TAPE：一种受植物中普遍存在的化合物启发而研发的可生物降解止血胶，用于外科手术应用

摘要

我们描述了一种制备具有有效止血能力的可生物降解医用胶的最简单方案。TAPE 是一种由单宁酸（广泛存在于植物中的化合物）与聚乙二醇混合形成的不溶于水的超分子聚集体，其耐水粘附力比商用纤维蛋白胶高出 2.5 倍。

摘要

本视频介绍了一种制备可生物降解外科胶水的最简协议，该胶水具有有效的止血能力，且防水粘附强度优于市售组织粘合剂。由于医用粘合剂使用便捷、创伤极小，作为缝合线和缝合钉的潜在替代工具已受到广泛关注。尽管目前已有一些组织粘合剂的制备方案，包括市售的纤维蛋白胶和氰基丙烯酸酯类材料，但大多数方案需要进行一系列有机分子的化学合成，或在生物来源材料的情况下采用复杂的蛋白质纯化方法即，纤维蛋白胶）。此外，开发兼具高黏附性能和可生物降解性的外科胶黏剂仍面临挑战，主要难点在于难以在体内湿润环境中实现良好的黏附效果。本文介绍一种新型医用胶黏剂（TAPE）的制备方法，该方法通过物理混合一种源自植物的耐水黏附分子与另一种组分，形成不溶于水的超分子聚集体，再依据质量差异进行分离而获得。 T安尼克 Acid（TA）以及一种广为人知的生物聚合物聚乙二醇（PEG）。通过我们的方法，TAPE在水存在条件下表现出高粘附强度，是商用纤维蛋白胶的2.5倍。此外，TAPE在生理条件下可生物降解，可用作有效的止血胶以应对组织出血。我们预期TAPE将在多种医疗场景和药物递送应用中得到广泛应用，例如用于黏膜黏附的聚合物、药物储库等。

引言

在过去十年中，由于可生物降解/生物吸收性粘合剂在使用上的便利性以及在手术过程中对组织侵入性较低，人们已努力尝试用其替代当前用于闭合伤口的外科缝线和钉合钉。市面上的组织粘合剂可分为四类：（1）氰基丙烯酸酯衍生物¹，（2）由凝血酶通过酶促反应将纤维蛋白原转化为纤维蛋白聚合物而形成的纤维蛋白胶^2,3，（3）基于蛋白质的材料，如经化学或物理交联的白蛋白和/或明胶^4,5，以及（4）基于合成聚合物的粘合剂⁶。尽管这些粘合剂已在多种临床应用中使用，但每种粘合剂均存在固有的缺点和局限性，可能阻碍其广泛使用。基于氰基丙烯酸酯的粘合剂对组织具有较高的粘附强度，但在降解过程中产生的氰乙酸酯和甲醛等有毒副产物常引发显著的炎症反应⁷。纤维蛋白胶以及基于白蛋白或明胶的材料存在传播动物源性传染性成分（如病毒）的安全隐患：纤维蛋白胶来源于人血浆，而明胶类粘合剂则来源于包括牛、鸡、猪和鱼在内的动物⁸。尽管已有少数基于合成聚合物的粘合剂获得美国食品药品监督管理局（FDA）批准，但大多数由合成聚合物制成的粘合剂在简化制造工艺步骤和实现良好生物相容性方面仍面临困难⁹。最重要的是，所有粘合剂在湿润组织上的机械强度和粘附力均较差¹⁰。近年来，受海洋贻贝^11-13、壁虎¹⁴、兼具贻贝与壁虎特性的仿生结构¹⁵以及内寄生蠕虫¹⁶启发的仿生组织粘合剂，因其可调节的机械性能、粘附性能及良好的生物相容性，正成为现有医用粘合剂的有前景替代品。然而，迄今为止，在这些粘合剂成为商业化产品之前，仍有一些问题有待解决¹⁷。

