在免疫细胞在不同组织与疾病相关的分布和小鼠实验评价性自身免疫性脑脊髓炎的诱导

摘要

本手稿描述了实验性自身免疫性脑脊髓炎 （EAE） 模型的诱导和评分方法，以及使用流式细胞术和定量 PCR 分别评估淋巴结、脾脏、血液和脊髓中免疫细胞分布和 mRNA 细胞因子水平，在不同的疾病阶段。

摘要

多发性硬化症是推定为炎症性自身免疫疾病，它在中枢神经系统（CNS），导致认知和运动功能障碍的特征是病变的形成。实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是MS的有用的动物模型，是因为它的特征还在于通过损伤形成在CNS，运动功能障碍，并且也由自身免疫和炎性反应驱动。一项所述的EAE模型被诱导与来自髓鞘少突胶质蛋白_{（MOG）35-55}小鼠衍生的肽。在EAE小鼠制定一个渐进的病程。这当然分为三个阶段:临床前阶段（第0天 - 9），疾病发作（10天 - 11）和急性期（12天 - 14）。 MS和EAE是由渗透到中枢神经系统自身反应性T细胞诱导。这些T细胞分泌趋化因子和细胞因子而导致进一步的免疫细胞的募集。因此，在脊髓D中的免疫细胞的分布uring这三种疾病的阶段进行了研究。以突出的T细胞，B细胞和单核细胞的活化/增殖/累积开始时的疾病的时间点，在淋巴结，脾和血液中的免疫细胞的分布也被评估。此外，一些细胞因子（IL-1β，IL-6，IL-23，TNFα，IFNγ）的三种疾病相的水平进行测定，以深入了解该疾病的炎性过程。最后，该数据提供了免疫细胞的EAE病理过程中的功能信息的概述。

引言

多发性硬化症（MS）及其相应的动物模型，实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE），显示出在中枢神经系统（CNS）的自身免疫性神经炎症的变化。早期主动MS和EAE的病变被浸润免疫细胞的存在表征。 MS的病因至今不明，但市场普遍认为涉及髓鞘由自身反应性T细胞介导的​​破坏。这些自身反应性T细胞分泌促炎性细胞因子和趋化因子，以吸引其他免疫细胞诸如B细胞，单核细胞和嗜中性粒细胞从循环。单核细胞分化成巨噬细胞。由自身反应性T细胞分泌干扰素γ（IFNγ）的极化将巨噬细胞促炎巨噬细胞。促进少突胶质细胞的细胞凋亡的促炎性巨噬细胞释放细胞因子和活性氧。少突胶质细胞的死亡导致脱髓鞘。此外，B细胞分化为plasma细胞和针对髓鞘释放的自身抗体，最终导致髓鞘退化。髓鞘的丧失导致轴突和神经元的退化和由此在CNS代表MS ¹的主要特征的病变部位的形成。在外围，T细胞和B细胞中的淋巴结被激活，它们在脾增殖并通过循环迁移到中枢神经系统。单核细胞和嗜中性粒细胞增殖的骨髓和也通过循环迁移到中枢神经系统。

从骨髓，脾和淋巴结进入血液或从血流进入CNS白细胞外渗是一个多步骤的过程，依赖于几个因素，包括白细胞和内皮趋化因子和趋化因子受体介导的分子间的相互作用。由各种细胞类型产生的趋化因子可免疫reactio期间被诱导通过像肿瘤坏死因子α（TNFα），IFNγ和白细胞介素-6（IL-6），随后募集免疫细胞炎症^2,3的部位的细胞因子Ñ。免疫细胞呈现在其表面上的趋化因子受体的子集，这取决于细胞类型和迁移途径的炎症部位。因此，CXCR2，CCR1和CXCR1是在骨髓和血液⁴成熟嗜中性粒细胞中表达，和它的配体，CXCL2，CCL5或CXCL6结合，分别激活嗜中性粒细胞，并促进其粘附到内皮和随后的细胞的迁移进入组织^5-9。 CCL2和CCL20吸引单核细胞和Th1 / Th17细胞^10，其分别表示CCR2 ¹¹和CCR6 ^12。 CCR1和CCR5，通过不同的细胞类型，包括T细胞，单核细胞和巨噬细胞¹³表示，结合CCL3，CCL5和CCL7和MS ¹⁴期间上调。 CXCR3表达于T细胞结合CCL9，CCL10和CCL11 ^15。

