高效的核酸提取与16S rRNA基因测序用于细菌群落特征分析

摘要

我们介绍一种高效、稳定且经济的从拭子中提取核酸的方法，用于通过16S rRNA基因扩增子测序对细菌群落进行表征。该方法适用于多种样本类型的统一处理，并可兼容多种下游分析流程。

摘要

人们日益认识到微生物群落在调节人类健康与疾病中的关键作用。高通量测序技术使得利用来自多种样本的16S rRNA基因测序，能够快速高效地表征细菌群落。尽管已有 readily available 的16S rRNA序列分析工具对计算流程进行了标准化，但DNA提取过程中的样本处理仍是不同研究间变异性的持续来源。本文介绍一种高效、稳健且成本低廉的从拭子中提取核酸的方法。我们还详细阐述了16S rRNA基因测序的下游方法，包括测序文库的构建、数据质量控制以及序列分析。该流程可适用于多种样本类型，包括来自不同解剖部位和宿主物种的粪便样本和拭子样本。此外，所提取的DNA和RNA可被分离并用于其他应用，如全基因组测序或RNA-seq。本方法为多种样本类型提供了一种通用的处理策略，并支持基因组、宏基因组及转录信息的下游分析。

引言

人类下生殖道、胃肠道系统、呼吸道和皮肤定植有复杂的细菌群落，这些群落对维持组织稳态和支持宿主健康至关重要¹。例如，某些乳杆菌通过酸化阴道腔、产生抗菌效应分子以及调节局部宿主免疫，为病原体创造了不利的生存环境^2-4。随着人们对细菌微生物组重要性的日益认识，越来越多的研究开始关注在多种临床背景下对细菌群落进行表征。本文介绍一种从生殖道拭子样本中确定细菌微生物组组成的方法。该方案可轻松修改，用于粪便样本以及其他解剖部位采集的拭子样本，以及来自其他宿主物种的样本。

由于从单个研究参与者所能采集和保存的样本数量存在固有限制，本方案采用改良的基于苯酚-氯仿法的珠磨法^5,6，旨在从单个拭子中同时提取DNA、RNA，甚至可能提取蛋白质。通过珠磨法对细菌细胞壁进行物理破碎，并结合去污剂进行化学裂解，可快速裂解革兰氏阳性菌、革兰氏阴性菌以及抗酸菌，而无需额外的酶消化步骤。为获得高质量的RNA，建议使用采集后立即在4 °C或更低温度下保存并运输至实验室（如适用）的干燥拭子，并长期储存在-80 °C条件下。

为了确定给定样本中的细菌微生物组，本实验采用16S rRNA基因扩增子测序方法，这是目前最经济有效、可用于全面鉴定细菌分类并进行相对定量的技术。其他可选方法包括靶向qPCR⁷、定制微阵列⁸以及全基因组测序⁹。16S rRNA基因包含九个高变区，目前尚无共识确定阴道微生物组研究中最优的V区测序范围。本文采用515F/806R引物组合，并基于Caporaso et al.^10-12设计的分析流程进行操作。Caporaso et al.的515F/806R引物组合由于具备数千种经过验证的带条形码引物，并且兼容Illumina测序平台，因此可在单次测序运行中实现数百个样本的多重检测。与人类微生物组计划使用的27F/338R引物组合¹³不同，515F/806R还能有效扩增Bifidobacteriaceae，从而准确检测Gardnerella vaginalis——这是部分女性阴道微生物群落中的重要成员。此外，已有研究成功使用338F/806R引物对对阴道样本进行焦磷酸测序¹⁴，而515F/926R引物对也已近期被开发用于新一代测序¹²。

最后，本实验方案提供了使用定量微生物生态学分析软件（Quantitative Insights into Microbial Ecology，QIIME）进行16S扩增子分析的基本操作指南¹⁵。成功执行此处描述的QIIME命令后，将生成一个包含每个样本中细菌分类群丰度信息的表格。根据QIIME官方网站（http://qiime.org/index.html）中的详细说明，还可将多种额外的质量控制步骤、分类学注释方法及分析流程整合到分析过程中。如果在苹果计算机上进行分析，可使用MacQIIME软件包¹⁶，以便于QIIME及其依赖组件的安装。其他可用于16S rRNA基因序列分析的软件包包括Mothur¹⁷和UPARSE¹⁸。

方案

该研究方案已获得南非夸祖鲁-纳塔尔大学生物医学研究伦理委员会（南非德班）和麻省总医院机构审查委员会（2012P001812/MGH；美国马萨诸塞州波士顿）的批准，并遵循其指导方针。

1. 从宫颈阴道拭子中提取总核酸

注意：每次进行核酸提取的样本数量应为16个或更少。以下所述方案默认以每批12个样本进行处理。若需进行多轮提取，应依次对提取批次进行编号，并记录每个样本所属的提取批次编号及其他样本信息（包括元数据，如受试者编号、年龄、采样日期/时间、激素类避孕方式类型、性传播感染检测结果， 等等。) 在 表1.

