经气管给药 流感嗜血杆菌 在小鼠模型中研究气道炎症

摘要

我们演示了将Haemophilus influenzae接种至小鼠下呼吸道的气管内感染操作步骤。该方法是研究小鼠模型中调控气道炎症信号通路的一项非常有用的工具。

摘要

本文介绍了一种高效且直接将流感嗜血杆菌（Haemophilus influenzae）递送至小鼠下呼吸道的详细操作流程。我们展示了制备流感嗜血杆菌（H. influenzae）接种物、将流感嗜血杆菌（H. influenzae）经气管注入肺部、收集支气管肺泡灌洗液（BALF）、分析BALF中免疫细胞以及进行差异基因表达分析所需的RNA提取等步骤。该方法可用于研究肺部对任何细菌、病毒或真菌引发的炎症反应。相较于经鼻腔接种或气溶胶吸入法，直接气管注入法更为常用，因其能更高效地将细菌接种物递送至下呼吸道，且操作结果更明确可靠。

引言

炎症是机体抵御病原体的一种基本免疫防御机制。它可促进病原体的清除以及受损组织的修复，同时有助于恢复至正常的健康状态¹。然而，失控的炎症反应常导致慢性炎症性疾病²。气道炎症是多种肺部疾病（如慢性阻塞性肺疾病（COPD）、哮喘和肺纤维化）的初始诱发因素³。

非分型（无荚膜）流感嗜血杆菌（NTHi）与慢性上、下呼吸道炎症性疾病相关^4,5。它是从慢性阻塞性肺疾病儿童和成人下呼吸道分离出的主要菌种^4,6,7。NTHi感染后的炎症反应特征是促炎细胞因子（如TNF和IL-1β）表达上调，并通过Toll样受体（TLRs）介导，激活丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）和核因子-κB（NF-κB）通路⁸。

小鼠模型是分析肺部炎症性疾病潜在病理机制的非常有用的工具，因为存在多种基因缺陷品系。已有多种方法用于接种活菌/减毒细菌及细菌产物，包括经鼻滴注和气溶胶吸入^9,10。本文中，我们展示气管内滴注法。尽管该方法使用较少，但由于可将接种物直接递送至下呼吸道，因此效率更高且可重复性极强。

....

方案

所有实验均按照贝勒研究所机构动物照护与使用委员会（IACUC）的指南进行。

1. 培养非分型流感嗜血杆菌 流感嗜血杆菌 （流感嗜血杆菌）及接种物的制备

1. 将NTHi接种于巧克力琼脂平板上，倒置平板并置于湿润的CO₂培养箱中培养₂ 37 °C、5% CO₂ 培养箱中过夜培养₂次日，将细菌接种于脑心浸液肉汤中培养。然后，取1 ml肉汤加入无菌的1.5 ml离心管中。
2. 在室温下以 4,000 x g 离心 5 分钟。弃去上清液，将沉淀重悬于 1 ml 无菌 1x PBS 中。重复此步骤一次。
3. 将100 µl重悬液转移至900 µl的1x PBS中，在分光光度计中测定稀释菌液在600 nm波长处的吸光度。
4. 通过在巧克力琼脂平板上培养1:10系列稀释的接种物，并于37 °C、5% CO₂条件下过夜培养，测定接种物的活力及菌落形成单位（CFUs）。₂.
5. 根据上一步确定的活菌数和菌落形成单位（CFUs），将接种物调整至终浓度为 20 x 10⁶ CFU/ml

2. 气管内（i.t）灌注

1. 按每 10 克体重注射 0.1 ml 的剂量，向小鼠腹腔内（i.p.）注射 150 mg/ml 戊巴比妥钠....

