海藻酸钙微珠中多酶共固定化用于辅因子再生及提高重复使用性

摘要

本文介绍了共固定化全细胞生物催化剂以实现辅因子再生并提高其可重复利用性的实验方案，以L-木酮糖的生产为例。通过偶联两种表达功能互补酶的Escherichia coli菌株实现辅因子再生；全细胞生物催化剂的固定化则通过将细胞包埋于海藻酸钙小球中完成。

摘要

我们近期开发了一种简单、可重复使用且耦合的全细胞生物催化系统，该系统具备辅因子再生和生物催化剂固定化的能力，可提高产物产率并实现持续合成。本文详细描述了此类系统的实验构建方法，该系统由两种表达功能互补酶的 E. coli 菌株组成。这两种酶可协同作用，介导昂贵辅因子的再生，从而提高生物反应的产物产率。此外，本文还报道了通过将全细胞包埋于海藻酸钙微球中，制备固定化耦合生物催化系统的方法。作为示例，我们展示了通过耦合表达L-阿拉伯糖醇脱氢酶或NADH氧化酶的 E. coli 细胞，实现由L-阿拉伯糖醇高效生物合成L-木酮糖的过程。在最优条件下，使用150 mM初始浓度的L-阿拉伯糖醇，L-木酮糖的最大产率可达96%，高于文献报道的水平。固定化的耦合全细胞生物催化剂表现出良好的操作稳定性，在连续重复使用7个循环后，仍能保持第一个循环产率的65%；而游离细胞系统则几乎完全丧失催化活性。因此，本文所报道的方法提供了两种策略，不仅有助于提升L-木酮糖的工业化生产水平，也可广泛应用于其他依赖辅因子的高附加值化合物的生产。

引言

利用微生物进行还原性全细胞生物转化已成为化学-酶法合成具有商业和治疗价值的生物分子的广泛应用方法^1-3与使用分离酶相比，它具有多项优势，特别是能够省去成本高昂的下游纯化过程，并表现出更长的使用寿命^4-7对于需要辅因子才能生成产物的生物催化途径，全细胞系统有可能提供 原位 通过添加廉价的电子供体共底物实现辅因子再生^5,8,9然而，对于需要化学计量浓度的稀有或昂贵共底物的反应，这种能力会减弱^10-13结合全细胞重复利用性差的问题，这阻碍了可扩展且连续化生产系统的建立。为了克服上述局限性，需要对依赖辅因子的全细胞生物转化系统进行战略性改造。特别是，协同作用的全细胞生物催化剂组合已被证明能显著提高所含酶的生产效率和稳定性¹⁴这些因素对于实现具有商业可行性的产品的大规模生产往往至关重要，而通过共固定化生物催化微生物可进一步优化这些条件。¹⁵我们最近开发了一种简单且可重复使用的全细胞生物催化系统，该系统可同时实现辅因子再生和生物催化剂固定化，用于L-木酮糖的生产¹⁶在本研究中，该系统被用作示例，以说明应用这两种策略提高生物转化产率和生物催化剂可重复使用性的实验步骤。

L-木酮糖属于一类名为稀有糖的生物有用分子。稀有糖是一类在自然界中极为罕见的独特单糖或糖类衍生物，但在生物活性分子中作为识别元件发挥着关键作用^17,18它们具有多种应用，范围涵盖甜味剂、功能性食品到潜在的治疗剂¹⁹L-木酮糖可作为多种α-葡萄糖苷酶的潜在抑制剂，也可用作肝炎或肝硬化的指示标志物^17,20. 已有文献报道，在全细胞体系中可高效将木糖醇转化为L-木酮糖 Pantoea ananatis^21,22, 产碱菌属 sp. 701B²³, Bacillus pallidus Y25^24,25 和 大肠杆菌²⁶。在 大肠杆菌， 然而，这仅在使用低（<67 mM 木糖醇浓度²⁶ 由于初始木糖醇浓度高于100 mM可能对木糖醇-4-脱氢酶活性产生抑制作用^21,26木酮糖与木糖醇之间的热力学平衡强烈倾向于生成木糖醇^25,27此外，木酮糖的产量受限于在缺乏某种条件时需添加的昂贵辅因子的用量 在 原位 辅因子再生系统。这些因素共同限制了L-木酮糖生物合成向可持续体系放大的潜力。