1. 试剂准备与通风橱
   1. 配制缓冲液，包含 200 mM 氯化钠（NaCl）、200 mM Tris 和 20 mM 乙二胺四乙酸（EDTA），溶于 100 ml 无核酸酶水中。将溶液通过 0.22 µm 滤膜过滤除菌。取 10 ml 缓冲液分装至预冷容器中，置于湿冰上预冷。
   2. 将苯酚:氯仿:异戊醇（IAA）（25:24:1）的pH值调节至7.9，方法为每1 ml苯酚中加入65 µl Tris碱性缓冲液，充分振荡混合2 min，随后静置使其两相自然分离，或在室温下以10,000 × g离心5 min以促进相分离。
      警告：苯酚若吞食、吸入或与皮肤和眼睛接触均有毒性。切勿吸入其蒸气。操作时应佩戴防渗透手套、带侧护罩的安全眼镜及实验服。
   3. 通过0.22 µm滤器对25 ml 20%十二烷基硫酸钠（SDS）溶液进行过滤除菌。将除菌后的SDS分装为每份5 ml。
   4. 将10 ml异丙醇 aliquot 置于-20 °C预冷。
   5. 为每根需处理的拭子准备一支珠磨管，将0.3 g玻璃珠称量至适合珠磨仪使用的无菌2 ml离心管中。
   6. 用无菌吸收性拭子采集宫颈外口样本。采集后立即将拭子放入空的无菌冻存管中，运输至实验室期间于4 °C保存1至4小时，并在-80 °C保存数月。将装有拭子的独立冻存管转移至湿冰上进行后续处理。
   7. 准备生物安全柜（BSC）。使用配备有 "指形管" 连接至建筑物的排风系统，以确保有效清除挥发性化学物质。
      1. 将所有材料从生物安全柜中移出。
      2. 用漂白剂清洁生物安全柜的所有表面，随后使用可去除表面RNase、DNase和DNA的去污剂。将所有后续带入安全柜的物品（包括手套）均先用漂白剂、再用核酸去污剂进行清洁。尽可能使用新鲜的无RNase/DNase试剂，如移液器吸头。
      3. 将一个已灭菌的化学有害物质垃圾袋粘贴在生物安全柜后部。所有含有苯酚或氯仿的干燥废弃物均应放入此袋中，以便妥善处理。
      4. 将一个无菌瓶放入生物安全柜中，用于收集含苯酚或氯仿的液体废物。
2. 酚-氯仿抽提
   1. 在通风橱中，向每根珠磨管中加入 500 µl 缓冲液（来自步骤 1.1.1）、210 µl 20% 十二烷基硫酸钠和 500 µl 苯酚:氯仿:异戊醇（25:24:1，pH 7.9）。
   2. 使用新的无菌镊子将拭子从转运管转移至珠磨管中。将拭子头部在珠磨管内壁充分摩擦至少30秒。操作完成后重新盖上样本盖。若需对多个拭子进行提取，每个样本之间应更换手套。
   3. 将样本置于冰上冷却至少10分钟。用无菌镊子夹住拭子手柄，同时用干净的P200吸头轻压拭子头部紧贴 bead beating 管内壁，将拭子从管中取出。将用过的拭子丢弃至干燥化学废弃物袋中。注意： "刮板" 按压拭子头部的动作将使吸收性拭子中的液体释放，从而提高核酸回收率。
   4. 将珠磨管放入珠磨仪中，在4 °C下均质2分钟。
   5. 将珠磨管在6,000 x g离心3分钟 和 4 °C 离心以沉淀杂质，并分离水相和酚相。
   6. 将水相（约 500 - 600 µl）转移至无菌的 1.5 ml 离心管中。加入等体积的苯酚:氯仿:异戊醇（IAA）。颠倒混匀并短暂涡旋。
   7. 在 16,000 × g 和 4 °C 条件下离心 5 分钟。
   8. 将水相转移至新的无菌1.5 ml离心管中。操作需谨慎，避免转移中间层或下方酚相中的物质。记录所转移水相的体积。保留酚相以备后续蛋白质提取使用。
   9. 加入0.8倍体积的异丙醇和0.1倍体积的3 M醋酸钠（pH 5.5），通过倒置充分混匀，并短暂涡旋振荡。
   10. 通过将离心管置于 -20 °C 冰浴至少 2 小时（可长达过夜）使核酸沉淀。
3. 异丙醇沉淀与乙醇洗涤
   1. 在约 16,000 x g 和 4 °C 条件下离心 30 分钟。小心使用移液器吸除上清液，保留沉淀完整。
   2. 加入500 µl 100%乙醇。轻轻涡旋或吹打使沉淀松动，注意勿接触沉淀。在4 °C条件下以16,000 x g离心5分钟。
   3. 小心弃去乙醇上清液。使用P10移液器尽可能吸除乙醇，注意不要扰动沉淀。
   4. 室温下将沉淀物风干15分钟。
   5. 将沉淀重悬于20 µl超纯0.1x Tris-EDTA缓冲液中。将样品置于冰上孵育10分钟，并反复吹打以确保充分重悬。若沉淀未完全溶解，可将离心管转移至40 °C金属浴中加热最多10分钟以促进溶解。
   6. 使用分光光度计测量核酸浓度¹⁹.
   7. 如有需要，可使用柱纯化试剂盒，按照制造商的说明书将 DNA 与 RNA 分离²⁰.
   8. 将核酸在 -80 °C 保存或继续后续操作。

