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方法文章

小鼠实验性自身免疫性脑脊髓炎的诱导及疾病依赖性免疫细胞在不同组织中分布的评估

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DOI：

10.3791/53933

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2016年5月8日

 ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Institute of Clinical Pharmacology, Goethe University Hospital Frankfurt, 2Project Group for Translational Medicine & Pharmacology, Fraunhofer IME

* These authors contributed equally

本文内容

摘要

本文描述了实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型的诱导与评分方法，以及在疾病不同阶段，通过流式细胞术和定量PCR分别检测淋巴结、脾脏、血液和脊髓中免疫细胞分布和mRNA细胞因子水平的评估方法。

摘要

多发性硬化症被认为是一种炎性自身免疫性疾病，其特征是中枢神经系统（CNS）内形成病灶，导致认知和运动功能障碍。实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）是MS的一种有用动物模型，因为它同样以中枢神经系统病灶形成、运动功能障碍为特征，并且也由自身免疫和炎症反应驱动。其中一种EAE模型是通过在小鼠中使用髓鞘少突胶质细胞糖蛋白（MOG）35-55的肽段诱导建立的。EAE小鼠表现出进行性的疾病进程，该进程分为三个阶段：临床前阶段（第0–9天）、疾病发作期（第10–11天）和急性期（第12–14天）。MS和EAE均由侵入中枢神经系统的自身反应性T细胞引发，这些T细胞分泌趋化因子和细胞因子，进而招募更多的免疫细胞。因此，本研究分析了在三个疾病阶段期间脊髓中的免疫细胞分布情况。为了明确T细胞、B细胞和单核细胞的活化/增殖/积聚起始于疾病发展的哪个时间点，还评估了淋巴结、脾脏和血液中的免疫细胞分布。此外，测定了三个疾病阶段中多种细胞因子（IL-1β、IL-6、IL-23、TNFα、IFNγ）的水平，以深入了解疾病的炎症过程。综上所述，这些数据提供了EAE病理过程中免疫细胞功能谱的总体概况。

引言

多发性硬化症（MS）及其相应的动物模型实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）均表现出中枢神经系统（CNS）内的自身免疫性神经炎症变化。早期活动性MS和EAE病灶的特征是存在浸润的免疫细胞。MS的病因尚不明确，但普遍认为涉及由自身反应性T细胞介导的髓鞘破坏。这些自身反应性T细胞分泌促炎性细胞因子和趋化因子，从而吸引循环系统中的其他免疫细胞，如B细胞、单核细胞和中性粒细胞。单核细胞分化为巨噬细胞。自身反应性T细胞分泌的干扰素γ（IFNγ）促使巨噬细胞极化为促炎性巨噬细胞。这类促炎性巨噬细胞释放细胞因子和活性氧，促进少突胶质细胞发生凋亡。少突胶质细胞的死亡导致脱髓鞘。此外，B细胞分化为浆细胞，并产生针对髓鞘的自身抗体，最终导致髓鞘降解。髓鞘的丧失进一步引起轴突和神经元的退化，从而在中枢神经系统内形成病灶，这是MS的主要特征1。在外周，T细胞和B细胞在淋巴结中被激活，在脾脏中增殖，并通过血液循环迁移至中枢神经系统。单核细胞和中性粒细胞在骨髓中增殖，同样经由血液循环迁移进入中枢神经系统。

