使用基于刃天青的药物敏感性检测靶向生物膜相关Staphylococcus aureus

摘要

大多数细菌感染都会形成生物膜。由于其所处的环境，与生物膜相关的细菌通常在表型上具有耐药性。因此，开发能够杀灭生物膜中细菌的新型抗菌分子成为当务之急。我们建立了一种检测方法，用于快速筛选可有效清除生物膜的抗菌化合物。

摘要

大多数致病菌在感染过程中能够形成生物膜，但由于生物膜的操作和评估较为困难，绝大多数实验室研究仍使用浮游细胞进行。本文以金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）为例，介绍一种基于 peg 板的生物膜检测方法。细菌生物膜在连接于 96 孔微孔板盖上的 peg 上生长，通过将 peg 盖轻轻浸入缓冲液中进行清洗后，转移至药物处理板中。经过进一步培养后，再次清洗并转移至最终的恢复板，在恢复板中荧光染料刃天青（resazurin）作为细胞活性的指示剂。该检测方法在进行动力学读数时，具有显著提高的操作便捷性、可靠性和可重复性，并能提供丰富的数据。此外，该方法还可调整为中等通量的药物筛选模式，采用终点荧光读数代替动力学检测，为药物发现研究提供可行路径。

引言

致病性微生物可形成生物膜 体内 导致非急性慢性感染 ¹生物膜相关感染是涉及植入外来物体的医疗操作中一个严重的危险因素例如， 人工骨替代物、乳房假体，或气管插管和导尿管的置入 ²在这些情况下，抗感染治疗几乎总是必要的，因为基于生物膜的感染即使在免疫功能健全的个体中也极少能自行清除。 Staphylococcus aureus 是使用侵入性医疗器械期间发生与生物膜相关并发症时最常见的病原体之一 ³.

遗憾的是，生物膜作为一种保护性屏障，其本身特性使其对抗治疗的能力强于浮游细胞^1,4，因此对药物临床疗效的预测进行评估，是新药研发初期以及耐药性监测中的关键环节。目前人们日益认识到，专注于浮游培养的实验室条件可能无法真实反映实际临床疾病状况⁵。更为复杂的是，生物膜表型的重复再现较为困难，现有的生物膜模型操作繁琐，且存在较高的实验间和实验内变异度⁶。因此，许多研究人员出于实际需要，往往默认采用针对浮游细胞的药物敏感性检测，从而可能忽视了细菌毒力和疾病进程中的一个重要方面。

本文描述了利用基于96孔板的生物膜系统检测预形成生物膜中细菌（特别是S. aureus）活性的实验方案^7,8。尽管生物膜形成与药物处理的步骤基本遵循制造商的建议，但我们提出了一种信息量更高的替代方法，用于量化处理后生物膜的存活率。简言之，将细菌在 peg 板中培养，使其在连接于板盖上的突出 peg 上形成生物膜。生物膜形成后，将 peg 轻轻浸入装有 PBS 的新板孔中，以去除浮游细胞。随后，将带有生物膜的 peg 板盖转移至含有不同浓度待测抗生素的新处理板中进行药物处理。二次孵育后，取出板盖，清洗后转移至含有刃天青（resazurin）染料的恢复板中，进行最终孵育。刃天青的还原反应可通过动力学方式连续记录，或在设定的恢复期结束后进行终点读数。这种基于染料的生物膜活性定量方法与原始方案中繁琐的菌落形成单位（CFU）计数法有显著区别⁷。药物处理板的OD₆₀₀测定值和刃天青还原动力学分别作为浮游菌和生物膜细胞活性的检测指标，提供了一种快速、可靠、信息丰富且技术简便的生物膜存活检测方法。