2. 16S rRNA 基因V4高变区的PCR扩增

注意：为降低污染和人为误差的风险，每次 PCR 扩增的样本数量应为 12 个或更少。若需进行多轮扩增，应按顺序对扩增批次进行编号，并在 表 1 中记录每个样本对应的扩增批次编号。

1. 试剂和 PCR 操作台的准备
   1. 将 PCR 扩增组信息添加到表 1中，该表将在序列分析阶段作为映射文件的基础。
   2. 取出 PCR 操作台内的所有材料，并使用漂白剂彻底清洁内部表面，随后使用可去除 RNase、DNase 和 DNA 的去污染剂进行处理。在将任何试剂或设备（例如移液器）放入操作台前，务必对其进行去污染处理。在操作台内工作前，佩戴经核酸去污染剂清洁过的新手套。
   3. 如有必要，使用无 DNA 且无核酸酶的水将核酸模板稀释至 50 - 100 ng/µl。
   4. 在洁净的 PCR 操作台内解冻 5x 高保真（HF）缓冲液、dNTPs 和引物的分装样品。解冻后轻轻涡旋并离心所有溶液。为减少冻融循环次数及原液污染风险，建议对 5x HF 缓冲液、dNTPs 和引物进行分装保存。
   5. 在操作台内放置一个用于微量离心管的洁净台面冷却架和一个 PCR 板冷却器。
2. PCR 反应的配制：按每反应体系混合 15.5 µl 超纯水、5 µl 5x HF 缓冲液、0.5 µl dNTPs、0.5 µl 515F 正向引物、0.75 µl 3% DMSO 和 0.25 µl 聚合酶，以制备主混合液。所有组分均在冷却器中混合，聚合酶最后加入。通过移液充分混匀。配制主混合液时，额外增加两个样本的用量，以补偿移液误差。
3. PCR 反应设置：
   注意：每个样本需进行三重复扩增，即每个样本在三个独立的 25 µl 反应体系中扩增。每对引物均需设置无模板水阴性对照。操作应迅速而谨慎，避免引入任何污染。
   1. 标记一个带独立盖的 8 孔条，并将其放入 PCR 冷却器中。
   2. 向第一孔加入 90 µl 主混合液。
   3. 加入 2 µl 反向引物（补充文件 1）。务必在表 1中准确记录每个样本所用反向引物的条形码。
   4. 充分混匀后，将 23 µl 主混合液转移至第四孔（无模板对照孔）。
   5. 向第四孔加入 2 µl 水。
   6. 向第一孔加入 6 µl 对应样本。充分混匀后，移取 25 µl 至第二孔。更换吸头后，再从第一孔移取 25 µl 至第三孔。牢固盖紧每个孔的盖子，过程中避免触碰孔内壁或盖子内部。
   7. 对每个样本重复上述步骤。
4. 进行 PCR 扩增
   1. 将条状管转移至热循环仪，并运行以下程序：98 °C 预变性 30 秒，随后进行 30 个循环（98 °C 变性 10 秒，57 °C 退火 30 秒，72 °C 延伸 12 秒），然后 72 °C 延伸 10 分钟，最后在 4 °C 保存。
   2. 在洁净的实验台面上进行以下操作：短暂离心收集管壁上的液体。将每个样本的三重复 PCR 产物合并至一个无菌标记管中，总体积为 75 µl。同时将每个无模板对照的 25 µl 产物转移至另一个独立的无菌管中。此时不要合并不同样本的扩增产物。
5. 通过凝胶电泳验证样本 PCR 扩增的成功性
   1. 制备含 1.5% 琼脂糖的凝胶（1.5 g 琼脂糖粉末溶于 100 ml 1x TAE 缓冲液），并确保有足够的加样孔用于容纳所有扩增产物、水对照和 DNA 标准品²¹。
   2. 在凝胶凝固期间（约 30 分钟），准备电泳样品：在新的标记管中加入 1 µl 6x 上样染料，再加入 5 µl 扩增产物，通过移液混匀。
   3. 凝胶完全凝固后，拔出梳子，将凝胶放入电泳槽，并加入 1x TAE 缓冲液至覆盖凝胶表面。
   4. 向第一孔加入 5 µl DNA 标准品。
   5. 向另一孔加入 5 µl 样本扩增产物，另取一孔加入 5 µl 无模板对照扩增产物。根据需要为每个样本依次加样。
   6. 所有样品加样完毕后，盖上电泳槽盖，接通电源并调至 120 V，电泳运行 30 - 60 分钟。
   7. 在紫外光下观察凝胶。
      1. 通过观察是否出现约 380 bp 处的单一强条带来确认每个样本扩增成功。若出现双条带，应使用不同的反向条形码重新扩增该样本（步骤 2.3）。若无条带出现，应使用相同或新的反向条形码重新扩增（步骤 2.3）。若重扩增仍不成功，可能样本中存在 PCR 抑制剂，此时应采用柱式 DNA 纯化法去除 PCR 抑制剂。
         注意：若原始样本中细菌 DNA 浓度过低（<5 ng/µl），可能无法实现成功扩增。
      2. 通过确认无模板对照孔无条带出现，验证试剂未受污染。
   8. 将剩余的 70 µl 扩增产物于 -20 °C 保存。若无模板对照未出现条带，则弃去剩余的 20 µl。