白细胞从骨髓、脾脏和淋巴结进入血液，或从血液循环进入中枢神经系统的过程是一个多步骤事件，依赖于多种因素，包括由趋化因子及其受体介导的白细胞与内皮细胞之间的分子相互作用。在免疫反应过程中，肿瘤坏死因子-α（TNFα）、干扰素-γ（IFNγ）和白细胞介素-6（IL-6）等细胞因子可诱导多种细胞类型产生趋化因子，从而招募免疫细胞至炎症部位2,3免疫细胞根据细胞类型及其向炎症部位迁移的路径，在其表面表达特定的趋化因子受体亚群。因此，CXCR2、CCR1 和 CXCR1 在骨髓和血液中的成熟中性粒细胞上表达。4，其配体CXCL2、CCL5或CXCL6的结合可激活中性粒细胞，促进其与内皮细胞的黏附，并进一步促使细胞迁移至组织中5-9CCL2 和 CCL20 可趋化单核细胞及 Th1/Th17 细胞10，表达 CCR211 和 CCR612分别。CCR1 和 CCR5 由不同类型的细胞表达，包括 T 细胞、单核细胞和巨噬细胞13，结合CCL3、CCL5和CCL7，并在多发性硬化症期间上调14CXCR3 在 T 细胞上表达，并与 CCL9、CCL10 和 CCL11 结合15.

多发性硬化症（MS）治疗的一个主要策略是耗竭免疫细胞或阻止免疫细胞浸润中枢神经系统（CNS）。因此，在实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）模型中，已对特定趋化因子受体的阻断作用进行了研究。CCR116、CCR217、CCR718 或 CXCR219 的拮抗作用或基因敲除可减轻EAE的病理变化，而CCR120、CCR520 或 CXCR321 的拮抗作用或基因敲除则未能减轻病理变化。因此，白细胞表面特定趋化因子受体的表达对于其向中枢神经系统的浸润至关重要，并决定了EAE的病程发展。

耗竭免疫细胞是治疗多发性硬化症（MS）患者的有效策略，因为浸润的免疫细胞会释放细胞因子（如TNFα、IL-6和IL-1β），进而促进炎症过程或导致神经元退化22。此外，自身反应性Th1细胞会释放IFNγ，后者可进一步刺激巨噬细胞释放TNFα、IL-1β和IL-23。

本文描述了实验性自身免疫性脑脊髓炎（EAE）的诱导方法，以及EAE小鼠不同组织中免疫细胞分布和细胞因子水平（mRNA）的测定。在疾病进程的不同时间点分离细胞，以提供炎症过程的时间依赖性概述，这些炎症过程最终导致中枢神经系统（CNS）病灶的形成。

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方案

伦理声明：我们的实验程序已获得德国达姆施塔特区政府伦理委员会（Regierungspräsidium Darmstadt, Germany）的批准，并符合国家及欧洲的相关法规。所有努力均旨在尽量减少动物痛苦并减少所用动物数量。

1. EAE 模型

  1. 诱导EAE模型
    1. 使用10至13周龄的雌性129S4/SvJae×C57BL/6小鼠进行EAE模型的诱导。
    2. 将致脑炎性MOG35 - 55 （髓鞘少突胶质细胞糖蛋白）肽（200 µg）用含有400 µg Mycobacterium tuberculosis 的200 µl完全弗氏佐剂（CFA）乳化后，皮下注射至小鼠背部的上部和下部。
      注：作为阴性、非致病性的假处理对照，可使用相同体积、相同途径给予含 Mycobacterium tuberculosis 的不完全弗氏佐剂。
    3. 此后，在24小时后再次给予小鼠腹腔注射百日咳毒素（每次总量0.2 µg，溶于200 µl磷酸盐缓冲液PBS中）。使用未经处理的小鼠作为对照组，以便将患病动物与健康动物进行比较。
      注：也可使用200 - 300 µg MOG35 - 55 肽、300 - 500 µg Mycobacterium tuberculosis 混入CFA中，并以每针0.1 - 0.2 ml体积给予0.2 - 0.3 µg百日咳毒素来诱导EAE。
    4. 从注射后一周开始，每日观察小鼠的临床症状（见步骤1.2.1）。
      注：疾病发作的日期在不同实验中可能有所差异，但在本实验室条件下通常约为第11天，因此本文中第14天定义为发病后第3天。本研究中所有小鼠均出现了临床症状。
  2. 小鼠评分
    1. 按以下临床评分标准对临床症状进行分类：0）无异常体征；0.5）尾部远端麻痹；1）尾部完全麻痹；1.5）尾部无力伴后肢轻度无力；2）尾部无力伴后肢重度无力；2.5）尾部无力并单侧后肢麻痹；3）尾部无力并双侧后肢麻痹；3.5）双侧后肢麻痹伴单侧前肢无力（达到此评分的小鼠将依据当地伦理指南实施安乐死）。