以MS治疗的一个主要策略是免疫细胞的耗竭或预防免疫细胞浸润进入CNS。因此，具体的趋化因子受体的阻断已经在EAE影响。拮抗或CCR1 ^{16，CCR2 17}的基因缺失，CCR7 ¹⁸或CXCR2 ¹⁹降低EAE病理学，而拮抗或CCR1 ²⁰的基因缺失，CCR5 ²⁰或CXCR3 ²¹没有降低的病理学。因此，具体的趋化因子受体的白细胞上表达为后者的浸润进入CNS关键和决定EAE的过程。

免疫细胞的耗竭为MS患者的有效治疗策略，因为渗透免疫细胞释放细胞因子，如TNFα，IL-6和IL-1β，这反过来，促进炎症过程或神经元²²的降解。此外，自动反应性Th1细胞释放IFNγ，这反过来又刺激巨噬细胞释放的TNFα，IL-1β和IL-23。

这个手稿描述的EAE，免疫细胞分布以及在EAE小鼠的各种组织中的细胞因子水平（mRNA）的测定的诱导。细胞在不同时间点的疾病过程中被分离，以提供所述炎性过程并最终导致在CNS损伤形成的时间依赖性的概述。

方案

道德守则:我们的实验过程由Regierungspräsidium达姆施塔特（德国）的伦理委员会批准并确认国家和欧洲法规。所有作出了努力，以尽量减少动物的痛苦，减少使用动物的数量。

1. EAE模型

1. EAE模型的感应
   1. 使用10至13周龄的雌性129S4 / SvJae×C57BL / 6小鼠为EAE的诱导。
   2. 给小鼠皮下注射，到上部和下背部，所述致脑炎MOG _{35 - 55（}髓鞘少突胶质糖蛋白）的肽（200微克），在200微升完全Freund`s佐剂（CFA）含有400微克结核杆菌乳化。
      注意:作为一个负，非疾病诱导假控制，含有结核杆菌 ，在相同的体积和通过相同的途径不完全弗氏佐剂，都可以使用。
   3. 疗法eafter，并再次24小时后，给小鼠百日咳毒素的腹膜内注射（总共0.2微克，在200μl磷酸盐缓冲盐水，PBS稀释）。使用未经处理的小鼠作为对照组，以能够比较患病健康的动物。
      注意:也可以以诱导EAE 200 - 300微克MOG _{35 - 55}肽，300 -在CFA 500 ​​微克结核杆菌和0.2 - 0.3微克百日咳毒素中的0.1体积- 0.2毫升，每注射。
   4. 每天开始一周​​注射后，检查小鼠的临床症状（见步骤1.2.1）
      注意:发病的一天中不同的实验而变化，但在我们的实验室条件下，这是大约11天，因此，在这里14天被定义为后3天发病。在本研究中所有小鼠开发临床症状。
2. 小鼠的评分
   1. 通过分类临床评分临床症状如下:0）没有招牌，0.5）的尾巴末端瘫痪，1）尾部完全瘫痪，1.5）跛行的尾巴和后腿轻度乏力，2）跛行的尾巴和后腿严重虚弱，2.5）柔弱的尾部和瘫痪一只后腿，3）柔弱的尾部和两条后腿瘫痪，3.5）两个后肢和一个前肢无力瘫痪（小鼠达到这个分数进行安乐死，与当地的道德准则保持）。

2.流式细胞仪分析单细胞的制备

注:抗体混合物中含有1微升CD45-Vioblue，2微升的CD8 eFluor650，0.5微升的CD11b-eFluor605，0.5微升F4 / 80-PE-Cy7的，1微升CD3-PE-CF594，CD4-V500，0.5微升的CD11c的-AlexaFluor700，1μl的CD19-APC-H7和1μlLy6G-APC-Cy7的。

注意:如果你把血液，淋巴结，脾和脊髓那么程序如下:小鼠深深isofl的组合麻醉urane和氯胺酮（100mg / kg的体重）（以每分钟卡波金2％）。接下来打开胸腔，与心脏内取出粘血，用冷PBS灌注心脏内的老鼠。然后取出淋巴结其次是脾，最后脊髓。如果不需要心内灌注小鼠然后通过颈部脱位安乐死深度麻醉下的小鼠。