3. 文库合并与高通量测序

1. 通过将每个扩增子取等体积（2 - 5 µl）加入同一无菌离心管中，制备扩增子混合物。如果某个样本的条带看起来特别弱，则相对于其他样本加入两倍体积的该扩增子。
2. 使用PCR纯化试剂盒，按照制造商说明书²²去除扩增子混合物中的PCR引物。若扩增子混合物体积超过100 µl，需使用多个纯化柱进行纯化。注意：每个纯化柱的最大处理体积为100 µl。
   1. 将文库储存于-20 °C，或直接进行下一步操作。
3. 如适用，将去除了引物的扩增子混合物合并，以构建最终文库。使用分光光度计或荧光定量系统²³测定文库的DNA浓度。260/280比值在1.8 - 2.0之间表明DNA纯度较高。
4. 将文库稀释至20 nM。使用电泳仪检测文库质量，应观察到约400 bp处出现单一主条带。使用荧光定量系统²³确认文库浓度。
5. 用去离子水对文库进行1:10的最终稀释，使其浓度达到2 nM。随后可长期在20 °C下保存文库。
6. 将最终文库的一部分连同三种必需的测序引物（Read 1、Read 2和Index；参见材料/设备表）送至Illumina测序仪进行测序。若用于测序的样本数量少于300个，应在MiSeq平台上采用单端300 bp测序模式，并进行12 bp的Index读取，最终文库浓度为5 pM，并加入10%变性的PhiX作为对照。详细的测序操作说明请参见Caporaso et al. ISME J, 2012¹⁰的补充材料。

4. 序列分析

注意：此处概述了使用 QIIME 1.8.0 软件包进行序列分析的基本流程。为简化起见，所提供的命令假设映射文件名为 mapping.txt，12 bp 的索引读取文件名为 index.fastq，300 bp 的测序读取文件名为 sequences.fastq。请安装 QIIME 或 MacQIIME¹⁶，并熟悉 UNIX 的基本操作以执行这些命令。完整指南请参阅：