2. 流式细胞术分析用单细胞的制备

注意：抗体混合物包含 1 µl CD45-Vioblue、2 µl CD8-eFluor650、0.5 µl CD11b-eFluor605、0.5 µl F4/80-PE-Cy7、1 µl CD3-PE-CF594、CD4-V500、0.5 µl CD11c-AlexaFluor700、1 µl CD19-APC-H7 和 1 µl Ly6G-APC-Cy7。 

注意：如果需要采集血液、淋巴结、脾脏和脊髓，则操作步骤如下：使用异氟烷（2% 按每分钟与碳合气混合）和氯胺酮（100 mg/kg 体重）联合麻醉小鼠，使其深度麻醉。接着打开胸腔，通过心脏穿刺采集血液，并用冷磷酸盐缓冲液（PBS）进行心脏灌注。然后依次取出淋巴结、脾脏，最后取出脊髓。如果无需进行心脏灌注，则在深度麻醉下通过颈椎脱位法处死小鼠。

  1. 脾细胞的分离
    1. 使用异氟烷（2% 每分钟 carbogen 中）和氯胺酮（100 mg/kg 体重）联合麻醉小鼠。
    2. 用80%异丙醇润湿切口区域，以避免毛发污染，并用剪刀纵向切开胸腔，注意不要刺破深层组织。
    3. 用冷PBS（pH 7.0）23进行心脏灌注。
      注：脾脏位于肋骨下方的左上腹部象限。如果仅需研究脾脏，可在灌注前取出该器官，以保留所有感兴趣的细胞类型。
    4. 取出脾脏，切下约1/8并称重。将样品保存在冰上的PBS中。
    5. 用2 ml注射器的推杆将脾组织通过置于50 ml离心管上的70 µm细胞筛过滤。
    6. 用5 ml PBS冲洗细胞筛。在1,800 × g下离心3分钟。将沉淀重悬于500 µl裂解液中。
      注：在此阶段，如果后续使用不依赖微珠的替代FACS分析方法（见第3节），可能需要进行差异细胞计数。
    7. 室温（RT）孵育10分钟，加入500 µl PBS，在室温（RT）下以650 × g离心6分钟。
    8. 用500 µl PBS重复洗涤步骤。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于100 µl 0.2%牛血清白蛋白（BSA）/PBS中，加入2 µl Fc受体-1（FcRI）封闭缓冲液，在室温（RT）避光孵育15分钟。
    9. 加入13 µl抗体混合物，在室温（RT）避光孵育15分钟，加入500 µl PBS，并在室温（RT）下以650 × g离心6分钟。弃去上清液。
      注：制造商的染色程序推荐单次洗涤，但可选择性地额外重复洗涤一至两次，以进一步降低背景染色。
    10. 将细胞沉淀重悬于500 µl PBS（或用于蛋白分离的运行缓冲液，以潜在减少细胞聚集），转移至流式细胞术检测管中。将细胞保持在冰上。
  2. 淋巴结细胞的分离
    1. 使用异氟烷（2% 每分钟 carbogen 中）和氯胺酮（100 mg/kg 体重）联合麻醉小鼠。
    2. 用80%异丙醇润湿切口区域，用剪刀纵向切开胸腔。用冷PBS（pH 7.0）23进行心脏灌注。
    3. 为分离腹股沟淋巴结，小心去除髋部区域的皮肤，用镊子从脂肪组织中仔细取出淋巴结。称量腹股沟淋巴结，并将样品保存在冰上的PBS中。
      注：我们在研究中使用了腹股沟淋巴结，因为O`Connor 等发现，在EAE诱导后，腹股沟淋巴结中存在大量活化的单核细胞、巨噬细胞、中性粒细胞和T细胞24。
    4. 用2 ml注射器的推杆将淋巴结通过置于50 ml离心管上的70 µm细胞筛过滤。