方案

1. 生物膜的起始

1. 在营养丰富的培养基中培养能形成生物膜的微生物。接种 金黄色葡萄球菌 从甘油储备液中将Newman菌株接种于10 ml Mueller-Hinton培养基中。所有涉及操作 S. aureus 佩戴手套并在生物安全柜内操作。
2. 在37 °C下于旋转摇床（100-200 rpm）中孵育16小时。
3. 测定 OD₆₀₀ 使用分光光度计和标准比色皿（光程：1 cm）测定培养物的光密度。
4. 计算制备 20 ml 接种液所需培养物的体积（V），其 OD_{600（接种量）} 在经Chelex处理的Roswell Park Memorial Institute培养基（CRPMI）中，浓度为0.1⁹ 使用公式：[V = 20 ml×0.1/OD]_{600（培养）}]
   注：参考文献9提供了CRPMI制备的详细信息。
   1. 加入上述计算好的培养液体积至离心管中，于10,000 × g离心1分钟以收集细胞。为制备生物膜接种物，吸除废弃的培养基，并将细胞沉淀重悬于20 ml CRPMI中。
5. 将接种物倒入25 ml储液槽中。
6. 小心地将无菌96孔板的盖子垂直向上取下。
   注意：必须注意避免污染从盖子上垂下的插针。可将盖子倒置放在生物安全柜内干净的表面上。
7. 使用200 µl多通道移液器，向底部板的A至G行每孔加入125 µl接种物。
8. 在H行每孔中加入125 µl无菌CRPMI培养基作为无菌对照。
9. 取下带钉盖子，将钉头朝下悬于板底上方。仔细对准每个钉头与对应的孔位，避免板与钉头发生物理接触。对准后，小心地将盖子向下放低。注意避免错位，因为一旦钉头接触到底板后再进行调整，可能会污染H行的无菌对照。
10. 用石蜡膜将板盖密封，防止蒸发，并放入可密封的塑料袋中，确保密封严实。尽量减少袋内空气体积，以最大限度降低蒸发。
11. 37 °C、5% CO₂条件下静置培养48小时₂ 培养箱
    注意：48 小时的生长对 S. aureus，但会因所用生物体的不同而有所差异。
    注意：尽管静态培养是优化该检测方法的良好起点，但在微孔板振荡器上以150 rpm轻轻振荡是一种可能的替代方案，或可促进某些生物膜的形成 S. aureus 分离物

2. 生物膜挑战平板的制备

1. 在进行生物膜挑战实验的当天，取一个新的96孔板，向B至H行的每个孔中加入100 µl已平衡至室温的CRPMI培养基。为避免结果不一致，应使用当插针插入时可容纳200 µl培养基、且孔的尺寸与生物膜起始板相同的96孔板。
2. 将最多4种待测化合物分别用1.0 ml CRPMI稀释至目标终浓度的2倍，以补偿步骤2.7中的最终稀释效应。
   注意：一个合适的起始浓度为浮游细胞抑制浓度的8倍。
3. 在A1至A3孔中加入200 µl化合物1，在A4至A6孔中加入化合物2，在A7至A9孔中加入化合物3，在A10至A12孔中加入化合物4。
4. 使用多通道移液器进行系列稀释，从A行向B行转移100 µl，并混匀。
5. 以此方式逐孔转移100 µl，每次转移后充分混匀，至F行停止。
6. 混匀后，将F行各孔中的100 µl液体排入废液容器中。不要向G行和H行转移任何液体。
7. 使用多通道移液器向每孔加入100 µl CRPMI，使最终体积达到200 µl。最终的板布局参见图1。

3. 生物膜挑战

1. 向一个新的无菌96孔板中加入200 µl磷酸盐缓冲液（PBS），该孔板的孔尺寸需与生物膜起始板的孔尺寸完全相同。
2. 从已孵育的生物膜起始板上移除塑料袋和石蜡膜。
3. 垂直向上提起盖子，避免插针与板底接触，以免损伤生物膜。保留底部板用于后续的OD₆₀₀分析（见步骤3.8）。
4. 将带插针的盖子放入含有PBS的板中（来自步骤3.1），以冲洗掉浮游细胞。将插针浸入PBS中5秒，取出后再浸入一次，注意不要使插针碰撞孔壁。
5. 将清洗后的带插针盖子放入挑战板中。避免插针与底板之间不必要的接触，以防损坏生物膜，导致结果不一致。
6. 用石蜡膜密封板，并放入可密封的塑料袋中，操作如步骤1.10所述。
7. 将板置于5% CO₂培养箱中，在37 °C下静置孵育24小时。
8. 取步骤3.3中保留的生物膜起始板底部，使用多通道移液器重悬各孔中的细菌，并用合适的酶标仪测定OD₆₀₀，以确认除H行的无菌对照孔外，其余各孔均有细菌生长。