为了克服这些局限性并提高L-木酮糖的生物转化产率，首先采用辅因子再生策略，构建了偶联的全细胞生物催化系统。具体而言，选用了来自Hypocrea jecorina（HjLAD）的L-阿拉伯糖醇4-脱氢酶（EC 1.1.1.12），该酶是真菌L-阿拉伯糖分解代谢途径中的一种酶，可催化L-阿拉伯糖醇转化为L-木酮糖^28,29。与许多生物合成酶类似，HjLAD的主要局限在于其催化反应需要化学计量比的昂贵辅酶烟酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD⁺，即NADH的氧化形式）。来自Streptococcus pyogenes（SpNox）的NADH氧化酶已被证明具有高效的辅因子再生能力^30,31。利用SpNox的这一特性，将表达HjLAD的E. coli细胞（用于生产L-木酮糖）与表达SpNox的E. coli细胞（用于再生NAD⁺）进行偶联，从而通过图1A所示的偶联反应显著提高L-木酮糖的产量。在最优条件下，使用初始浓度为150 mM的L-阿拉伯糖醇，L-木酮糖的最大产率可达96%，使该系统效率显著高于文献报道的其他系统。

接下来采用全细胞固定化策略，以进一步提高偶联生物催化系统的可重复使用性。常用的全细胞固定化方法包括吸附/共价连接至固相载体、交联/包埋以及在聚合物网络中的封装³²。在这些方法中，最适合细胞固定化的是海藻酸钙微球封装法。其温和的凝胶化特性、惰性的水相基质以及高孔隙率有助于保持被封装生物材料的生理特性和功能活性³³。因此，将含有携带HjLAD或SpNox的E. coli细胞的偶联生物催化系统固定化于海藻酸钙微球中，以实现L-木酮糖的多批次生产（图2）。该固定化生物催化系统表现出良好的操作稳定性，在连续重复使用7个循环后，仍能保持第一个循环转化率的65%，而游离细胞系统则几乎完全丧失了催化活性。

方案

1. 全细胞生物催化剂的制备  

注意：携带 pET28a-SpNox³¹ 或 pET28a-HjLAD²⁸ 的重组 E. coli 细胞此后分别称为 E. coli_SpNox 和 E. coli_HjLAD。

1. 将一株大肠杆菌E. coli_HjLAD单菌落接种于3 ml 添加卡那霉素（50 µg/ml）的LB（Luria-Bertani）培养基中，于37 ^oC、250 rpm条件下在摇床培养箱中过夜培养。
2. 将上述菌液按1:100比例转接至200 ml 含50 µg/ml 卡那霉素的新鲜LB培养基中，于37 ^oC、250 rpm条件下培养至OD₆₀₀达到约0.6。
3. 向培养基中加入0.1 mM异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）以诱导HjLAD蛋白表达，并于16 ^oC、180 rpm条件下继续培养16小时。
   1. 或者，若当天进行后续L-木酮糖生物合成（见下文步骤2），可在25 ^oC、200 rpm条件下诱导6小时 。
4. 在4 ^oC条件下，以3,200 × g离心20分钟收集诱导后的E. coli_HjLAD细胞，弃去上清液，随后进行步骤2处理菌体沉淀。
5. 同时，对E. coli_SpNox执行步骤1.1至1.4。