    5. 用5 ml PBS冲洗细胞筛。在2,400 × g下离心8分钟。将细胞沉淀重悬于100 µl 0.2% BSA/PBS中，加入2 µl FcRI封闭缓冲液，在室温（RT）避光孵育15分钟。
    6. 加入13 µl抗体混合物，在室温（RT）避光孵育15分钟，加入500 µl PBS，并在室温（RT）下以650 × g离心6分钟。
    7. 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于300 µl PBS（或合适的运行缓冲液）中，转移至流式细胞术检测管中。
  3. 血液细胞的分离
    1. 向50 µl血液（以EDTA稳定）中加入50 µl 20 mM HEPES，再加入500 µl裂解液。室温（RT）孵育10分钟，加入500 µl PBS。在室温（RT）下以650 × g离心6分钟。弃去上清液，并重复洗涤步骤。
    2. 将细胞沉淀重悬于100 µl 0.2% BSA/PBS中，加入2 µl FcRI封闭缓冲液，在室温（RT）避光孵育15分钟。
    3. 加入13 µl抗体混合物，在室温（RT）避光孵育15分钟，加入500 µl PBS，并在室温（RT）下以650 × g离心6分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于300 µl PBS中，转移至流式细胞术检测管中。
  4. 脊髓细胞的分离
    1. 使用异氟烷（2% 每分钟 carbogen 中）和氯胺酮（100 mg/kg 体重）联合麻醉小鼠。
    2. 用80%异丙醇润湿切口区域，用剪刀纵向切开胸腔。用冷PBS（pH 7.0）23进行心脏灌注。
    3. 润湿背部切口区域，再次用手术刀做纵向切口并去除皮肤。
    4. 切除支配后肢的腰段脊柱，并用装有PBS的注射器冲洗以提取脊髓。切下约1/3的腰段脊髓，称重后将样品保存在冰上的PBS中。
    5. 在4 °C下以250 × g离心2分钟。弃去上清液，加入500 µl细胞解离液和HBSS（1:1）。加入3 mg/ml胶原酶A和1 Unit/ml DNase I，通过反复吹打使细胞解离，并在37 °C、400 rpm振荡条件下孵育30分钟。
      注：如有需要，可通过密度梯度离心去除污染的髓鞘和细胞碎片，这可能提高流式细胞术检测的灵敏度，从而降低背景自发荧光和所需采集的事件数量（见第3.5节）。
    6. 在室温（RT）下以250 × g离心2分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于1 ml 10%胎牛血清（FCS）/Dulbecco's最低必需培养基（DMEM）中，再次通过反复吹打使细胞解离。
    7. 在室温（RT）下以250 × g离心2分钟。重复洗涤步骤。
    8. 将细胞沉淀重悬于1 ml PBS中，用2 ml注射器的推杆将脊髓通过置于50 ml离心管上的70 µm细胞筛过滤。
    9. 用4 ml PBS冲洗细胞筛。在室温（RT）下以1,800 × g离心3分钟。弃去上清液，将细胞沉淀重悬于100 µl 0.2% BSA/PBS中，加入2 µl FcRI封闭试剂，在室温（RT）避光孵育15分钟。
    10. 加入13 µl抗体混合物，在室温（RT）避光孵育15分钟，加入500 µl PBS，并在室温（RT）下以650 × g离心6分钟。
    11. 弃去上清液，将细胞沉淀重悬于500 µl PBS（或合适的运行缓冲液）中，转移至流式细胞术检测管中。

