在免疫细胞在不同组织与疾病相关的分布和小鼠实验评价性自身免疫性脑脊髓炎的诱导

摘要

本手稿描述了实验性自身免疫性脑脊髓炎 （EAE） 模型的诱导和评分方法，以及使用流式细胞术和定量 PCR 分别评估淋巴结、脾脏、血液和脊髓中免疫细胞分布和 mRNA 细胞因子水平，在不同的疾病阶段。

摘要

多发性硬化症是推定为炎症性自身免疫疾病，它在中枢神经系统（CNS），导致认知和运动功能障碍的特征是病变的形成。实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是MS的有用的动物模型，是因为它的特征还在于通过损伤形成在CNS，运动功能障碍，并且也由自身免疫和炎性反应驱动。一项所述的EAE模型被诱导与来自髓鞘少突胶质蛋白_{（MOG）35-55}小鼠衍生的肽。在EAE小鼠制定一个渐进的病程。这当然分为三个阶段:临床前阶段（第0天 - 9），疾病发作（10天 - 11）和急性期（12天 - 14）。 MS和EAE是由渗透到中枢神经系统自身反应性T细胞诱导。这些T细胞分泌趋化因子和细胞因子而导致进一步的免疫细胞的募集。因此，在脊髓D中的免疫细胞的分布uring这三种疾病的阶段进行了研究。以突出的T细胞，B细胞和单核细胞的活化/增殖/累积开始时的疾病的时间点，在淋巴结，脾和血液中的免疫细胞的分布也被评估。此外，一些细胞因子（IL-1β，IL-6，IL-23，TNFα，IFNγ）的三种疾病相的水平进行测定，以深入了解该疾病的炎性过程。最后，该数据提供了免疫细胞的EAE病理过程中的功能信息的概述。

引言

多发性硬化症（MS）及其相应的动物模型，实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE），显示出在中枢神经系统（CNS）的自身免疫性神经炎症的变化。早期主动MS和EAE的病变被浸润免疫细胞的存在表征。 MS的病因至今不明，但市场普遍认为涉及髓鞘由自身反应性T细胞介导的​​破坏。这些自身反应性T细胞分泌促炎性细胞因子和趋化因子，以吸引其他免疫细胞诸如B细胞，单核细胞和嗜中性粒细胞从循环。单核细胞分化成巨噬细胞。由自身反应性T细胞分泌干扰素γ（IFNγ）的极化将巨噬细胞促炎巨噬细胞。促进少突胶质细胞的细胞凋亡的促炎性巨噬细胞释放细胞因子和活性氧。少突胶质细胞的死亡导致脱髓鞘。此外，B细胞分化为plasma细胞和针对髓鞘释放的自身抗体，最终导致髓鞘退化。髓鞘的丧失导致轴突和神经元的退化和由此在CNS代表MS ¹的主要特征的病变部位的形成。在外围，T细胞和B细胞中的淋巴结被激活，它们在脾增殖并通过循环迁移到中枢神经系统。单核细胞和嗜中性粒细胞增殖的骨髓和也通过循环迁移到中枢神经系统。

从骨髓，脾和淋巴结进入血液或从血流进入CNS白细胞外渗是一个多步骤的过程，依赖于几个因素，包括白细胞和内皮趋化因子和趋化因子受体介导的分子间的相互作用。由各种细胞类型产生的趋化因子可免疫reactio期间被诱导通过像肿瘤坏死因子α（TNFα），IFNγ和白细胞介素-6（IL-6），随后募集免疫细胞炎症^2,3的部位的细胞因子Ñ。免疫细胞呈现在其表面上的趋化因子受体的子集，这取....

方案

道德守则:我们的实验过程由Regierungspräsidium达姆施塔特（德国）的伦理委员会批准并确认国家和欧洲法规。所有作出了努力，以尽量减少动物的痛苦，减少使用动物的数量。

1. EAE模型

1. EAE模型的感应
   1. 使用10至13周龄的雌性129S4 / SvJae×C57BL / 6小鼠为EAE的诱导。
   2. 给小鼠皮下注射，到上部和下背部，所述致脑炎MOG _{35 - 55（}髓鞘少突胶质糖蛋白）的肽（200微克），在200微升完全Freund`s佐剂（CFA）含有400微克结核杆菌乳化。
      注意:作为一个负，非疾病诱导假控制，含有结核杆菌 ，在相同的体积和通过相同的途径不完全弗氏佐剂，都可以使用。
   3. 疗法eafter，并再次24小时后，给小鼠百日咳毒素的腹膜内注射（总共0.2微克，在200μl磷酸盐缓冲盐水，PBS稀释）。使用未经处理的小鼠作为对照组，以能够比较患病健康的动物。
      注意:也可以以诱导EAE 200 - 300微克MOG _{35 - 55}肽，300 -在CFA 500 ​​微克结核杆菌和0.2 - 0.3微克百日咳毒素中的0.1体积- 0.2毫升，每注射。
   4. 每天开始一周​​注射后，检查小鼠的临床症状（见步骤1.2.1）
      注意:发病的一天中不同的实验而变化....