2. 通过偶联大肠杆菌E. coli_HjLAD与E. coli_SpNox实现辅因子再生以生物合成L-木酮糖

1. 分别将 E. coli_HjLAD 和 E. coli_SpNox 的细胞沉淀重悬于 50 mM Tris-HCl 缓冲液（pH 8.0）中，细胞密度为 5.0 g 干细胞重量（gDCW）/L。
   注意：可建立 gDCW 与在 600 nm 处测得的光密度（OD₆₀₀）之间的相关性，以方便实验操作。本方案中使用的公式为 1 gDCW/L = 0.722 × OD₆₀₀ - 0.0965，该公式可能因不同分光光度计而有所差异。
2. 在 14 ml 圆底试管中加入 600 µl 5.0 gDCW/L 的 E. coli_HjLAD、600 µl 5.0 gDCW/L 的 E. coli_SpNox、100 µl 20 mM NAD⁺ 以及 150 µl 2 M L-阿拉伯糖醇，并加入 550 µl 50 mM Tris-HCl（pH 8.0）将反应体积调至 2 ml 。
   注意：可优化两种全细胞生物催化剂的用量比例以提高产物的生物合成效率。对于本描述体系，E. coli_SpNox:E. coli_HjLAD = 1:1 的比例对 L-木酮糖的生物合成最为理想（图 1B）。
3. 将反应混合物在 30 ^oC、200 rpm 条件下孵育 8 小时。
4. 在 4 ^oC、3,200 × g 条件下离心 10 分钟后收集上清液，并按照下文步骤 3 所述方法测定 L-木酮糖的产量。

3. L-木酮糖定量的比色法检测

1. 从步骤 2.4 收集的反应上清液中吸取 100 µl 至 1.5 ml 离心管中。
2. 加入 50 µl 1.5% 半胱氨酸溶液、900 µl 70% 硫酸溶液和 50 µl 溶于乙醇的 0.1% 卡巴唑溶液，轻轻翻转离心管 3 次以混匀。
3. 将反应混合物在 37 ^oC、200 rpm 条件下孵育 20 分钟。
4. 使用分光光度计在 560 nm 处测定反应混合物的光吸收值（A₅₆₀）。
   1. 若 A₅₆₀ 读数超过 1，则对反应混合物进行稀释。

4. 重组全细胞催化剂在海藻酸钙小球中的固定化

1. 将4 g海藻酸钠溶解于100 ml水中 蒸馏水。通过将海藻酸钠加入水中来配制海藻酸钠溶液，以避免形成团块。必要时可加热混合物。
2. 加入 600 µl 5.0 gDCW/L E. coli_HjLAD 和 600 µl 5.0 gDCW/L E. coli_SpNox 在 1.2 ml 中 将第4.1步制备的4%海藻酸钠与细胞轻柔吹打混匀，避免产生气泡。
3. 用针头将海藻酸盐/细胞悬液吸入注射器，然后逐滴加入0.3 M氯化钙（CaCl₂）溶液中₂) 溶液于100 ml 烧杯中持续搅拌。
   注意：CaCl₂ 的体积₂ 用于海藻酸盐微球形成的溶液应足量，以确保海藻酸盐液滴完全浸没。此外，注射器针头与氯化钙溶液液面之间的距离必须保持在最佳范围内，以保证形成均匀的球形微球。该最佳距离范围可通过实验确定，并取决于针头的内径。据估算，对于内径为0.6 cm的注射器针头，约15 ± 5 cm的距离较为适宜。
4. 将珠子留在 CaCl₂ 溶液中₂ 溶液处理 2 - 3 小时 室温下静置，不搅拌，以促进交联和凝胶微珠的形成。
5. 倒出 CaCl₂ 溶液，注意不要扰动珠子，需小心倾倒 CaCl₂ 溶液转移至50 ml 锥形管，并转移剩余的珠子至 CaCl₂ 将溶液转移至另一个50 ml离心管中 锥形管
6. 用10 ml缓冲液洗涤磁珠 用50 mM Tris-HCl（pH 8.0）缓冲液洗涤三次，以去除过量的CaCl₂₂ 未包封的细胞。
   注意： 在任何步骤中均不得离心珠子，因为离心会导致珠子破裂。若需将珠子与溶液分离，可将悬浮液静置 3 - 5 分钟，待珠子沉降至底部后，将洗涤缓冲液倾入另一容器中。
   1. 做 不 弃去用过的洗涤缓冲液。将用过的 Tris-HCl 洗涤缓冲液（30 ml）与用过的 CaCl₂ 洗涤缓冲液合并。₂ 步骤 4.5 中收集的溶液
7. 沉淀未固定的 E. coli 通过离心汇集的CaCl₂ 并以3,200 × g离心20分钟收集步骤4.6中的Tris-HCl溶液。为测定固定化效率，按照步骤2.1所述方法计算沉淀中未包埋细胞的干重密度（gDCW/L）。
8. 将步骤 4.6 中洗涤后的珠子转移至一个离心管中。按照步骤 2.2 - 3.4，使用全部洗涤后的珠子代替细胞沉淀，检测 L-木酮糖的生物合成。