1. 脾细胞的分离
   1. 麻醉小鼠用异氟烷（在每分钟卡波金2％）和氯胺酮（100mg / kg的体重）的组合。
   2. 用80％异丙醇湿切口区，以避免与毛发的任何污染和纵向打开胸腔，无需穿刺深层组织，用剪刀。
   3. 用冷PBS pH 7.0的²³心内灌注的小鼠。
      注:脾脏位于左肋下的左上腹部象限。如果只脾进行研究，这个器官可能被灌注前，为了去除retain的所有细胞类型的兴趣。
   4. 取出脾切除大约1/8和称重。储存在冰上在PBS样品。
   5. 通过一个70微米的目筛（置于50ml管）挤压脾组织，使用2毫升注射器的柱塞。
   6. 用5毫升PBS洗网格。离心1800 XG 3分钟。重悬500微升裂解液沉淀。
      注意:在此阶段，可能有必要使如果，以后，一个替代FACS分析方法用于不采用珠粒（见第3节）的差分细胞计数。
   7. 孵育在室温（RT）下10分钟，并加入500μlPBS中。在室温下（RT）650 XG离心6分钟。
   8. 重复用500μl的PBS洗涤步骤。弃上清，重悬细胞沉淀在100微升0.2％牛血清白蛋白（BSA）/ PBS中，加入2微升Fc受体-1（FCRI）封闭缓冲液，并在室温下孵育在黑暗中15分钟。
   9. 加入13微升的tibody混合物，孵育在室温15分钟在黑暗中，在650 XG在RT加入500μlPBS中并离心6分钟。弃去上清液。
      注意:生产商的染色程序建议的单个洗涤，但背景染色的额外减少可以由一个或两个以上的倍任选重复洗涤步骤来实现。
   10. 悬浮于500μlPBS中的细胞沉淀（对于蛋白质分离或可能运行缓冲液，以潜在地减少细胞聚集），并将其转移到流式细胞管的流动。保持细胞在冰上。
2. 淋巴结细胞的分离
   1. 麻醉小鼠用异氟烷（在每分钟卡波金2％）和氯胺酮（100mg / kg的体重）的组合。
   2. 用80％异丙醇湿切口区域和纵向打开胸部用剪刀。用冷PBS pH 7.0的²³心内灌注的小鼠。
   3. 为了分离腹股沟淋巴结，小心取出皮肤喜的区域p和仔细挑选淋巴结出来的脂肪组织与镊子。权衡腹股沟淋巴结和样品在PBS中储存在冰上。
      注意:我们在研究，因为O`Connor 等人用腹股沟淋巴结肿大。发现活化的单核细胞，巨噬细胞，中性粒细胞和T细胞的高数量均出现在EAE诱导²⁴后腹股沟淋巴结。
   4. 挤压通过一个70微米的筛网筛使用2毫升注射器的柱塞的淋巴结（置于50ml管）。
   5. 用5毫升PBS洗网格。离心2400 XG 8分钟。重悬在100μl0.2％BSA / PBS将细胞沉淀，加入2微升FCRI封闭缓冲液，并在室温下孵育在黑暗中15分钟。
   6. 添加13微升抗体混合物，在黑暗中孵育在室温15分钟后，在室温650 XG加入500μlPBS中并离心6分钟。
   7. 弃上清，重悬在300微升PBS中细胞沉淀（或一个合适的运行缓冲液），并将其传送到一个流式细胞管。
3. 血细胞分离
   1. 加入50微升20毫米的HEPES至50微升的血液（用EDTA稳定），并加入500μl裂解液。在室温下孵育10分钟，加入500μlPBS中。离心在在RT 650 xg离心6分钟。弃上清，重复洗涤步骤。
   2. 重悬在100μl0.2％BSA / PBS将细胞沉淀，加入2微升FCRI封闭缓冲液，并在室温下孵育在黑暗中15分钟。
   3. 添加13微升抗体混合物，在黑暗中孵育在室温15分钟后，在室温650 XG加入500μlPBS中并离心6分钟。弃上清，重悬细胞沉淀在300微升PBS中，并转移到流式细胞管的流动。
4. 脊髓细胞的分离
   1. 麻醉小鼠用异氟烷（在每分钟卡波金2％）和氯胺酮（100mg / kg的体重）的组合。
   2. 用80％异丙醇湿切口区域和纵向打开胸腔用剪刀。用冷PBS pH 7.0的²³心内灌注的小鼠。
   3. 湿切口区域的背面并重新进行纵行剪开用手术刀和去除皮肤。
   4. 切出脊柱的腰椎部分（其支配后肢），并将其与PBS填充注射器冲洗提取脊髓。切出大约腰脊髓的1/3，权衡这和样品在PBS中储存在冰上。
   5. 离心机在250×g离心在4℃下2分钟。弃上清，加入500微升细胞脱离溶液和HBSS（1:1）。加入3毫克/毫升胶原酶A和1单位/ ml的DNA酶I，decollat​​e通过反复上下吹打细胞和以400rpm在37℃振荡孵育30分钟。
      注意:如果优选的，所述细胞悬浮液可以污染髓鞘和细胞碎片通过密度梯度离心可提高流式细胞测量流量的灵敏度，从而减少背景自发荧光的的被清除ð需要被收购的事件数（参见3.5节）。
   6. 离心在250 xg离心在RT 2分钟。弃上清，重悬在1ml 10％胎牛血清（FCS）的丸粒/ Dulbecco氏最小基本培养基（DMEM）中，并通过重复的向上和向下的移液再次decollat​​e细胞。
   7. 离心在250 xg离心在RT 2分钟。重复洗涤步骤。
   8. 重悬在1ml的PBS将细胞沉淀，并通过使用2毫升注射器的柱塞70微米网状筛（置于50ml管）挤压脊髓。
   9. 用4毫升的PBS洗涤网格。离心在1800 xg离心在RT 3分钟。弃去上清液，重悬在100微升0.2％BSA细胞沉淀/ PBS，加入2微升FCRI封闭剂，并在室温下孵育在黑暗中15分钟。
   10. 添加13微升抗体混合物，在黑暗中孵育在室温15分钟后，在室温650 XG加入500μlPBS中并离心6分钟。
   11. 弃去上清液，重悬细胞PELLE吨500μl的PBS（或一个合适的运行缓冲液），并将其转移到流式细胞管的流动。