结果

图1给出了本文中介绍的不同方法的示意图1）小鼠接受MOG _35-55抗原注射后10.7±0.3天²⁸开发初期临床症状。 EAE小鼠的代表性疾病过程示于图1。2）各种组织（脾，淋巴结，脊髓）和血液从在不同时间点的控制和EAE小鼠中的临床前阶段（第2天，4天萃取6天），该疾病的发病过程中（10天）和在疾病（12天，14天）; 3）细胞因子，从而调节EAE发展的mRNA表达谱的急性期，在各个确定的所述疾病过程中的组织在不同时间点提取，使用定量PCR。4）单细胞从提取的各种组织中分离在疾病过程和免疫细胞分布在不同的时间点使用流式细胞仪测定。

在脾和淋巴结细胞，T细胞和B细胞中观察到的最显着的细胞类型。在对比淋巴结，.......

讨论

这里所描述的EAE模型得到最多关注，MS的模式，并在测试的治疗策略为MS ³²是经常使用。鼠标疾病具有MS的许多临床和组织学特征，是由自身免疫诱导神经元抗原引起的。致敏髓鞘抗原与血脑屏障功能障碍，因此，免疫细胞浸润到中枢神经系统有关。我们的研究结果显示，免疫细胞在急性期淋巴结瞬时增加。脾T细胞和B细胞减少的疾病的临床前阶段。在循环血液，T细胞，B细胞，树突细胞和单核细胞在临床前阶段瞬时增加，而粒细胞增加症依赖性。最后，在脊髓，增加免疫细胞是可检测的（ 图 2）。这些数据表明，T细胞和B细胞从脾，其作用迁移贮存器为这些细胞，在那里它们被激活和增殖的淋巴结。随后，他们通过循环进入脊髓迁移。嗜中性粒细胞，单核细胞和树突状细胞，在另一方面，从骨髓迁移通过循环进入CNS。

我们的数据表明，在脊髓，IFNγ，TNFα和IL-1β中的一种疾病相关的方式进行调节，而IL-6是在疾病的发作瞬时上调。这些数据支持这样的假说，即EAE病理是由Th1和Th17细胞驱动。 Th1细胞释放IFNγ，这反过来又激活巨噬细胞.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
ABI Prism 7500 序列检测系统	Applied Biosystems，美国		定量PCR系统
Accutase	Sigma Aldrich 慕尼黑，德国	A6964	细胞分离溶液
CD3-PE-CF594	BD，德国海德堡	562286
CD4-V500	BD，德国海德堡	560782
CD8-eFluor650	eBioscience，德国法兰克福	95-0081-42
CD11b-eFluor605	eBioscience，德国法兰克福	93-0112-42
CD11c-AlexaFluor700	BD，德国海德堡	560583
CD19-APC-H7	BD，德国海德堡	560143
CD45-Vioblue	Miltenyi Biotec，德国 Bergisch Gladbach	130-092-910
CompBeads	BD，德国海德堡	552843	补偿珠
胶原酶 A	Sigma Aldrich 德国慕尼黑	C0130
细胞术绝对计数标准品	Polyscience，德国 Eppelheim	BLI-580-10
细胞仪设置和示踪微球	BD，海德堡，德国	642412
DNase I	Sigma Aldrich 德国慕尼黑	D5025
EAE 套件	Hooke Laboratories，美国劳伦斯	EK2110
F4/80-PE-Cy7	BioLegend，德国费尔	123114
第一链 cDNA 合成试剂盒	Thermo Scientific，德国 Schwerte	K1612
Fc receptor-1 封闭缓冲液	Miltenyi Biotec，Bergisch Gladbach，德国	130-092-575
流式细胞术绝对计数标准	Polyscience，德国 Eppelheim	580
FlowJo 软件 v10	Treestar，美国		流式细胞术软件
LSRII/Fortessa	BD，德国		流式细胞仪
Ly6G-APC-Cy7	BD， 海德堡， 德国	560600
裂解液	BD， 海德堡， 德国	349202
Maxima SYBR Green	Thermo Scientific，德国 Schwerte	K0221	荧光 DNA 结合染料
RNeasy 迷你套装	Qiagen， Hilden， 德国	74104	RNA 提取试剂盒