5. 固定化生物催化剂生产L-木酮糖的稳定性测定

1. 收集步骤 4.8 中的珠子，并用 10 ml 不含离心步骤的 50 mM Tris-HCl（pH 8.0）缓冲液洗涤两次（如步骤 4.6 所述）。
2. 使用全部洗涤后的珠子，按照步骤 2.2 - 3.4 所述进行反应。
3. 根据需要重复步骤 5.1 - 5.2 的生产循环次数，并测定每个循环中反应上清液中产生的 L-木酮糖的量。

结果

为了实现辅因子再生，采用包含E. coli_HjLAD和E. coli_SpNox细胞的偶联全细胞生物催化系统进行L-木酮糖的合成。在优化各项参数后，通过将该系统固定于海藻酸钙小球中，提高了其可重复使用性（图2）。

偶联辅因子再生的L-木酮糖生产 E. coli_HjLAD 和 E. coli_SpNox 细胞.<...

讨论

近年来的技术进步推动了重组生物治疗药物的商业化进程，导致其在生物技术产业中的市场价值逐步上升。其中一项重要进展是重组微生物中代谢工程的应用，该技术在建立可放大的工业系统方面展现出巨大潜力³⁸。与大多数工艺类似，由基因工程微生物生产的重组生物分子能否成功实现商业化，在很大程度上取决于系统的生产产量³⁹。这促使了“" brute force "”遗传学方法的快速发展³⁹，其中通过定向进化生物催化酶以提高生物催化剂活性³。然而，对于某些代谢途径（如氧化还原途径），仅提升生物催化剂性能并不足以实现生产过程的经济化，因为其他关键反应条件（例如昂贵的辅因子）具有显著影响。即使使用了性能改善的生物催化剂，此类系统的放大生产仍会导致生产成本增加。因此，针对涉及辅因子化学计量比的生物反应，需要采用额外的战略性方法来实现商业化。此外，生物催化剂的可重复使用性对于提高生物工艺的经济可行性也至关重要。为克服辅因子快速消耗以及全细胞生物催化剂重复使用性差的限制，我们此前已开发出一种固定化的耦合全细胞生物催化系统，用于辅因子再生和稳定重复利用¹⁶

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
LB 肉汤	Sigma Aldrich	L3022-6X1KG
卡那霉素	Fisher	BP906-5
异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）	Sigma Aldrich	I6758-10G
Tris 碱	Fisher	BP1521
β-烟酰胺腺嘌呤二核苷酸水合物	Sigma Aldrich	N7004-1G
L-阿拉伯糖醇	Sigma Aldrich	A3506-10G
L-半胱氨酸	Sigma Aldrich	168149
硫酸	Sigma Aldrich	320501-500ML
咔唑	Sigma Aldrich	C5132
乙醇	Fisher	BP2818-4
海藻酸钠	Sigma Aldrich	W201502
二水氯化钙	Sigma Aldrich	223506-500G
Excella E24 摇床培养箱	New Brunswick Scientific
Cary 60 紫外-可见分光光度计	Agilent Technologies
Centrifuge 5810R 离心机	Eppendorf
烧杯	Fisher
注射器	Fisher
针头	Fisher
Pioneer 分析与精密电子天平	Ohaus