我们演示了将Haemophilus influenzae接种至小鼠下呼吸道的气管内感染操作步骤。该方法是研究小鼠模型中调控气道炎症信号通路的一项非常有用的工具。
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本文内容
摘要
摘要
本文介绍了一种高效且直接将流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）递送至小鼠下呼吸道的详细操作流程。我们展示了制备流感嗜血杆菌（H. influenzae）接种物、将流感嗜血杆菌（H. influenzae）经气管注入肺部、收集支气管肺泡灌洗液（BALF）、分析BALF中免疫细胞以及进行差异基因表达分析所需的RNA提取等步骤。该方法可用于研究肺部对任何细菌、病毒或真菌引发的炎症反应。相较于经鼻腔接种或气溶胶吸入法，直接气管注入法更为常用，因其能更高效地将细菌接种物递送至下呼吸道，且操作结果更明确可靠。
引言
炎症是机体抵御病原体的一种基本免疫防御机制。它可促进病原体的清除以及受损组织的修复，同时有助于恢复至正常的健康状态1。然而，失控的炎症反应常导致慢性炎症性疾病2。气道炎症是多种肺部疾病（如慢性阻塞性肺疾病（COPD）、哮喘和肺纤维化）的初始诱发因素3。
非分型（无荚膜）流感嗜血杆菌（NTHi）与慢性上、下呼吸道炎症性疾病相关4,5。它是从慢性阻塞性肺疾病儿童和成人下呼吸道分离出的主要菌种4,6,7。NTHi感染后的炎症反应特征是促炎细胞因子（如TNF和IL-1β）表达上调，并通过Toll样受体（TLRs）介导，激活丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和核因子-κB（NF-κB）通路8。
小鼠模型是分析肺部炎症性疾病潜在病理机制的非常有用的工具，因为存在多种基因缺陷品系。已有多种方法用于接种活菌/减毒细菌及细菌产物，包括经鼻滴注和气溶胶吸入9,10。本文中，我们展示气管内滴注法。尽管该方法使用较少，但由于可将接种物直接递送至下呼吸道，因此效率更高且可重复性极强。
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方案
所有实验均按照贝勒研究所机构动物照护与使用委员会（IACUC）的指南进行。
1. 培养非分型流感嗜血杆菌 流感嗜血杆菌 （流感嗜血杆菌）及接种物的制备
- 将NTHi接种于巧克力琼脂平板上，倒置平板并置于湿润的CO₂培养箱中培养2 37 °C、5% CO₂ 培养箱中过夜培养2次日，将细菌接种于脑心浸液肉汤中培养。然后，取1 ml肉汤加入无菌的1.5 ml离心管中。
- 在室温下以 4,000 x g 离心 5 分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于 1 ml 无菌 1x PBS 中。重复此步骤一次。
- 将100 µl重悬液转移至900 µl的1x PBS中，在分光光度计中测定稀释菌液在600 nm波长处的吸光度。
- 通过在巧克力琼脂平板上培养1:10系列稀释的接种物，并于37 °C、5% CO₂条件下过夜培养，测定接种物的活力及菌落形成单位（CFUs）。2.
- 根据上一步确定的活菌数和菌落形成单位（CFUs），将接种物调整至终浓度为 20 x 106 CFU/ml
2. 气管内（i.t）灌注
- 按每 10 克体重注射 0.1 ml 的剂量，向小鼠腹腔内（i.p.）注射 150 mg/ml 戊巴比妥钠 + 20 mg/ml 塞拉嗪混合溶液。 操作应在带有光源的通风橱内进行，以保持动物体温。
- 捏压小鼠足趾间的区域，确认小鼠已充分麻醉。
- 将小鼠仰卧放置。剃除颈部腹侧区域的毛发，并用氯己定和 70% 乙醇消毒。
- 使用大鼠齿镊提起颈部腹侧上方的皮肤。用手术刀在胸腺上方做一较小切口（0.5–1.0 cm），小心分离肌肉组织以暴露气管。
- 使用带 27 G 针头的 1 ml 注射器，缓慢注入 0.05 ml 空气，随后注入来自第 1 节的 0.05 ml NTHi 菌液或作为对照的生理盐水，最后再注入 0.05 ml 空气。将动物保持垂直位置约 1 分钟。
- 用外科胶水闭合切口。将小鼠侧卧并保温约 10 分钟。
3. 支气管肺泡灌洗液采集
- 感染后24小时通过颈椎脱位处死小鼠。
- 使用解剖剪打开小鼠腹腔，剪断腹主动脉放血，暴露肺的腹侧部分。
- 暴露气管，并用20号导管进行插管。注入0.8 ml支气管肺泡灌洗液缓冲液（1×PBS、0.1%葡萄糖、10 U/ml肝素），通过轻柔抽吸收集灌洗液。重复此操作三次。
- 使用血细胞计数板在10倍显微镜下结合台盼蓝染色，对100 µl BALF悬液中的总细胞数进行计数。
- 制备用于改良吉姆萨染色的玻片。取100 µl BALF加入细胞离心涂片机的相应孔中，在500 × g下离心5分钟。将玻片干燥10分钟，然后根据制造商说明书使用改良吉姆萨染液对细胞进行染色。
- 将剩余细胞用于后续分析，如荧光激活细胞分选（FACS）、共聚焦显微镜、基因表达分析和蛋白质印迹11-13。
