至外径约为20 - 30 µm。若断裂边缘过于粗糙，可采用第1.7步所述的四硼酸盐珠技术进行修整。
4. 将一根钨电极（来自第1节）安装在固定于显微镜载物台上的微型三维微操纵器末端的20 G针头制成的夹具中。用镊子将电极尖端距顶端约30 mm处弯曲5 - 10°。
5. 在显微镜下，仔细将钨电极对准多管毛细管的尖端。对准后，缓慢下放电极直至其接触多管毛细管，并嵌入上部两根毛细管之间的凹槽中。滑动电极尖端，使其从多管毛细管尖端伸出约15 - 20 µm。尽可能减小电极与多管毛细管之间的夹角，以实现更好的结合和更小的整体直径。
6. 在距离尖端约5 mm处施加少量光固化胶粘剂。注意避免胶水接触尖端，以防堵塞多管毛细管的通道。
7. 使用蓝色LED灯固化胶水。如有需要，可重复进行胶水涂抹和固化，以增强结合强度。
8. 轻柔移动显微镜载物台，使钨电极末端从夹具中释放。将组合电极从载物片上取下。
9. 用一小段热缩管包裹组合电极的中部，并在玻璃表面涂上快速固化的环氧树脂，以进一步加固钨电极与多管毛细管的连接。

3. 用于微离子电渗的药物

注意：用于微离子电渗的药物在水中溶解后必须带有电荷。请查阅文献以确认目标药物是否适用于本实验方法。此处以 GABA_A 受体拮抗剂加巴嗪（gabazine）为例描述该操作流程。

1. 使用 0.2 µm 注射器滤器过滤蒸馏水，以对水进行灭菌并确保不含溶质。用此蒸馏水配制约 1,000 µl 的 20 mM gabazine 溶液。
2. 使用细尖 pH 电极，并用经 0.2 µm 滤膜过滤的 NaOH 将稀释液的 pH 调整至 4。
3. 将 100 - 200 µl 分装液储存于 -20 ºC。在记录当天解冻。当天，在固定动物之前，使用装有柔性塑料针头的 100 µl 微量注射器，向多管电极的管腔（每管 3 - 5 µl）中填充药物。

4. 手术与头固定装置植入

1. 在两只雄性CBA/J小鼠（Mus musculus）中进行实验，体重分别为27 g和30 g。遵循Bryant及其同事²⁹、Portfors及其合作者^30-32以及Duque和Malmierca²⁶的手术和记录操作流程。
2. 在手术前数天，对动物进行抓握训练，并通过让其自由探索来使其适应记录室环境。每天进行3次训练，每次持续至少30分钟，以使动物在记录过程中更加镇静和舒适。
3. 通过肌肉注射给予氯胺酮（50 mg/kg）和赛拉嗪（10 mg/kg）混合物以麻醉小鼠。该剂量可使动物深度麻醉约1小时。根据需要，追加初始剂量三分之一的补充剂量。
4. 将动物置于设定温度为38 ± 1 ºC的加热毯上，并使用两个耳杆和一个咬合杆将动物头部固定在立体定位仪中。注意避免耳杆刺破鼓膜。
5. 通过滴加一滴眼用凝胶保护眼睛。
6. 使用剪刀剃除头皮毛发，并用聚维酮碘对皮肤进行消毒。
7. 使用手术刀沿中线做切口，暴露颅骨，并剥离覆盖顶骨及枕骨前部的骨膜。
8. 将一个轻质硬铝头固定柱（重量约0.65 g，长度30 mm，图2A）粘接到颅骨上，其底部为圆形平面（直径5 mm）。将一根银丝粘接在头固定柱中部，两端保持自由。该银丝将作为电生理记录的参考电极。
9. 在颅骨和头固定柱基部涂一层光固化粘合剂。等待10秒后，将头固定柱放置于顶骨前部区域的中线上。
10. 为获得有效的粘结强度，使用蓝光光源照射粘合剂20秒进行光固化。
11. 使用电钻和小型钻头，在头固定柱基部周围及后方钻三个孔。
12. 将两枚手表螺丝（长约2 mm）旋入已钻好的孔中，作为颅骨与头端之间的额外接触点。螺丝需旋转1½圈以确保紧密贴合。使用镊子测试螺丝，确保其无松动。
13. 将银质接地线的末端插入第三个孔中，确保其与硬脑膜接触。滴加少量防水型氰基丙烯酸酯胶水将导线固定于颅骨上。
14. 使用光固化复合树脂加固头固定柱与颅骨之间的连接。覆盖头固定柱基部、银丝下部及螺丝，注意不要延伸至人字缝后方，以便记录时留出操作空间。使用蓝光光源进行固化。
15. 牵开颈部后方肌肉靠近颅骨附着处的部分。使用小型环钻（直径2.35 mm）在人字缝下方、偏离中线处钻一个圆形窗口，以暴露下丘（IC）。当骨缘松动后，用精细镊子轻轻提起覆盖骨片。若出现出血，用冷的无菌生理盐水冲洗止血。
16. 用复合树脂在窗口周围制作一个小型围堰（约1 mm宽，约1 mm高），并进行光固化。
17. 用抗生素软膏覆盖暴露的颅骨和肌肉。然后用无菌生理盐水润湿暴露的下丘表面，并用凡士林覆盖，填满围绕记录窗口所形成的凹槽。
18. 皮下注射布托啡诺 （0.03 mg/kg，用无菌生理盐水稀释1:10）作为镇痛剂。
19. 将动物留在加热毯上直至苏醒，随后将其放回饲养笼中恢复三天后再进行记录实验。将动物单独饲养于大鼠饲养笼中，以防止同笼动物清除凡士林或头固定柱触碰金属网盖。当动物单独饲养时，应在笼内提供一定的环境丰富化物品。同时每日更换木屑以预防感染，并仔细检查动物恢复情况，确保无任何不适表现。还需检查凡士林是否覆盖记录窗口，以保护暴露的脑组织。