在此，我们报道一种全新的医用胶水TAPE，其名称源于植物来源的粘附性分子单宁酸（Tannic acid, TA）与生物惰性聚合物聚乙二醇（Poly(ethylene glycol), PEG）之间通过分子间氢键作用形成。TA是一种典型的可水解鞣质，广泛存在于植物的次生代谢过程中。由于其具有抗氧化、抗诱变和抗癌特性，TA受到广泛关注，并已被证明可与多种聚合物发生超分子相互作用，例如聚（N-异丙基丙烯酰胺) (PNIPAM) 和聚(N聚乙烯基吡咯烷酮（PVPON）以形成逐层自组装（LbL）薄膜^18-20 和药物释放微胶囊^21-23在本研究中，我们发现单宁酸（TA）可作为一种高效的防水粘附功能基团，用于制备医用粘合剂TAPE。通过与TA简单混合，原本抗污的聚合物聚乙二醇（PEG）转变为一种超分子胶水，其粘附强度相比商用纤维蛋白胶提高了2.5倍，且即使在水存在条件下，仍可在多达20次的粘附-脱离循环中保持稳定的粘附性能。该粘合剂的止血能力已在肝脏出血模型中得到验证。 体内 并在数秒内表现出良好的止血能力。作为首个源自植物的粘合材料，TAPE在相关领域具有重要意义，可为解决现有仿生方法的局限性提供新的思路。此外，由于其制备方法简单、可规模化生产、降解速率可调，以及具有优异的耐湿粘附性能，我们预期TAPE将在多种医学与药学应用中得到广泛使用，例如黏膜粘附剂、药物释放贴片、伤口护理敷料等。

方案

所有动物护理和实验均按照韩国科学技术院（KAIST）机构审查委员会（IRB）提供的伦理协议进行。

1. TAPE 的形成

1. 配制单宁酸（TA）溶液时，将一个4 ml的玻璃小瓶置于磁力搅拌器上，加入1 ml蒸馏水和一个搅拌子。向小瓶中加入1 g单宁酸，以200 rpm的转速轻轻搅拌超过1小时，使其完全溶解于水中。当TA完全溶解后，混合液变为呈棕色的透明溶液。
2. 通过将1 g聚乙二醇（PEG）粉末（4臂型，10 kDa；线性，4.6 kDa）加入1 ml蒸馏水中，再涡旋混合数秒形成白色浆液，以配制PEG溶液。将此浆液置于60 °C培养箱中加热10分钟，直至白色浑浊完全变为澄清。
   注意：分子量为10 kDa的PEG熔点约为55–60 °C，4 kDa的PEG熔点为53–58 °C。熔融后的PEG可与水混溶，因此可在水中达到高达1 g/ml的浓度并形成澄清溶液。一旦在高温下形成澄清的PEG溶液，冷却至室温后仍可保持稳定。
3. 在微量离心管中，加入329 µl步骤1.2中制备的PEG（4臂型，10 kDa）溶液和671 µl步骤1.1中制备的TA溶液（若使用分子量为4.6 kDa的线性PEG，则加入311 µl PEG溶液和689 µl TA溶液）。使用窄头刮刀轻轻混合这两种粘稠、类似蜂蜜的溶液，使其均匀混合。
   注意：两种溶液均较为粘稠，因此操作人员必须缓慢而充分地使用移液器吸取和转移溶液，避免产生气泡或剪切损伤。
4. 将步骤1.3中制得的混合物在配备固定角转子的离心机中以12,300 × g离心3分钟。
5. 使用移液器小心尽可能多地去除上清液，并收集已沉淀的产物：即为完全形成的TAPE。TAPE形成后，可将其储存在冰箱（4–8 °C）中，保存数周。 注意：TAPE在用于外科应用前，可通过γ射线辐照或电子束处理进行灭菌。