1. 完成实验的映射文件（表1）。尽可能包含详细的元数据。注明哪些样本是在同一批次中提取或扩增的，以判断是否存在批次效应。
2. 将映射文件保存为文本文件， 例如， mapping.txt。通过执行以下命令验证映射文件的格式：validate_mapping_file.py -m mapping.txt -o mapping_output
   注意：此命令使用内置的 "validate_mapping_file.py" QIIME 脚本，用于创建一个名为 "映射输出"，包含一个 .html 文件，用于指出映射文件中的错误（如有）。
3. 使用高通量测序数据质量评估软件（如 FastQC，http://www.bioinformatics.babraham.ac.uk/projects/fastqc/）检查测序读段的质量。 图5 展示了成功运行所能获得的每个碱基的序列质量。
   注意：测序仪为每个核苷酸碱基分配一个Phred质量分数，该分数对应于该碱基被错误识别的概率。Phred质量分数为10表示有10%的可能性该核苷酸被错误指定，20表示1%的可能性，30表示0.1%的可能性，而40（最高可能分数）表示0.01%的可能性。²⁴.
4. 使用测序数据的映射文件作为关键字，进行数据解复用和质量过滤，并将结果保存至一个文件夹（本例中称为 "sl_out"）通过执行此命令²⁵：split_libraries_fastq.py --rev_comp_mapping_barcodes -i sequences.fastq -o sl_out/ -b index.fastq -m mapping.txt -q 29
   注：q 标志表示最大不可接受的 Phred 质量分数， 例如， "-q 29" 过滤掉所有Phred评分低于30的序列，确保碱基识别的准确率达到99.9%。
5. 使用Greengenes 16S可操作分类单元（OTU）参考数据库²⁶ （http://qiime.org/home_static/dataFiles.html），通过执行以下命令进行开放参考OTU挑选²⁷: pick_open_reference_otus.py -i sl_out/seqs.fna -r 97_otus.fasta -o ucrss/ -s 0.1
   注意：-s 标志表示未能比对到参考数据库的序列中将被包含在内的比例 从头合成 聚类 "- s 0.1" 包含失败序列的10% 从头合成 聚类。使用 -a 标志并行化 OTU 拾取过程，若有多核可用，可将处理时间从数天缩短至数小时。
6. 通过执行此命令，将操作分类单元（OTU）在物种水平上进行合并，从而生成一个便于使用的分类丰度表²⁸: summarize_taxa.py -i ucress/otu_table_mc2.bimed -o summarized_otuSpecies/ -L 7
   注意：生成的表格可在任意电子表格软件中轻松查看。需注意，16S rRNA 测序通常无法可靠地提供种水平的分辨率。
7. 使用 QIIME 脚本 alpha_diversity.py 计算多个 alpha 多样性指标，以确定每个样本内的生态多样性。然后，使用 QIIME 脚本 beta_diversity.py 确定样本对之间的多样性。
8. 可视化数据， 例如，通过使用 EMPeror²⁹ 主坐标轴图或热图
9. 对映射文件类别进行正式的统计学比较， 例如， 使用 QIIME 的 compare_categories.py 脚本³⁰.

结果

该实验方案的总体概述如图1所示，该方案可通过16S rRNA基因测序技术从拭子样本中测定细菌的相对丰度。本方案已针对人类阴道拭子进行了优化，但也可轻松适用于大多数黏膜采样部位及其他宿主。图2展示了使用珠磨法提取所获得的高质量DNA和RNA。图3显示了12个样本PCR扩增的成功结果，每个样本均产生一条大小正确的单一强条带，而每个水阴性对照均未出现条带。图4展示了测序前对最终文库混合物进行定量的结果。图5显示了一次单端300 bp MiSeq测序运行后的典型序列质量谱图。

图1. 实验方案的示意图概述。 首先，通过在含有苯酚、氯仿和异戊醇的缓冲液中进行珠磨法裂解，从拭子样本中提取核酸。随后，利用PCR扩增16S rRNA基因的可变区4（V4区）。然后将多达数百个样本的PCR扩增产物混合，并在一次测序运行中进行测序。将获得的序列与参考数据库比对，以确定细菌的相对丰度。整个实验流程可在约三天内完成。请点击此处查看该图的放大版本。