5. 电生理记录与微离子电渗入

1. 恢复后，让动物有足够时间适应记录环境及其头部被固定的状态。通过将头柱固定在支架上，使小鼠坐在为其体型定制的软质泡沫固定装置上来完成适应过程。 大小（图2B这将限制小鼠的活动，有助于其保持安静。
2. 从10分钟的训练开始，逐步增加时长至120分钟。在训练过程中，按照固定时间间隔以甜味液体（如炼乳，按30:70比例用水稀释）奖励动物。³³随后，在记录期间，于记录开始时、结束时或未分离出神经元时给予相同的奖励。
3. 如果动物在记录前非常兴奋，可注射少量镇静剂乙酰丙嗪（2 mg/kg，腹腔注射）。镇静剂可能影响目标神经系统的实验结果。
4. 让动物在记录室内自由探索5 - 10分钟。
5. 将动物身体放入泡沫材质的定制缓冲固定装置中（图2B).
6. 将头固定装置固定到与立体定位仪框架相连的支架上（图2C此时可给予动物液体奖励。
7. 用棉质毯子覆盖动物身体，并使用塑料半圆筒和胶带松散固定。
8. 去除记录窗口处的凡士林，并用温热的无菌生理盐水冲洗。
9. 记录神经活动并进行加巴青的离子电渗应用。
   1. 将多管电极放置在其由微驱动器控制并连接至显微操作仪的电极架上。
   2. 使用小型鳄鱼夹连接记录用导线。将正极端连接至钨电极末端，接地端连接至与硬脑膜接触的银丝。
   3. 将一根未包被的银丝放入每个管腔内，使其一端与溶液接触，另一端可连接至微离子电渗仪。按照仪器制造商的说明，将这些端部连接至微离子电渗装置。
   4. 将多管电极移动至其尖端接触脑表面。滴加温热的无菌生理盐水以防止脑组织干燥。此时施加保持电流（加巴喷丁为 -10 nA，具体药物请参考相关文献）以防止药物从电极管尖端泄漏，同时寻找单细胞单位放电活动。
   5. 使用标准技术分离单个神经元的细胞外活动。获取该神经元的频率响应区域（FRA）。 即能够引发神经元反应的声音频率和强度组合，因为该神经元对这些声音具有敏感性^34-36.
   6. 选择两个能引发相似放电频率和放电模式的频率（f1 和 f2）。在奇球范式下，将这两个频率分别作为稀有刺激和重复刺激呈现。
      注意：简而言之，在失匹配范式中，一个频率（f1）作为高频出现的重复刺激呈现，而第二个频率（f2）则作为罕见出现的偏差刺激，随机穿插在重复刺激之中。在第二个失匹配序列中，两种刺激的相对概率被反转。该刺激范式的详细信息此前已有描述^22,37.
   7. 通过将电流切换至正值（10 - 20 nA）来释放加巴嗪。再次获取频率响应面积（FRA），并在加巴嗪作用下重复 oddball 范式。持续施加电泳直至在放电率上观察到明显效应；通常需要 5 - 20 分钟，具体时间取决于所用药物、其浓度以及电泳电流的大小。重复记录流程以获得药物作用下的数据值。
   8. 通过将电流恢复至维持水平来停止注射。通过监测FRA或对oddball范式的反应是否恢复至对照水平，以等待药物效应被洗脱。
      注意：记录会话可持续 2 - 3 小时 每天一次，若动物出现任何不适或挣扎迹象则应提前终止。给予奖励液体，并用凡士林覆盖记录腔。