2. TAPE粘附强度的测量 

1. 去除猪皮组织上的所有脂肪后，使用皮肤活检打孔器切割出两块直径为 6 mm 的猪皮组织。
   注意： 猪皮组织取自健康猪的 flank 皮肤，购自韩国大田市当地肉类市场。
2. 将市售的氰基丙烯酸酯胶水涂抹在每块组织的外侧，并将组织固定在金属杆上。
   注意： 金属杆用作辅助手柄，以避免机器直接夹持组织。因此，可根据拉伸试验机的配置替换为其他材料。
3. 在组织的一侧滴加一滴 TAPE（一滴 TAPE 约为 3–6 mg）。然后，将另一块组织置于两块组织内侧之间，均匀涂抹 TAPE，使两块组织如 图 2A 所示相互粘附。
4. 随后，手动反复粘附和分离两块组织数次，以均匀混合并最大化组织与 TAPE 之间的界面。
5. 使用 UTM 装置小心夹住每根金属杆的两端。粘附强度由使经 TAPE 粘合的两块组织分离所需的作用力决定。首先施加 20 N 的力持续 1 分钟。接着，以 1 mm/min 的速率通过仪器将两根金属杆向相反方向拉伸，直至组织完全分离。
   注意： 数据将以各金属杆运动所检测到的力-距离（F-D）曲线形式给出。
6. 通过将步骤 2.5 中获得的 F-D 曲线上显示的最大力（kN）除以试样表面积（即 3.14 × (0.003 m)²），计算 TAPE 的粘附强度。
7. 为监测在水存在条件下的粘附强度，向两块组织之间的分离区域加入 20 µl 水，立即重新粘合，并使用仪器再次进行分离测试。

3. 体外 降解测试

1. 剪下一个微量离心管的管盖（直径 = 8 mm），称量该管盖的质量，记为 W_c。
2. 在管盖中加入 150 mg 的 TAPE，再次称量整体质量，记为初始总质量 W₀。
   注意：切勿在管盖中过量填充 TAPE。TAPE 的高度应低于管盖顶部，否则在步骤 3.4 的孵育过程中，搅拌产生的 PBS 缓冲液流可能受到 TAPE 的物理阻碍。
3. 将装有 TAPE 的管盖放入细胞培养瓶（75 cm²）中，并向培养瓶中加入 50 ml PBS 缓冲液（1×，pH 7.4），使管盖中的 TAPE 完全浸没于 PBS 缓冲液中，如 图 3A 所示（n = 5）。
4. 将步骤 3.3 中制备的细胞培养瓶置于轨道摇床孵育器中，在 37 °C 下孵育，模拟生理条件，并以轻柔搅拌（50 rpm）进行。
   注意：保持搅拌速度为 50 rpm。过高的转速可能导致 TAPE 崩解。
5. 在每个时间点，从细胞培养瓶中取出装有 TAPE 的管盖，用氮气吹干后称量管盖及残留 TAPE 的质量，记为该时间点的质量 W_t。更换新鲜的 PBS 缓冲液，在完成每次 W_t 测量后重新开始振荡孵育。
6. 根据以下公式计算相对残留质量（%）。
   相对残留质量（%）= (W_t  - W_c) / (W₀  - W_c) × 100%

4. TAPE 的止血能力

       注意：所有动物实验均应遵循韩国卫生与福利部提供的指南和伦理规程进行。

1. 为了评估 体内 止血能力，参见参考文献中所述的出血小鼠肝脏模型 ²⁴.
2. 用替来他明-唑拉西泮（33.333 mg/kg）和赛拉嗪（7.773 mg/kg）腹腔注射麻醉15只小鼠（正常ICR小鼠，6周龄，30–35 g，雄性），每组5只。为确认麻醉效果，轻捏小鼠足爪，观察是否出现缩足等反应。 等等。 无活动表明动物已充分麻醉，可进行手术。
3. 为防止动物眼睛干涩，在麻醉期间应充分涂抹兽医专用眼膏。通过腹部正中切口暴露肝脏，并用18 G针头刺破肝脏以诱导出血。
4. 用无菌纱布擦去流动的血液，立即在出血部位滴加100 µl TAPE或纤维蛋白胶（阳性对照）。
   注意： 使用TAPE后，由于其对伤口组织具有高度抗血液干扰的黏附特性，无需进一步缝合。对于阴性对照组，出血部位不进行任何处理。
5. 每种情况下，在肝脏下方放置一张已知质量的滤纸，以收集损伤部位流出的血液。每隔30秒更换一次滤纸。 4 次即，2 分钟）。
6. 每30秒收集一次滤纸，测量每张滤纸上吸收血液的质量。动物实验结束后，通过CO₂ 窒息安乐死