图2. 使用苯酚:氯仿珠磨法提取的高质量核酸。(A) 通过分光光度计评估的DNA质量。A260/A280比值在1.8至2.0之间表明核酸纯度较高，未被苯酚或蛋白质污染。 (B) 经过柱纯化后，本方案可获得高质量RNA，表现为明显的16S和23S rRNA峰。(C) 若样本在采集后未保持低温（如运输和储存过程中）或在处理过程中存在RNase，则可能发生RNA降解。请点击此处查看该图的放大版本。

图3. 使用515F和带条形码的806R引物组成功扩增16S rRNA基因的验证。上图) 通过凝胶电泳确认每个使用模板扩增的样本均在约380个碱基对处出现单一条带。无条带表明扩增失败，通常由人为操作失误引起，应重复该样本的PCR反应。下图) 与样本平行运行的无模板（水）对照使用相同引物对时不应出现条带。若水对照中出现条带，表明试剂被污染，应丢弃可能受污染的试剂，并重新进行该引物对的模板及水对照PCR扩增。请点击此处查看该图的放大版本。

图 4. 最终文库混合物浓度的定量及文库片段大小的验证。 在合并各个样本的扩增子后，必须测定最终文库混合物的浓度。随后需进一步稀释文库混合物，以达到 2 nM 的浓度。请点击此处查看该图的放大版本。

图5. 测序读段各位置质量评分的代表性条形图。测序质量在200个碱基对之后下降属于正常现象，但平均质量评分应保持在30以上。请点击此处查看该图的放大版本。

#样本ID	条形码 序列		连接引物 序列			rcbc引物	样本类型	提取 批次	扩增 板	描述
#示例映射文件可在此处找到：http://qiime.org/_static/Examples/File_ Formats/ Example_ Mapping_ File.txt
AG2350	TCCCTTGTCTCC		CCGGACTACHVGGGTWTCTAAT			rcbc000	宫颈 拭子	1	A

表1. 信息映射文件模板。 创建准确且完整的信息映射文件对于成功执行本实验方案至关重要。该映射文件不仅是运行QIIME所必需的，还能帮助研究人员保持样本条形码与元数据之间的关联，用于分析数据中可能存在的系统性偏差（例如，批次间变异），并确定元数据与细菌群落之间的潜在相关性。本文提供了一个最简化的映射文件模板，但建议用户尽可能添加更多包含元数据的列。以阴道拭子样本为例，可添加的额外元数据包括受试者年龄、拭子采集的日期/时间、激素类避孕方式（如适用）、性传播感染检测结果等。

补充文件1. 带条形码的反向引物序列列表¹⁰。前三个列可用于完成比对文件，最后一列提供用于订购的完整引物序列。请点击此处下载该文件。

讨论

本文介绍了一种用于鉴定和表征人阴道拭子中相对细菌丰度的实验方案。该方案可轻松适用于其他类型的样本，例如粪便及其他身体部位的拭子，并可用于来自多种来源的样本。通过在含有苯酚和氯仿的缓冲液中进行珠击破碎提取核酸，可同时分离DNA和RNA，这在处理通过临床研究获得的珍贵样本时尤为重要。所获得的细菌DNA适用于细菌分类学鉴定和基因组组装，而同时获取的RNA则可用于通过RNA测序分析细菌、宿主及病毒的功能贡献。本方案采用经过验证的单步引物组，已在包括人类、犬类及环境样本在内的多种样本类型中成功应用¹⁰。数千种带条形码的引物可供使用，使样本能够多重混合，显著降低测序成本。当200个样本进行多重测序时，总成本（包括所有试剂、一次测序运行及引物，但不包括设备）约为每个样本20美元。此外，当来自同一采样部位的多个拭子样本独立经过整个流程处理时，结果具有很高的可重复性。总体而言，该方案经济高效、灵活可靠且可重复。

本方案中的核酸提取步骤受限于使用苯酚和氯仿时所需的安全防护措施，以及将流程自动化为高通量96孔板格式所面临的挑战。此外，用于机械裂解的剧烈珠击法会将细菌DNA剪切为约6千碱基的片段；如果下游应用需要更长的DNA片段，应缩短珠击时间。本方案中细菌鉴定部分的局限性源于所有依赖16S rRNA基因测序方法的共性。16S rRNA测序适用于细菌的属级甚至种级鉴定，但通常无法实现菌株水平的鉴定。尽管16S rRNA基因的V4可变区可在大多数细菌物种间提供可靠的区分能力¹¹，但仍可能需要使用Oligotyping³¹等额外的计算方法来精确鉴定某些物种，例如Lactobacillus crispatus。最后，仅通过16S rRNA基因测序无法确定特定样本中细菌的精确功能特性，尽管本方案支持提取可用于此目的的全基因组DNA和RNA。

