海藻酸钙微珠中多酶共固定化用于辅因子再生及提高重复使用性

摘要

本文介绍了共固定化全细胞生物催化剂以实现辅因子再生并提高其可重复利用性的实验方案，以L-木酮糖的生产为例。通过偶联两种表达功能互补酶的Escherichia coli菌株实现辅因子再生；全细胞生物催化剂的固定化则通过将细胞包埋于海藻酸钙小球中完成。

摘要

我们近期开发了一种简单、可重复使用且耦合的全细胞生物催化系统，该系统具备辅因子再生和生物催化剂固定化的能力，可提高产物产率并实现持续合成。本文详细描述了此类系统的实验构建方法，该系统由两种表达功能互补酶的 E. coli 菌株组成。这两种酶可协同作用，介导昂贵辅因子的再生，从而提高生物反应的产物产率。此外，本文还报道了通过将全细胞包埋于海藻酸钙微球中，制备固定化耦合生物催化系统的方法。作为示例，我们展示了通过耦合表达L-阿拉伯糖醇脱氢酶或NADH氧化酶的 E. coli 细胞，实现由L-阿拉伯糖醇高效生物合成L-木酮糖的过程。在最优条件下，使用150 mM初始浓度的L-阿拉伯糖醇，L-木酮糖的最大产率可达96%，高于文献报道的水平。固定化的耦合全细胞生物催化剂表现出良好的操作稳定性，在连续重复使用7个循环后，仍能保持第一个循环产率的65%；而游离细胞系统则几乎完全丧失催化活性。因此，本文所报道的方法提供了两种策略，不仅有助于提升L-木酮糖的工业化生产水平，也可广泛应用于其他依赖辅因子的高附加值化合物的生产。

引言

利用微生物进行还原性全细胞生物转化已成为化学-酶法合成具有商业和治疗价值的生物分子的广泛应用方法^1-3与使用分离酶相比，它具有多项优势，特别是能够省去成本高昂的下游纯化过程，并表现出更长的使用寿命^4-7对于需要辅因子才能生成产物的生物催化途径，全细胞系统有可能提供 原位 通过添加廉价的电子供体共底物实现辅因子再生^5,8,9然而，对于需要化学计量浓度的稀有或昂贵共底物的反应，这种能力会减弱^10-13结合全细胞重复利用性差的问题，这阻碍了可扩展且连续化生产系统的建立。为了克服上述局限性，需要对依赖辅因子的全细胞生物转化系统进行战略性改造。特别是，协同作用的全细胞生物催化剂组合已被证明能显著提高所含酶的生产效率和稳定性¹⁴这些因素对于实现具有商业可行性的产品的大规模生产往往至关重要，而通过共固定化生物催化微生物可进一步优化这些条件。¹⁵我们最近开发了一种简单且可重复使用的全细胞生物催化系统，该系统可同时实现辅因子再生和生物催化剂固定化，用于L-木酮糖的生产¹⁶在本研究中，该系统被用作示例，以说明应用这两种策略提高生物转化产率和生物催化剂可重复使用性的实验步骤。

L-木酮糖属于一类名为....

方案

1. 全细胞生物催化剂的制备  

注意：携带 pET28a-SpNox³¹ 或 pET28a-HjLAD²⁸ 的重组 E. coli 细胞此后分别称为 E. coli_SpNox 和 E. coli_HjLAD。

1. 将一株大肠杆菌E. coli_HjLAD单菌落接种于3 ml 添加卡那霉素（50 µg/ml）的LB（Luria-Bertani）培养基中，于37 ^oC、250 rpm条件下在摇床培养箱中过夜培养。
2. 将上述菌液按1:100比例转接至200 ml 含50 µg/ml 卡那霉素的新鲜LB培养基中，于37 ^oC、250 rpm条件下培养至OD₆₀₀达到约0.6。
3. 向培养基中加入0.1 mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）以诱导HjLAD蛋白表达，并于16 ^oC、180 rpm条件下继续培养16小时。
   1. 或者，若当天进行后续L-木酮糖生物合成（见下文步骤2），可在25 ^oC、200 rpm条件下诱导6小时 。

结果

为了实现辅因子再生，采用包含E. coli_HjLAD和E. coli_SpNox细胞的偶联全细胞生物催化系统进行L-木酮糖的合成。在优化各项参数后，通过将该系统固定于海藻酸钙小球中，提高了其可重复使用性（图2）。

偶联辅因子再生的L-木酮糖生产 E. coli_HjLAD 和 E. coli_SpNox 细胞.<.......

讨论

近年来的技术进步推动了重组生物治疗药物的商业化进程，导致其在生物技术产业中的市场价值逐步上升。其中一项重要进展是重组微生物中代谢工程的应用，该技术在建立可放大的工业系统方面展现出巨大潜力³⁸。与大多数工艺类似，由基因工程微生物生产的重组生物分子能否成功实现商业化，在很大程度上取决于系统的生产产量³⁹。这促使了“" brute force "”遗传学方法的快速发展³⁹，其中通过定向进化生物催化酶以提高生物催化剂活性³。然而，对于某些代谢途径（如氧化还原途径），仅提升生物催化剂性能并不足以实现生产过程的经济化，因为其他关键反应条件（例如昂贵的辅因子）具有显著影响。即使使用了性能改善的生物催化剂，此类系统的放大生产仍会导致生产成本增加。因此，针对涉及辅因子化学计量比的生物反应，需要采用额外的战略性方法来实现商业化。此外，生物催化剂的可重复使用性对于提高生物工艺的经济可行性也至关重要。为克服辅因子快速消耗以及全细胞生物催化剂重复使用性差的限制，我们此前已开发出一种固定化的耦合全细胞生物催化系统，用于辅因子再生和稳定重复利用¹⁶

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
LB 肉汤	Sigma Aldrich	L3022-6X1KG
卡那霉素	Fisher	BP906-5
异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）	Sigma Aldrich	I6758-10G
Tris 碱	Fisher	BP1521
β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水合物	Sigma Aldrich	N7004-1G
L-阿拉伯糖醇	Sigma Aldrich	A3506-10G
L-半胱氨酸	Sigma Aldrich	168149
硫酸	Sigma Aldrich	320501-500ML
咔唑	Sigma Aldrich	C5132
乙醇	Fisher	BP2818-4
海藻酸钠	Sigma Aldrich	W201502
二水氯化钙	Sigma Aldrich	223506-500G
Excella E24 摇床培养箱	New Brunswick Scientific
Cary 60 紫外-可见分光光度计	Agilent Technologies
Centrifuge 5810R 离心机	Eppendorf
烧杯	Fisher
注射器	Fisher
针头	Fisher
Pioneer 分析与精密电子天平	Ohaus