4. 生物膜测定

1. 使用配备有孵育室并能够进行动力学荧光检测的酶标仪，用于检测刃天青的转化。设置持续24小时的动力学荧光测定程序，激发波长为530 nm，发射波长为590 nm。
2. 将孵育室温度设为37 °C，并每20分钟读取一次酶标板。根据仪器制造商的说明，设置酶标仪从酶标板底部进行检测。
3. 使用多通道移液器向无菌96孔板中加入200 µl PBS，制备洗涤板。
4. 向20 ml CRPMI培养基中加入400 µl浓度为0.8 mg/ml的刃天青储备液，配制生物膜回收培养基，使刃天青终浓度为16 µg/ml。
   注意：刃天青为已知皮肤刺激物，操作时应穿戴实验服、防溅护目镜和手套。选用CRPMI作为生物膜回收培养基是因为其背景信号最低，但可根据需要替换为Mueller Hinton培养基。
5. 使用多通道移液器向新的96孔板的每孔中加入150 µl生物膜回收培养基。
6. 将挑战板从孵育箱中转移至生物安全柜内，小心移除塑料袋和密封膜。
7. 取下挑战板的带钉盖板，并按照步骤3.4所述方法用PBS冲洗浮游细胞。保留挑战板底部用于后续的OD₆₀₀分析（见步骤4.10）。
8. 冲洗后，将带钉盖板放入含有生物膜回收培养基的酶标板底部。
9. 用石蜡膜包裹酶标板四周，注意不要遮挡边缘孔的底部。包裹完成后立即把酶标板放入酶标仪中，并启动之前在步骤4.1中设定的刃天青动力学检测程序，开始为期24小时的动力学读数。
10. 为定量分析在挑战过程中可能产生或不产生的浮游细胞生长情况，使用微孔板读数仪检测整个挑战板底部的OD₆₀₀值。操作步骤请参照步骤3.8中的说明。
    注意：应小心重悬各孔中的内容物，因为从生物膜脱落的细胞倾向于在孔底成团生长。孔内任何气泡都会严重干扰OD₆₀₀读数，因此在检测前必须避免或清除气泡。

结果

刃天青检测法的灵敏度足以可靠地检测出在药物清除后能在无药培养基中复制的极少量活细胞。在本方法中，我们将最小生物膜清除浓度定义为在24小时内未观察到刃天青颜色转化的最低浓度。刃天青检测依赖于代谢活跃细胞中存在的氧化性分子，这些分子可将染料颜色由蓝色转变为粉红色。因此，染料的颜色变化是细胞生长的指标，并可通过荧光酶标仪进行定量。在本文中，测试了新铜试剂及其铜络合物（Cu-新铜试剂）对生物膜相关 S. aureus 应用一种基于布局的方法 图1. 实验方案执行过程中获得的数据为 OD₆₀₀ 生物膜起始板的读数作为质量控制（数据未显示），其OD₆₀₀ 完成刺激后对培养板底部进行读数（图2A)，以及恢复培养板中刃天青转化为其荧光代谢产物试卤灵的动力学记录（图2B）。此外，挑战平板的终点图像可用于目视检查刃天青的转化情况（图2C如果实验目的仅需对刃天青还原反应进行是/否判...

讨论

本文介绍了一种改良的生物膜检测方法，用于评估待测抑制剂对S. aureus生物膜的活性，重点关注生物膜相关细胞的代谢状态。尽管所述的生物膜诱导和处理流程主要参照了制造商的建议，但使用刃天青（resazurin）染料检测并定量在24小时抑制剂处理后仍存活的生物膜相关细胞，显著简化了制造商推荐的细胞回收（通过水浴超声）及后续通过菌落形成单位（CFU）计数来定量活细胞的操作流程。制造商推荐的该流程至少包含5个额外的操作步骤，每个步骤均易引入误差、劳动强度大，且难以实现自动化。简化读数流程的优势使 peg plate 检测法在高通量操作和应用中更具吸引力。

尽管该实验步骤较多，但其原理相对简单，关键步骤较少。最重要的是，必须能够重复培养出质量一致的生物膜，这是获得可重复结果的关键。此外，在取放 peg-lid（插针盖）时必须格外小心：任何与孔壁的接触都可能破坏生物膜，导致结果偏差。更重要的是，充分的洗涤至关重要：若未能在任一阶段彻底去除浮游细胞，将无法准确测量与生物膜相关的细菌数量。然而，洗涤也不能过于剧烈；过多的洗涤步骤可能开始破坏生物膜本身，从而导致结果不一致。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
穆勒-欣顿培养基	Oxoid	CM0405	遵循制造商的建议
RPMI培养基	Corning	17-105-CV
CRPMI	参考文献9		使用Chelex 100树脂对RPMI-1640培养基螯合处理1小时，然后添加10%未经螯合的RPMI-1640进行补充
Chelex 100树脂	Bio Rad	142-2822
MBEC板	Innovotech	19111
刃天青钠盐	Sigma	R7017	800 µg/ml 溶于去离子水中     过滤除菌
微量培养板振荡平台	Heidolph Titramax 1000
Cytation 3酶标仪	Biotek
Gen5软件	Biotek		用于记录和分析刃天青的转化情况
新铜试剂	Sigma	N1501	用100%乙醇配制10 mM储备液，-80 ºC保存
硫酸铜	Acros Organics	7758-99-8	用水配制100 mM储备液，4 ºC保存
Cu-新铜试剂复合物	自制		通过等摩尔浓度的新铜试剂与硫酸铜混合制备，用CRPMI培养基稀释至所需浓度
庆大霉素	Sigma	G3632-1G