使用基于刃天青的药物敏感性检测靶向生物膜相关Staphylococcus aureus

摘要

大多数细菌感染都会形成生物膜。由于其所处的环境，与生物膜相关的细菌通常在表型上具有耐药性。因此，开发能够杀灭生物膜中细菌的新型抗菌分子成为当务之急。我们建立了一种检测方法，用于快速筛选可有效清除生物膜的抗菌化合物。

摘要

大多数致病菌在感染过程中能够形成生物膜，但由于生物膜的操作和评估较为困难，绝大多数实验室研究仍使用浮游细胞进行。本文以金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）为例，介绍一种基于 peg 板的生物膜检测方法。细菌生物膜在连接于 96 孔微孔板盖上的 peg 上生长，通过将 peg 盖轻轻浸入缓冲液中进行清洗后，转移至药物处理板中。经过进一步培养后，再次清洗并转移至最终的恢复板，在恢复板中荧光染料刃天青（resazurin）作为细胞活性的指示剂。该检测方法在进行动力学读数时，具有显著提高的操作便捷性、可靠性和可重复性，并能提供丰富的数据。此外，该方法还可调整为中等通量的药物筛选模式，采用终点荧光读数代替动力学检测，为药物发现研究提供可行路径。

引言

致病性微生物可形成生物膜 体内 导致非急性慢性感染 ¹生物膜相关感染是涉及植入外来物体的医疗操作中一个严重的危险因素例如， 人工骨替代物、乳房假体，或气管插管和导尿管的置入 ²在这些情况下，抗感染治疗几乎总是必要的，因为基于生物膜的感染即使在免疫功能健全的个体中也极少能自行清除。 Staphylococcus aureus 是使用侵入性医疗器械期间发生与生物膜相关并发症时最常见的病原体之一 ³.

遗憾的是，生物膜作为一种保护性屏障，其本身特性使其对抗治疗的能力强于浮游细胞^1,4，因此对药物临床疗效的预测进行评估，是新药研发初期以及耐药性监测中的关键环节。目前人们日益认识到，专注于浮游培养的实验室条件可能无法真实反映实际临床疾病状况⁵。更为复杂的是，生物膜表型的重复再现较为困难，现有的生物膜模型操作繁琐，且存在较高的实验间和实验内变异度⁶。因此，许多研究人员出于实际需要，往往默认采用针对浮游细胞的药物敏感性检测，从而可能忽视了细菌毒力和疾病进程中的一个重要方面。

本文描述了利用基于96孔板的生物膜系统检测预形成生物膜中细菌（特别是S. aureus）活性的实验方案^7,8。尽管生物膜形成与药物处理的步骤....

方案

1. 生物膜的起始

1. 在营养丰富的培养基中培养能形成生物膜的微生物。接种 金黄色葡萄球菌 从甘油储备液中将Newman菌株接种于10 ml Mueller-Hinton培养基中。所有涉及操作 S. aureus 佩戴手套并在生物安全柜内操作。
2. 在37 °C下于旋转摇床（100-200 rpm）中孵育16小时。
3. 测定 OD₆₀₀ 使用分光光度计和标准比色皿（光程：1 cm）测定培养物的光密度。
4. 计算制备 20 ml 接种液所需培养物的体积（V），其 OD_{600（接种量）} 在经Chelex处理的Roswell Park Memorial Institute培养基（CRPMI）中，浓度为0.1⁹ 使用公式：[V = 20 ml×0.1/OD]_{600（培养）}]
   注：参考文献9提供了CRPMI制备的详细信息。
   1. 加入上述计算好的培养液体积至离心管中，于10,000 × g离心1分钟以收集细胞。为制备生物膜接种物，吸除废弃的培养基，并将细胞沉淀重悬于20 ml CRPMI中。
5. 将接种物倒入25 ml储液槽中。
6. 小心地将无菌96孔板的盖子垂直向上取下。
   注意：必须注意避免污染从盖子上垂下的插针。可将盖子倒置放在生物安全柜内干净....

结果

刃天青检测法的灵敏度足以可靠地检测出在药物清除后能在无药培养基中复制的极少量活细胞。在本方法中，我们将最小生物膜清除浓度定义为在24小时内未观察到刃天青颜色转化的最低浓度。刃天青检测依赖于代谢活跃细胞中存在的氧化性分子，这些分子可将染料颜色由蓝色转变为粉红色。因此，染料的颜色变化是细胞生长的指标，并可通过荧光酶标仪进行定量。在本文中，测试了新铜试剂及其铜络合物（Cu-新铜试剂）对生物膜相关 S. aureus 应用一种基于布局的方法 图1. 实验方案执行过程中获得的数据为 OD₆₀₀ 生物膜起始板的读数作为质量控制（数据未显示），其OD₆₀₀ 完成刺激后对培养板底部进行读数（图2A)，以及恢复培养板中刃天青转化为其荧光代谢产物试卤灵的动力学记录（图2B）。此外，挑战平板的终点图像可用于目视检查刃天青的转化情况（图2C如果实验目的仅需对刃天青还原反应进行是/否判.......

讨论

本文介绍了一种改良的生物膜检测方法，用于评估待测抑制剂对S. aureus生物膜的活性，重点关注生物膜相关细胞的代谢状态。尽管所述的生物膜诱导和处理流程主要参照了制造商的建议，但使用刃天青（resazurin）染料检测并定量在24小时抑制剂处理后仍存活的生物膜相关细胞，显著简化了制造商推荐的细胞回收（通过水浴超声）及后续通过菌落形成单位（CFU）计数来定量活细胞的操作流程。制造商推荐的该流程至少包含5个额外的操作步骤，每个步骤均易引入误差、劳动强度大，且难以实现自动化。简化读数流程的优势使 peg plate 检测法在高通量操作和应用中更具吸引力。

尽管该实验步骤较多，但其原理相对简单，关键步骤较少。最重要的是，必须能够重复培养出质量一致的生物膜，这是获得可重复结果的关键。此外，在取放 peg-lid（插针盖）时必须格外小心：任何与孔壁的接触都可能破坏生物膜，导致结果偏差。更重要的是，充分的洗涤至关重要：若未能在任一阶段彻底去除浮游细胞，将无法准确测量与生物膜相关的细菌数量。然而，洗涤也不能过于剧烈；过多的洗涤步骤可能开始破坏生物膜本身，从而导致结果不一致。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
穆勒-欣顿培养基	Oxoid	CM0405	遵循制造商的建议
RPMI培养基	Corning	17-105-CV
CRPMI	参考文献9		使用Chelex 100树脂对RPMI-1640培养基螯合处理1小时，然后添加10%未经螯合的RPMI-1640进行补充
Chelex 100树脂	Bio Rad	142-2822
MBEC板	Innovotech	19111
刃天青钠盐	Sigma	R7017	800 µg/ml 溶于去离子水中     过滤除菌
微量培养板振荡平台	Heidolph Titramax 1000
Cytation 3酶标仪	Biotek
Gen5软件	Biotek		用于记录和分析刃天青的转化情况
新铜试剂	Sigma	N1501	用100%乙醇配制10 mM储备液，-80 ºC保存
硫酸铜	Acros Organics	7758-99-8	用水配制100 mM储备液，4 ºC保存
Cu-新铜试剂复合物	自制		通过等摩尔浓度的新铜试剂与硫酸铜混合制备，用CRPMI培养基稀释至所需浓度
庆大霉素	Sigma	G3632-1G