确保本实验方案成功最关键的步骤是，在样本采集、核酸提取和PCR扩增过程中务必严格防止污染。在样本采集时，应佩戴洁净手套，并使用无菌拭子、无菌管和无菌剪刀，以保证无菌操作。为评估采集材料是否存在污染，可在采样时将额外的未使用拭子直接放入转运管中，作为阴性对照拭子。在实验室中，所有扩增前操作均应在经过灭菌的生物安全柜内进行，柜内仅放置已去污染的耗材，并仅使用分子级、无DNA的试剂。在核酸提取过程中，为防止交叉污染，每个样本均需使用新的无菌镊子和洁净手套，并始终保持所有离心管处于封闭状态，除非正在使用。同时平行处理未使用的拭子，可验证样本采集和核酸提取过程的无菌性；这些未使用的拭子在异丙醇沉淀和乙醇洗涤后不应出现沉淀物。若出现沉淀物，应进行16S rRNA基因扩增，以确定可能的污染来源（例如，若检测到Streptococcus或Staphylococcus，则提示存在皮肤污染）。此外，PCR扩增时应同时设置无模板对照反应，以确认PCR试剂和反应体系未被污染。若无模板对照中出现条带，则应弃用当前试剂，并更换新试剂后重新进行扩增。采取上述预防措施可确保目标细菌的成功测序。

PCR 扩增步骤通常需要最多的故障排查。以每组十二个样本进行扩增，可在效率与一致性之间取得平衡。若某一扩增组中所有样本均完全无条带，表明发生了系统性失败，例如，遗漏添加试剂或错误设置热循环仪程序。若仅有少数样本无条带，通常归因于人为操作失误，应使用相同的样本与反向引物配对重新进行扩增。若仍无法扩增出条带，可尝试使用带有不同条形码的反向引物对样本重新扩增。若使用多个不同反向引物均持续扩增失败，可能提示样本中存在抑制物。此时，通过柱纯化方法纯化 DNA 通常可有效去除抑制物，同时不会显著改变细菌相对丰度。若扩增后出现多条条带，应使用不同条形码的反向引物对样本重新扩增。

除了防止环境污染并确保扩增单一特异性产物外，成功的测序还依赖于文库混合制备过程中的细致操作。目标是将每个样本的扩增子以等摩尔量混合，以确保每个样本获得大致相同的测序读长数量。如果扩增前核酸浓度相近，则在构建文库混合物时，只需加入等体积的各样本扩增子即可。然而，如果核酸浓度差异较大且仍加入等体积，则低核酸浓度的样本将因读长数量少而被严重低估。在此情况下，可根据凝胶条带的相对强度，增加低浓度样本扩增子的加入体积。或者，也可更严格地去除各个扩增子中的引物，使用荧光法定量双链DNA的定量试剂盒精确测定各样本扩增子的浓度，并据此精确混合等摩尔量的各样本扩增子。

一旦获得均衡的扩增子文库，精确测定文库浓度就变得至关重要。随后需谨慎进行稀释，并加入PhiX以提高测序读段的复杂性，这对于获得最佳测序结果至关重要。采用边合成边测序技术的高通量测序仪对流动池上的簇密度非常敏感。若上样文库浓度过高，会导致簇过度密集，从而降低测序质量评分、减少数据产出并造成不准确的样本解复用³²。若上样文库浓度过低，同样会导致数据产出低下。在测序前对文库进行精确的定量，可确保获得最佳测序结果。

16S rRNA基因测序可全面评估特定样本中存在的细菌，是假设生成中至关重要的第一步。丰富的元数据信息可进一步帮助研究人员检验特定细菌种类与重要生物学因素之间的关联。此外，还可利用PICRUSt³³等工具，基于相同的16S数据推断细菌的功能。最终目标是通过16S表征发现新的关联性，随后在模型系统中进行进一步验证，从而加深我们对细菌微生物组在人类健康与疾病中作用的理解。