3.流式细胞分析

1. 滴定所有抗体事先确定由Olesch 等 ²⁵描述最佳浓度。
2. 使用抗体捕获补偿珠单色补偿，根据manufacturer`s说明创建多色彩补偿矩阵。
3. 控制日常使用根据manufacturer`s指示特定珠的仪器校准。
4. 流式细胞仪直接测量流量前，加入30微升流式细胞仪绝对计数标准的细胞（隔离见2.1，2.2，2.3，2.4），以确定绝对细胞计数。代替使用计数珠的细胞进行计数。
5. 占用样品（从脾脏，淋巴结和血细胞:100000事件，脊髓500000事件）到血细胞计数器的流次分析使用特定的流式细胞仪软件。
   1. 打开流式细胞仪软件，并通过按按钮"添加样本"添加FCS 3.0文件。
   2. 双击打开添加的文件。调整为x轴和y轴的通道。选择感兴趣的细胞群创建栅极（ 见图4）。

4.定量PCR分析

1. mRNA的分离和转录成cDNA
   1. 通过酚氯仿从腰脊髓（1/3），脾（1/8）和腹股沟淋巴结中提取基因，并用乙醇沉淀^26。
      1. 为此，均质化在1ml硫氰酸胍 - 苯酚混合物中的组织，孵育10分钟。加入200μl的氯仿和10分钟再次孵育。
      2. 离心步骤之后（18,000 xg离心4℃15分钟），洗上层水相是用500μl异丙醇和离心机（18,000 xg离心在4 8分钟C）。
      3. 用500μl乙醇和离心步骤（18,000 xg离心在4℃下5分钟）后洗涤沉淀，干燥在真空浓缩的粒料（在30℃下5分钟）。此后，重悬在30微升水中沉淀。
   2. 从血液中提取的mRNA，离心机将500μlEDTA稳定的血液​​（300 xg离心10分钟，4℃）。
      1. 取血沉棕黄层，包含白血球，并稀释在1ml裂解溶液（150mM的_氯化铵 ，100mM的_碳酸氢钠 ，0.1毫钠EDTA pH 7.4）中。
      2. 10分钟温育在RT后，离心细胞，在650×g离心6分钟，之后用PBS洗两次。
      3. 提取根据制造商的说明使用试剂盒提取RNA白血细胞（白细胞）的mRNA的表达。
   3. 执行使用用于cDNA合成的试剂盒，包括根据制造商的说明随机六聚体合成cDNA。使用200毫微克的mRNA的CDN综合。
2. 定量PCR
   1. 量化的特定mRNA的量，则使用1微升的cDNA，1μM的正向/反向引物和荧光DNA根据制造商的说明²⁷结合染料。请参阅表1的引物组的序列。测量的IL-1β的CT值，IL-6，IL-23，IFNγ，TNFα和PPIA（肽基脯氨酰异构酶）使用定量PCR系统。
   2. 相对确定的表达使用比较CT（循环阈值）方法^27。
      1. 对于这一点，正常化的靶基因PPIA的表达水平的CT值通过从目标基因中减去PPIA的平均CT值，如在以前的研究（巴塞尔姆斯等人 ^{28，Schiffmann} 等人 ^{29，Schiffmann}描述等人 ^30）。随后，计算出所谓的ΔΔCT值，使用的，标准化ΔCT值从EAE小鼠的靶基因未处理的小鼠的靶基因的表达水平的，再由在从EAE小鼠的ΔCT值的未处理小鼠中减去平均ΔCT值。
      2. 获得靶基因的相对mRNA表达，使用以下公式计算:2的比例^{- ΔΔCT。}
3. 测试每个引物的特异性。确定使用2％琼脂糖凝胶³¹中的扩增片段的大小。片段大小示于表 1。