4. 组织病理学制备
- 进行组织病理学分析时，按照步骤2.4所述方法用NTHi感染小鼠。感染24小时后，通过颈椎脱位法处死动物。使用解剖剪刀剪开胸腔以暴露肺和气管（如前所述）。然后将20号导管插入气管中。
- 用在4%甲醛中配制的2%温热琼脂糖溶液灌注肺部。当肺完全膨胀后，在肺表面放置冰块以使琼脂糖溶液凝固。
- 随后小心取出胸腔组织块，并将其置于含有50 ml 4%甲醛（溶于1×PBS）的溶液中固定，直至进行苏木精-伊红（H&E）染色切片处理。
5. 支气管肺泡灌洗液中细胞的流式细胞术染色
- 将支气管肺泡灌洗液（BALF）中的 1 × 105 个细胞加入至 96 孔 V 型底微量培养板中。
- 用 300 µl 冷的 1× PBS 洗涤细胞，并在 4 °C 下以 4,000 × g 离心 3 分钟。
- 在 100 µl 1× PBS 中加入细胞染色液（1:1,000 稀释），室温避光孵育 15 分钟。
- 用 300 µl 冷的 1× PBS 在 4 °C 下以 4,000 × g 离心 3 分钟，洗涤细胞。
- 将细胞重悬于 100 µl FACS 洗涤缓冲液 [洗涤缓冲液（1× PBS，2% FBS，1 mM EDTA，0.1% 叠氮化钠）] 中，并加入 1:100 稀释的 Fc 阻断剂，4 °C 孵育 15 分钟。
- 以 4,000 × g 离心 3 分钟，弃上清液。
- 在 100 µl 含表面染色抗体混合液（1:100 稀释）的 FACS 洗涤缓冲液中，4 °C 避光孵育 30 分钟。
- 用 300 µl FACS 洗涤缓冲液在 4 °C 下以 4,000 × g 离心 3 分钟，洗涤细胞三次。
- 用 100 µl 4% 多聚甲醛在室温固定细胞 15 分钟。
- 用 300 µl 1× PBS 在 4 °C 下以 400 × g 离心 3 分钟，洗涤细胞两次，然后将细胞重悬于 300 µl FACS 洗涤缓冲液中。
- 使用流式细胞术微球制备单色染色对照。
- 向 96 孔 V 型底微量培养板中加入一滴微球，用 200 µl 1× PBS 洗涤。
- 向 100 µl 1× PBS 与微球的混合液中加入 1 µl 染色抗体，室温孵育 5 分钟。
- 用 300 µl 1× PBS 洗涤微球两次。
- 通过流式细胞术分析单染对照和细胞14。
6. 匀浆肺组织以分离RNA
- 感染后，取少量肺组织（20–40 mg），置于RNA稳定试剂中，4 °C 过夜保存。随后于 -80 °C 保存，直至进行下一步操作。
- 用预冷的1× PBS清洗肺组织，以去除RNA稳定试剂。
- 将组织放入含有裂解缓冲液（1 ml 裂解缓冲液 + 10 µl β-巯基乙醇）的1.5 ml离心管中。
- 使用尖头剪刀将组织剪成小块，并使用无绳电动研磨杵匀浆20–40秒。
- 将裂解液置于冰上孵育5分钟，然后进行步骤7.1。
7. 从肺组织中分离RNA
- 将裂解液在18,000 × g离心3分钟。用移液器吸除上清液，并小心转移至新的1.5 ml离心管中。
- 向裂解液中加入1体积的70%乙醇。立即用移液器混匀，静置2–4分钟。
- 将最多700 µl裂解液转移至置于2 ml收集管中的离心柱中。
- 在9,600 × g离心15秒，弃去穿流液。
- 向离心柱中加入350 µl严格洗涤缓冲液，在9,600 × g离心15秒。弃去穿流液。
- 直接向离心柱膜上加入80 µl DNase I，在室温下孵育15分钟。
- 向离心柱中加入350 µl严格洗涤缓冲液，在9,600 × g离心15秒。弃去穿流液。
- 加入500 µl RNA洗涤缓冲液，在9,600 × g离心15秒。弃去穿流液。
- 加入500 µl RNA洗涤缓冲液，在9,600 × g离心2分钟。弃去穿流液。
- 将离心柱放入新的2 ml收集管中，在9,600 × g离心1分钟。弃去穿流液。
- 直接向离心柱中加入30–50 µl无RNase水，在9,600 × g离心1分钟。将RNA储存于-80 °C。
- 进行RNA测序分析14。
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结果
与生理盐水处理相比，气管内滴注导致支气管肺泡灌洗液（BALF）中白细胞数量显著增加（图1A，左图）。白细胞分类计数分析明确显示中性粒细胞浸润增加（图1，右图）。对BALF中细胞进行的流式细胞术（FACS）分析进一步证实了中性粒细胞数量的升高（图1B）。肺组织H&E染色切片的组织学分析也显示出气道炎症增强（图1C）。这些结果共同表明，气管内滴注可在小鼠中诱导气道炎症。为了验证该方法在研究调控气道病变信号通路中的应用价值，我们采用了E3泛素连接酶Itch基因缺陷的小鼠。已知Itch参与调控炎症信号通路15。我们以年龄和性别匹配的野生型C57BL/6小鼠和Itch-/-小鼠为对象，接种NTHi。随后从对照组野生型和Itch-/-小鼠的肺组织中提取RNA，并进行全转录组测序，以鉴定差异表达的炎症相关基因。如图2所示，Itch缺陷导致多个基因的表达发生差异。这表明气管内滴注可用于研究肺...