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
设备：
Mini-Beadbeater-16	BioSpec	607
PCR工作站			可使用任意PCR生物安全柜，例如AirClean 600。
热循环仪			可使用带加热盖的任意热循环仪，例如MJ Research PTC-200。
电泳系统			可使用任意电泳系统，例如Thermo Scientific Owl EasyCast B1 Mini Gel Electrophoresis系统。
超微量分光光度计（Nanodrop）	Thermo Scientific	2000C	其他DNA定量方法亦可满足要求
生物分析仪（Bioanalyzer）	Agilent	2100	可选替代设备为Agilent 2200 TapeStation仪器。非绝对必需，但非常有用。
MiSeq或HiSeq	Illumina
名称	公司	货号	备注
材料：
Catch-All样本采集拭子	Epibio	QEC89100	可使用其他拭子，但人类微生物组计划推荐使用Catch-All拭子。
ELIMINase	Fisher	04-355-31
50 ml无菌滤器（0.22 µm）	EMD Millipore	SCGP00525
0.1 mm玻璃珠	BioSpec	11079101
2 ml螺口管	Sarstedt	72.694.006	用于珠磨破碎
UltraPure 5M NaCl	Life Technologies	24740-011	分子生物学级
1 M Tris-HCl	Ambion (Invitrogen)	AM9856	分子生物学级
0.5 M EDTA	Ambion (Invitrogen)	AM9260G	分子生物学级
十二烷基硫酸钠（SDS），20%溶液	Fisher	BP1311-200	分子生物学级
UltraPure无DNase/RNase蒸馏水	Ambion	10977-015	分子生物学级，用于缓冲液配制
2-丙醇，生物试剂，用于分子生物学，≥99.5%	Sigma	I9516-500ML	分子生物学级
苯酚:氯仿:异戊醇（IAA），25:24:1	Invitrogen	AM9730	警告：有毒
3 M乙酸钠，pH 5.5	Life Technologies	AM9740	分子生物学级
一次性无菌聚苯乙烯镊子（PS）	Cole Parmer	EW-06443-20
1.5 ml透明PCR洁净管	Eppendorf	22364120
PCR级水	MoBio	17000-11	用于PCR
Phusion高保真DNA聚合酶	New England Biolabs	M0530S
dNTP混合液	Sigma	D7295-0.5mL
0.2 ml PCR 8联管，带透明平盖，自然色	USA Scientific	1492-3900	任何无DNase、RNase、DNA及PCR抑制剂的8联管均可使用
琼脂糖	BioExpress	E-3121-25
50x TAE缓冲液	Lonza	51216
DNA凝胶染料	Invitrogen	S33102
6x DNA上样缓冲液	Thermo (Fisher)	R0611
50 bp GeneRuler DNA Marker	Thermo (Fisher)	SM0373
AllPrep DNA/RNA试剂盒	Qiagen	80284
UltraClean PCR纯化试剂盒	MoBio	12500-100
Quant-iT PicoGreen双链DNA检测试剂盒	Thermo Fisher Scientific	P11496	可选替代方案为Qubit荧光定量法（Life Technologies）
名称	公司	货号	备注
引物：
515F（正向引物） 5'-AATGATACGGCGACCACCGAG ATCTACACTATGGTAATTGT GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3'			订购量为100 nmol；纯化方式：标准脱盐。用100 µM浓度重悬。**关键：引物必须在生物安全柜中使用MoBio PCR级水（见上文）重悬，以避免污染。**
反向引物，请参见补充代码文件及：ftp://ftp.metagenomics.anl.gov/data/misc/EMP/SupplementaryFile1_barcoded _primers_515F_806R.txt	推荐使用IDT公司产品		若需订购大量引物，建议以96孔板形式在100 nmol规模下单。重悬至100 μM浓度。引物订购与重悬的完整说明请见：http://www.earthmicrobiome.org/files/2013/04/EMP_primer_ordering_and _resuspension.doc。  **关键：引物必须在生物安全柜中使用MoBio PCR级水（见上文）重悬，以避免污染。**
读长1测序引物 5'-TAT GGT AAT TGT GTG CCA GCM GCC GCG GTA A-3'			25 nmol；纯化方式：标准脱盐。重悬至100 µM浓度。
读长2测序引物 5'-AGT CAG TCA GCC GGA CTA CHV GGG TWT CTA AT-3'			26 nmol；纯化方式：标准脱盐。重悬至100 µM浓度。
索引测序引物 5'-ATT AGA WAC CCB DGT AGT CCG GCT GAC TGA CT-3'			27 nmol；纯化方式：标准脱盐。重悬至100 µM浓度。
PhiX Control v3	Illumina	FC-110-3001	若在本单位进行测序则为必需。若由第三方测序中心完成测序，则对方已备有PhiX。