结果

图1给出了本文中介绍的不同方法的示意图1）小鼠接受MOG _35-55抗原注射后10.7±0.3天²⁸开发初期临床症状。 EAE小鼠的代表性疾病过程示于图1。2）各种组织（脾，淋巴结，脊髓）和血液从在不同时间点的控制和EAE小鼠中的临床前阶段（第2天，4天萃取6天），该疾病的发病过程中（10天）和在疾病（12天，14天）; 3）细胞因子，从而调节EAE发展的mRNA表达谱的急性期，在各个确定的所述疾病过程中的组织在不同时间点提取，使用定量PCR。4）单细胞从提取的各种组织中分离在疾病过程和免疫细胞分布在不同的时间点使用流式细胞仪测定。

在脾和淋巴结细胞，T细胞和B细胞中观察到的最显着的细胞类型。在对比淋巴结，...

讨论

这里所描述的EAE模型得到最多关注，MS的模式，并在测试的治疗策略为MS ³²是经常使用。鼠标疾病具有MS的许多临床和组织学特征，是由自身免疫诱导神经元抗原引起的。致敏髓鞘抗原与血脑屏障功能障碍，因此，免疫细胞浸润到中枢神经系统有关。我们的研究结果显示，免疫细胞在急性期淋巴结瞬时增加。脾T细胞和B细胞减少的疾病的临床前阶段。在循环血液，T细胞，B细胞，树突细胞和单核细胞在临床前阶段瞬时增加，而粒细胞增加症依赖性。最后，在脊髓，增加免疫细胞是可检测的（ 图 2）。这些数据表明，T细胞和B细胞从脾，其作用迁移贮存器为这些细胞，在那里它们被激活和增殖的淋巴结。随后，他们通过循环进入脊髓迁移。嗜中性粒细胞，单核细胞和树突状细胞，在另一方面，从骨髓迁移通过循环进入CNS。

我们的数据表明，在脊髓，IFNγ，TNFα和IL-1β中的一种疾病相关的方式进行调节，而IL-6是在疾病的发作瞬时上调。这些数据支持这样的假说，即EAE病理是由Th1和Th17细胞驱动。 Th1细胞释放IFNγ，这反过来又激活巨噬细胞...

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
ABI Prism 7500 序列检测系统	Applied Biosystems，美国		定量PCR系统
Accutase	Sigma Aldrich 慕尼黑，德国	A6964	细胞分离溶液
CD3-PE-CF594	BD，德国海德堡	562286
CD4-V500	BD，德国海德堡	560782
CD8-eFluor650	eBioscience，德国法兰克福	95-0081-42
CD11b-eFluor605	eBioscience，德国法兰克福	93-0112-42
CD11c-AlexaFluor700	BD，德国海德堡	560583
CD19-APC-H7	BD，德国海德堡	560143
CD45-Vioblue	Miltenyi Biotec，德国 Bergisch Gladbach	130-092-910
CompBeads	BD，德国海德堡	552843	补偿珠
胶原酶 A	Sigma Aldrich 德国慕尼黑	C0130
细胞术绝对计数标准品	Polyscience，德国 Eppelheim	BLI-580-10
细胞仪设置和示踪微球	BD，海德堡，德国	642412
DNase I	Sigma Aldrich 德国慕尼黑	D5025
EAE 套件	Hooke Laboratories，美国劳伦斯	EK2110
F4/80-PE-Cy7	BioLegend，德国费尔	123114
第一链 cDNA 合成试剂盒	Thermo Scientific，德国 Schwerte	K1612
Fc receptor-1 封闭缓冲液	Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，德国	130-092-575
流式细胞术绝对计数标准	Polyscience，德国 Eppelheim	580
FlowJo 软件 v10	Treestar，美国		流式细胞术软件
LSRII/Fortessa	BD，德国		流式细胞仪
Ly6G-APC-Cy7	BD， 海德堡， 德国	560600
裂解液	BD， 海德堡， 德国	349202
Maxima SYBR Green	Thermo Scientific，德国 Schwerte	K0221	荧光 DNA 结合染料
RNeasy 迷你套装	Qiagen， Hilden， 德国	74104	RNA 提取试剂盒