结果

与生理盐水处理相比，气管内滴注导致支气管肺泡灌洗液（BALF）中白细胞数量显著增加（图1A，左图）。白细胞分类计数分析明确显示中性粒细胞浸润增加（图1，右图）。对BALF中细胞进行的流式细胞术（FACS）分析进一步证实了中性粒细胞数量的升高（图1B）。肺组织H&E染色切片的组织学分析也显示出气道炎症增强（图1C）。这些结果共同表明，气管内滴注可在小鼠中诱导气道炎症。为了验证该方法在研究调控气道病变信号通路中的应用价值，我们采用了E3泛素连接酶Itch基因缺陷的小鼠。已知Itch参与调控炎症信号通路¹⁵。我们以年龄和性别匹配的野生型C57BL/6小鼠和Itch-/-小鼠为对象，接种NTHi。随后从对照组野生型和Itch-/-小鼠的肺组织中提取RNA，并进行全转录组测序，以鉴定差异表达的炎症相关基因。如图2所示，Itch缺陷导致多个基因的表达发生差异。这表明气管内滴注可用于研究肺.......

讨论

本文介绍了一种独特且微创的方法，用于将细菌性肺部病原体接种至小鼠肺部。我们证明，该方法可用于研究炎症信号通路相关基因缺陷小鼠中不同基因的功能。该方法也可用于研究病毒性和真菌性肺部感染所引发的炎症反应。与鼻内滴注或气溶胶吸入等其他方法相比，该方法具有以下优势：（1）病原接种物可直接注入下呼吸道；（2）能够精确控制接种量；（3）降低操作人员接触细菌的风险。

通过外科手术暴露气管以接种细菌是至关重要的一步，操作时必须小心避免损伤周围组织，尤其是血管。

将细菌接种至气管时应小心操作，以避免小鼠因窒息而死亡。建议缓慢释放接种物（约 50 µl），并在接种前后注入空气。接种后保持小鼠直立一段时间，随后使其侧卧，有助于加快恢复。该操作的主要缺点是由于需要手术，短时间内无法进行多次暴露。一个潜在问题是，若导管插入支气管过深，会导致支气管肺泡灌洗液（BALF）细胞计数降低。此问题可通过将导管略微上提来解决。

由于全球范围内气道炎症性疾病的发病率正在上升^3,16，了解这.......

材料

本文使用的材料清单

姓名	公司	目录编号	评论
巧克力琼脂平板	Fisher Scientific	CAS50-99-7
无水葡萄糖	Thermo Scientific	R01300
肝素	Hospira, Inc	RL-3010
Deft 快速溶液	Sigma	GS500-500ML
注射器针头 20/26G	BD	(REF305115/175)
1 ml 注射器	BD	REF 309602
导管 20GA	BD	REF 381433
解剖剪刀，直型，10 cm 长	kentscientific	INS600393
虹膜镊，带齿，10 cm 长	kentscientific	INS650915
镊子 #5，不锈钢，11 cm 长	kentscientific	INS600095
10% 福尔马林	Fisher Scientific	CAS 67-56-1
琼脂糖	peqlab	35-1020
5 ml 聚苯乙烯圆底管	BD	REF 352058
1.5 ml 微量离心管	Light Labs	A-7001-R
Reasy Mini  试剂盒	Qiagen	74104
电动研磨杵（组织匀浆器）	Sigma	Z359971-1EA
96 孔 V 型底微孔板	Thermo	2605
1X PBS	Gibco	10010-023
OneComp eBeads	eBioscience	01-1111-42
CD45.2-APC	eBioscience	17-0454-81	工作稀释比例 1:100
Ly-6G-eFluor 450	eBioscience	48-5931-82	工作稀释比例 1:100
BSA	HyClone	SH30574.03
红细胞裂解缓冲液 (10X)	Biolegend	420301
活/死细胞可固定蓝色死细胞染色试剂盒	Invitrogen	L-34957
EDTA (0.5 M)	lifetechnologies	15575-020
CD16/CD32 Fc阻断剂	BD	553142
FACS 管，聚苯乙烯圆底管	BD	352052
甲醛	Polyscience	4018