结果

TAPE 是一种超分子聚集体，通过将含有单宁酸（TA，1 g/ml 溶于蒸馏水）和聚乙二醇（PEG，1 g/ml 溶于蒸馏水）的两种水溶液按 2:1 的体积比混合后离心而形成（图 1A）。混合比例是实现高粘附强度的关键因素；当以 2:1 的比例混合时，25 个 TA 单元中的 20 个羟基（-OH）与 PEG 中的每个醚键（-O-）相互作用，从而形成最多的分子间氢键，获得最佳的粘附性能。剩余的 5 个 -OH 单元似乎与 TA 分子内相邻的羰基（C=O）发生分子内氢键结合（图 1B）。当任一组分超过 2:1 的体积比时，粘附强度显著下降²⁵。氢键也可能是与组织发生作用的关键分子级相互作用。调控 TA 与 PEG 之间用于内聚作用的分子间和分子内氢键，以及 TA 与组织之间用于粘附作用的氢键，可能是 TAPE 作为一种有效外科粘合剂的合理作用机制。

为测量粘附强度，...

讨论

我们开发了一类全新的止血粘合剂，命名为TAPE，其灵感来源于植物来源的多酚类化合物TA所具有的耐水性分子相互作用。TA是一种典型的可水解单宁，因其抗氧化、抗菌、抗诱变和抗癌特性而受到广泛关注。

制备TAPE的过程极为简单、可规模化且环境友好，仅需将两种水溶液一步混合，随后离心，无需任何其他化学合成步骤。

双组分混合方案是形成传统产品中所用组织粘合剂最典型且最简单的方法，例如纤维蛋白胶。该方法是在将纤维蛋白原和凝血酶应用于组织之前立即混合而成³。然而，对于氰基丙烯酸酯胶和基于合成聚合物的粘合剂，其组分的制备需要多步化学合成。此外，在基于蛋白质材料的情况下，有时会使用高毒性化学物质作为其中一个组分，以化学交联由聚合物前体组成的另一组分，例如通过戊二醛固化的胶以及含有甲醛和间苯二酚的粘合剂。

在使用兔子的动物研究中，经戊二醛固化的材料在肺和肝组织中表现出强烈的体内炎症反应，尽管该材料已获美国食品药品监督管理局（FDA）批准用于主动脉组织。...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
单宁酸	Sigma-aldrich	403040
聚环氧乙烷，四臂，羟基封端	Aldrich	565709	平均 Mn ~ 10,000
聚乙二醇	Aldrich	373001	平均 Mn 4,600
活检打孔器	Miltex	33-36	直径 = 6 mm
阿罗尼卡 α	Toagosei Co., Ltd.		瞬干胶
万能试验机（UTM）	Instron	5583
微量离心管	SPL life science	60015	1.5 ml
培养皿	SPL life science	10090	90 × 15 mm
磷酸二氢钠	Sigma	S5011	1× PBS 成分
磷酸氢二钠	Sigma	S5136	1× PBS 成分
氯化钠	Duchefa biochemie	S0520.5000	1× PBS 成分
恒温振荡培养箱	Lab companion	SIF6000R
ICR 小鼠	Orient bio	Normal ICR mouse	6 周龄，30–35 g，雄性
替来他明-唑拉西泮（Zoletil 50）	Virbac
赛拉嗪（Rompun）	Bayer
PrecisionGlideTM 针头（18 G）	BD	302032	18 G
滤纸	Whatman	1001 125	直径 = 125 mm
Parafilm 封口膜	Bemis Flexible Pakaging	PM996