3. 流式细胞术分析

  1. 事先滴定所有抗体以确定最佳浓度，具体方法参见 Olesch 的描述 等25.
  2. 根据制造商说明书，使用抗体捕获补偿微珠进行单色补偿，以创建多色补偿矩阵。
  3. 根据制造商的说明，每天使用特定微球进行仪器校准。
  4. 在流式细胞术检测前，向细胞中加入30 µl流式细胞术绝对计数标准品（细胞分离步骤见2.1、2.2、2.3、2.4节），以确定细胞绝对数量。也可不使用计数微球，直接对细胞进行计数。
  5. 将样本（脾脏、淋巴结和血液细胞：100,000 个事件，脊髓：500,000 个事件）上机进行流式细胞术检测，并使用特定的流式细胞术分析软件进行分析。
    1. 打开流式细胞术软件，通过点击按钮添加 fcs 3.0 文件 "添加样品".
    2. 双击打开添加的文件。调整x轴和y轴的通道。通过创建门控来选择目标细胞群体（参见 图4).

4. 定量 PCR 分析

  1. mRNA的分离及逆转录为cDNA
    1. 使用苯酚-氯仿法从腰段脊髓（1/3）、脾脏（1/8）和腹股沟淋巴结中提取mRNA，并用乙醇沉淀26。
      1. 为此，将组织在1 ml硫氰酸胍-苯酚混合液中匀浆，孵育10分钟。加入200 µl氯仿，再次孵育10分钟。
      2. 经离心步骤（4 °C下18,000 × g离心15分钟）后，用500 µl异丙醇洗涤上层水相，再次离心（4 °C下18,000 × g离心8分钟）。
      3. 用500 µl乙醇洗涤沉淀，再经一次离心（4 °C下18,000 × g离心5分钟）后，在真空浓缩仪中干燥沉淀（30 °C下5分钟）。随后将沉淀重悬于30 µl水中。
    2. 为从血液中提取mRNA，将500 µl EDTA抗凝血液在300 × g、4 °C条件下离心10分钟。
      1. 取含有白细胞的白膜层，用1 ml裂解液（150 mM NH4Cl、100 mM NaHCO3、0.1 mM Na-EDTA，pH 7.4）稀释。
      2. 室温孵育10分钟后，在650 × g条件下离心6分钟，随后用PBS洗涤两次。
      3. 使用RNA提取试剂盒，按照制造商说明书从白细胞（WBCs）中提取mRNA。
    3. 使用包含随机六聚体的cDNA合成试剂盒，按照制造商说明书进行cDNA合成。每反应使用200 ng mRNA进行cDNA合成。
  2. 定量PCR
    1. 为定量特定mRNA的含量，使用1 µl cDNA、1 µM正向/反向引物以及荧光DNA结合染料，具体操作按照制造商说明书进行27。引物序列见表1。使用定量PCR系统检测IL-1β、IL-6、IL-23、IFNγ、TNFα和PPIA（肽基脯氨酰异构酶）的CT值。
    2. 采用比较CT（循环阈值）法确定相对mRNA表达水平27。
      1. 为此，将目的基因的CT值相对于PPIA的表达水平进行归一化处理，即用目的基因的CT值减去PPIA的平均CT值，方法如先前研究所述（Barthelmes et al.28, Schiffmann et al.29, Schiffmann et al.30）。随后计算ΔΔCT值，即将EAE小鼠目的基因的ΔCT值相对于未处理小鼠目的基因表达水平进行归一化，即用EAE小鼠的ΔCT值减去未处理小鼠的平均ΔCT值。
      2. 为获得目的基因的相对mRNA表达量，使用以下公式计算比值：2-ΔΔct。
  3. 检测每对引物的特异性。使用2%琼脂糖凝胶电泳确定扩增片段大小31。片段大小见表1。

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结果

图1 给出了本文所述不同方法的示意图概述。 1) 小鼠接受 MOG 注射35-55 抗原暴露后10.7 ± 0.3天出现初始临床症状28EAE小鼠的代表性疾病进程如图所示 图1. 2) 在临床前阶段（第2天、第4天、第6天）、疾病 onset 阶段（第10天）以及疾病急性期（第12天、第14天）的不同时间点，从对照组和 EAE 小鼠中采集多种组织（脾脏、淋巴结、腰段脊髓）及血液。 3) 利用定量PCR检测疾病病程中不同时间点采集的多种组织内调控EAE发展的细胞因子的mRNA表达谱。 4) 从疾病进程的不同时间点提取的多种组织中分离单细胞，并通过流式细胞术确定免疫细胞分布。

在脾脏和淋巴结中，T细胞和B细胞是最...