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讨论
本文介绍了一种独特且微创的方法，用于将细菌性肺部病原体接种至小鼠肺部。我们证明，该方法可用于研究炎症信号通路相关基因缺陷小鼠中不同基因的功能。该方法也可用于研究病毒性和真菌性肺部感染所引发的炎症反应。与鼻内滴注或气溶胶吸入等其他方法相比，该方法具有以下优势：（1）病原接种物可直接注入下呼吸道；（2）能够精确控制接种量；（3）降低操作人员接触细菌的风险。
通过外科手术暴露气管以接种细菌是至关重要的一步，操作时必须小心避免损伤周围组织，尤其是血管。
将细菌接种至气管时应小心操作，以避免小鼠因窒息而死亡。建议缓慢释放接种物（约 50 µl），并在接种前后注入空气。接种后保持小鼠直立一段时间，随后使其侧卧，有助于加快恢复。该操作的主要缺点是由于需要手术，短时间内无法进行多次暴露。一个潜在问题是，若导管插入支气管过深，会导致支气管肺泡灌洗液（BALF）细胞计数降低。此问题可通过将导管略微上提来解决。
由于全球范围内气道炎症性疾病的发病率正在上升3,16，了解这...
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披露
作者无任何利益冲突需要披露。
致谢
感谢 Carson Harrod 博士对本文手稿的审阅。同时感谢曾明辉先生以及 Mahesh Kathania 博士和 Prashant Khare 博士所做出的贡献。本研究工作得到了美国癌症协会（研究学者资助，122713-RSG-12-260-01-LIB）和萨姆斯癌症中心（试点项目资助）向 K. Venuprasad 提供的资助。
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材料
| 姓名 | 公司 | 目录编号 | 评论 |
|---|---|---|---|
| 巧克力琼脂平板 | Fisher Scientific | CAS50-99-7 | |
| 无水葡萄糖 | Thermo Scientific | R01300 | |
| 肝素 | Hospira, Inc | RL-3010 | |
| Deft 快速溶液 | Sigma | GS500-500ML | |
| 注射器针头 20/26G | BD | (REF305115/175) | |
| 1 ml 注射器 | BD | REF 309602 | |
| 导管 20GA | BD | REF 381433 | |
| 解剖剪刀，直型，10 cm 长 | kentscientific | INS600393 | |
| 虹膜镊，带齿，10 cm 长 | kentscientific | INS650915 | |
| 镊子 #5，不锈钢，11 cm 长 | kentscientific | INS600095 | |
| 10% 福尔马林 | Fisher Scientific | CAS 67-56-1 | |
| 琼脂糖 | peqlab | 35-1020 | |
| 5 ml 聚苯乙烯圆底管 | BD | REF 352058 | |
| 1.5 ml 微量离心管 | Light Labs | A-7001-R | |
| Reasy Mini 试剂盒 | Qiagen | 74104 | |
| 电动研磨杵（组织匀浆器） | Sigma | Z359971-1EA | |
| 96 孔 V 型底微孔板 | Thermo | 2605 | |
| 1X PBS | Gibco | 10010-023 | |
| OneComp eBeads | eBioscience | 01-1111-42 | |
| CD45.2-APC | eBioscience | 17-0454-81 | 工作稀释比例 1:100 |
| Ly-6G-eFluor 450 | eBioscience | 48-5931-82 | 工作稀释比例 1:100 |
| BSA | HyClone | SH30574.03 | |
| 红细胞裂解缓冲液 (10X) | Biolegend | 420301 | |
| 活/死细胞可固定蓝色死细胞染色试剂盒 | Invitrogen | L-34957 | |
| EDTA (0.5 M) | lifetechnologies | 15575-020 | |
| CD16/CD32 Fc阻断剂 | BD | 553142 | |
| FACS 管，聚苯乙烯圆底管 | BD | 352052 | |
| 甲醛 | Polyscience | 4018 |
参考文献
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