6. 数据分析

1. 在加巴喷丁注射前后以及注射期间测量FRA和SSA水平。
2. 通过常用-SSA指数（CSI）和频率特异性SSA指数（SI）来量化SSA反应的强度，具体方法如下所述 此前^{19,22,23,38,39}CSI 和 SI 反映了神经元对罕见刺激的反应与对重复刺激反应之间的归一化差异。CSI 和 SI 的正值表明，神经反应（每刺激的放电次数）在罕见音调下高于重复音调。
3. 比较对照组与药物喷射条件下的数据。

结果

我们记录了下丘（IC）中4个分离良好的单个神经元的单细胞活动。清醒小鼠中进行细胞外记录时获得的典型信噪比见图3B。图4A显示了在使用加巴喷丁阻断GABA_A受体前后，每个神经元的频率响应区（FRA）。观察到反应强度（每刺激脉冲的峰电位数）增加，同时频谱调谐范围变宽。在由所有呈现频率和强度诱发的神经反应所累积的刺激前-后时间直方图中，诱发反应的增强也十分明显（图4B）。

在神经元的频率反应区（FRA，见图4A中的叉号）内选择一个或两个频率对，作为重复或稀有声音在奇球范式中呈现，以研究其反应中的显著性刺激适应（SSA）水平。对于两个示例神经元，声音诱发对每个频率（f1 和 f2）的反应在加巴嗪注射前和注射期间分别以点阵图形式显示在图5A,B中。对于这两个示例神经元，点阵...

讨论

在清醒动物中进行神经活性物质的微电泳是一种强大的技术，可用于探究和解析特定突触输入对单个神经元活动的作用^40,41。更重要的是，该方法能够在不受麻醉剂潜在干扰的情况下，确定神经递质和神经调质对神经环路的影响。在此，我们证明了在清醒小鼠的下丘（IC）中施加加巴赞（gabazine）可显著改变其频率调谐特性（图4A）、时间反应模式（图4B）以及显著性刺激适应（SSA）（图5）。

所述实验方法的主要局限性在于记录时间相对较短（约3小时），这取决于动物对记录过程的习惯化程度。另一方面，可在同一只动物上进行多次记录。使用微离子电渗法时，尚不明确所施加的神经活性物质在周围组织中的扩散距离。因此，这种操作可能不仅影响被记录的神经元，还可能影响周围的胶质细胞和神经元，从而引发对神经网络活动的潜在效应。例如，Candy 及其同事⁴²已证明，某些通过离子电渗递送且未被快速清除的分子可扩散至多达600 µm的距离。在小鼠的下丘（IC）中，这一范围将覆盖大部分树...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
钨丝	Harvard Apparatus LTD	33-0099	0.005 英寸 × 3 英寸
硼硅酸盐玻璃毛细管	Harvard Apparatus LTD	30-0053	无灯丝标准壁硼硅酸盐玻璃，外径 1.5 mm，内径 0.86 mm，长 100 mm
多通道玻璃毛细管	World Precision Instruments	5B120F-4	5 通道毛细管，长 4 英寸，外径 1.2 mm，带灯丝
Diaplus	DiaDent	2001-2101	光固化粘合剂，用于将钨电极固定在玻璃多通道移液管上
G-Bond	GC Corporation	2277	光固化粘合剂，用于将头固定装置粘附至动物颅骨
Charisma	Heraeus Kulzer	66000087	光固化复合材料，用于增强头固定装置与颅骨之间的粘结强度
Araldit Cristal	Ceys		双组分环氧树脂，用于进一步加固钨电极与玻璃多通道移液管的连接
加热毯	Cibertec	RTC1
立体定位仪	Narishige	SR-6N	适用于小鼠的改装型号
微离子电渗装置	Harvard Apparatus LTD	Neurophore BH-2	包含 IP-2 离子电渗泵（每个药物输送通道各一个）和平衡模块
多通道玻璃移液管拉制仪	Narishige	Model PE-21
LED 灯	Technoflux	CV-215	5 W，波长 430–485 nm
MicroFil	World Precision Instruments	MF34G-5	柔性塑料针头，34 AWG
Imalgene	Merial		氯胺酮，100 mg/mL
Rompun	Bayer		赛拉嗪，20 mg/mL
加巴青 / SR-95531	Sigma	S106	用蒸馏水配制约 1000µL 的 20 mM 加巴青溶液，并将 pH 调至 4