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讨论

本文所述的EAE模型作为多发性硬化症（MS）的模型受到了广泛关注，并被常规用于测试针对MS的治疗策略32。该小鼠疾病表现出许多与MS相似的临床和组织学特征，其病因是针对神经元抗原的自身免疫被诱导激活。对髓鞘抗原的致敏反应与血脑屏障功能障碍相关，从而导致免疫细胞浸润中枢神经系统（CNS）。我们的研究结果显示，在急性期，淋巴结中的免疫细胞数量出现短暂性增加；在临床前阶段，脾脏中的T细胞和B细胞数量减少。在外周血中，T细胞、B细胞、树突状细胞和单核细胞在临床前阶段短暂增加，而中性粒细胞则随疾病进展持续增加。最后，在脊髓中可检测到免疫细胞的增多（图2）。这些数据表明，T细胞和B细胞从作为这些细胞储存库的脾脏迁移至淋巴结，在淋巴结中被激活并增殖；随后通过血液循环迁移至脊髓。而中性粒细胞、单核细胞和树突状细胞则从骨髓经由血液循环迁移进入中枢神经系统。

我们的数据显示，在脊髓中，IFNγ、TNFα 和 IL-1β 的表达以疾病依赖的方式受到调控，而 IL-6 仅在疾病 onset 时短暂上调。这些数据支持 EAE 病理过程由 Th1 和 T...

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披露

MJP 是 Xellia 和 Leo Pharmaceuticals 的顾问。

致谢

本工作由 Else Kröner-Fresenius 基金会（EKFS）转化研究创新-制药（TRIP）研究生项目以及黑森州“科学经济卓越发展计划（LOEWE）”中的“应用导向药物研究”重点方向资助。

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材料

本文使用的材料清单
姓名公司目录编号评论
ABI Prism 7500序列检测系统 Applied Biosystems, Austin, USA定量PCR系统
AccutaseSigma Aldrich Munich, GermanyA6964细胞解离溶液
CD3-PE-CF594BD, Heidelberg, Germany562286
CD4-V500BD, Heidelberg, Germany560782
CD8-eFluor650eBioscience, Frankfurt, Germany95-0081-42
CD11b-eFluor605eBioscience, Frankfurt, Germany93-0112-42
CD11c-AlexaFluor700BD, Heidelberg, Germany560583
CD19-APC-H7 BD, Heidelberg, Germany560143
CD45-Vioblue Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany130-092-910
CompBeadsBD, Heidelberg, Germany552843补偿微珠
胶原酶ASigma Aldrich Munich, GermanyC0130
流式细胞术绝对计数标准品 Polyscience, Eppelheim, GermanyBLI-580-10
流式细胞仪设置与追踪微珠 BD, Heidelberg, Germany642412
DNase ISigma Aldrich Munich, GermanyD5025
EAE试剂盒Hooke Laboratories, Lawrence, USAEK2110
F4/80-PE-Cy7 BioLegend, Fell, Germany123114
第一链cDNA合成试剂盒 Thermo Scientific, Schwerte, GermanyK1612
Fc受体-1封闭缓冲液 Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach, Germany130-092-575
流式细胞术绝对计数标准品Polyscience, Eppelheim, Germany580
FlowJo软件v10 Treestar, Ashland, USA流式细胞术分析软件
LSRII/Fortessa BD, Heidelberg, Germany流式细胞仪
Ly6G-APC-Cy7 BD, Heidelberg, Germany560600
溶血溶液 BD, Heidelberg, Germany349202
Maxima SYBR Green Thermo Scientific, Schwerte, GermanyK0221荧光DNA结合染料 
RNeasy Mini试剂盒 Qiagen, Hilden, Germany74104RNA提取试剂盒

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